Summary
يصف هذا البروتوكول العزلة والثقافة من الخلايا المعوية صغيرة الفئران مختلطة. وتمكن هذه الثقافات المعوية الأولية التحقيق في مسارات الإشارات الكامنة الأمعاء الببتيد إفراز باستخدام عدد من التقنيات.
Abstract
القناة الهضمية هو أكبر جهاز الغدد الصماء في الجسم، مع خلايا enteroendocrine إفراز هرمون تقع على طول ظهارة المعدة والأمعاء. وعلى الرغم من أهميتها الفسيولوجية، وخلايا enteroendocrine لا تمثل سوى جزء صغير من السكان الخلايا الظهارية وفي الماضي، قدمت توصيف لها تحديا كبيرا مما أدى إلى الاعتماد على نماذج خط الخلية. هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة للعزلة وثقافة الخلايا المعوية صغيرة الفئران مختلطة. وقد استخدمت هذه الثقافات الأساسية لتحديد مسارات الإشارات الكامنة وراء تحفيز وتثبيط إفراز الأمعاء الببتيد في استجابة لعدد من المواد الغذائية ونيوروببتيد وكذلك وكلاء الدوائية. وعلاوة على ذلك، جنبا إلى جنب مع استخدام المعدلة وراثيا الفئران مراسل فلوري، لقد أثبتنا أن هذه الثقافات الأولية تصبح أداة قوية لفحص خلايا enteroendocrine fluorescently الموسومة في فيمستوى tracellular، وذلك باستخدام أساليب مثل لقط التصحيح والكالسيوم وحيدة الخلية والتصوير معسكر الحنق.
Introduction
ويتمثل الهدف العام من هذا الأسلوب هو عزل وثقافة مختلطة الخلايا المعوية الفئران لتمكين دراسة إفراز الأمعاء الببتيد والتصوير خلية حية من خلايا enteroendocrine. وقد نشرت نسخة مبكرة من هذا الإجراء أصلا في عام 2008 من قبل رايمان وآخرون. 1 وشكلت منذ أساس 20 المنشورات مزيد من مجموعتنا. لهذا المخطوط، اخترنا التركيز على الثقافات الأمعاء الصغيرة لأنها أكثر تحديا لإقامة من الثقافات القولون.
خلايا Enteroendocrine تفرز مجموعة من الببتيدات القناة الهضمية بما في ذلك تشبه الجلوكاجون الببتيد 1 (GLP-1)، insulinotropic الببتيد (GIP) التي تعتمد على الجلوكوز، كوليسيستوكينين (CCK) وYY الببتيد (PYY) 2. هذه الببتيدات الأمعاء لها أدوار الفسيولوجية الهامة في تنسيق الاستجابات بعد الأكل مثل تباطؤ عبور القناة الهضمية، التقوية لحفز إفراز الأنسولين الجلوكوز وتحريض الشبع. GLP-1 محاكيات لالثانية العقاقير التي تحول دون تدهورها مرخصة حاليا لعلاج مرض السكري من النوع 2، وهناك تقييم مستمر من الإمكانات العلاجية لتحفيز إفراز الذاتية من هذا الببتيد 3. فهم أفضل لعلم وظائف الأعضاء enteroendocrine والآليات التي إفراز إما تحفيز أو تثبيط، لذلك، من الأهمية بمكان.
القناة الهضمية إفراز الببتيد يمكن دراستها باستخدام مجموعة متنوعة من في المختبر والمجراة سابقا نماذج تجريبية، ولكل منها مزايا وعيوب (لمراجعة شاملة مؤخرا أيضا تغطي استخدام في النماذج الحية نرى سفندسن وآخرون. 4). ويجري حاليا استخدام خارج الجسم الحي تقنيات مثل عزل الأمعاء 5 و غرفة أوسينج perfused ل6 لاستكشاف الأمعاء الببتيد إفراز ردا على المواد المختلفة. والميزة الرئيسية لهذه الأساليب، كمامقارنة الثقافات الأولية، هو أن البيئة المباشرة من الخلايا enteroendocrine لا يزال سليما إلى حد كبير، والأهم من ذلك، هو الحفاظ على الاستقطاب من الخلايا. لذلك، فمن الممكن الحصول على معلومات بشأن أي خلية سطح افراز يتصرف على 6. ومع ذلك، وهذه هي عادة تقنيات إنتاجية منخفضة وجودة البيانات المستمدة منها تعتمد اعتمادا كبيرا على سلامة وحيوية الأنسجة المعوية، التي تنخفض حتما مع مرور الوقت.
والآن يتزايد استخدام organoids الأمعاء كما هو الحال في المختبر نماذج لدراسة وظيفة الخلية enteroendocrine والتنمية 7. Organoids، والتي يمكن أن تستمد من كل من الفئران والأنسجة البشرية، لديها مصلحة تشكيل هياكل 3D "مثل سرداب" التي تحافظ على قطبية خلية في الثقافة. ومع ذلك، وخلايا enteroendocrine عضي المستمدة حتى الآن لم يتم تتميز بشكل كامل وتشابهها مع L سل الأصليليرة سورية لا تزال مجهولة إلى حد كبير. الثقافات الأولية لديها ميزة كونها خطوة أقرب إلى الإعداد الفسيولوجية، كما لا يتم الاحتفاظ خلايا enteroendocrine ومتباينة في ظروف اصطناعية لفترات طويلة من الزمن.
طريقة ثقافة الأساسي البديل الذي قد استخدمت لتقييم إفراز الأمعاء الببتيد هو عزل الخلايا المعوية الفئران الجنين (FRICs) 8. ومع ذلك، فقد التقى ثقافة الأنسجة المعوية الكبار مع أقل نجاحا، وقد لاحظ بعض الاختلافات في استجابة FRICs مقابل الكبار الخلايا المعوية الفئران (مثل الجلوكوز 8).
وقد جرت العادة على استخدام خطوط الخلايا مثل Enteroendocrine (على سبيل المثال GLUTag، STC-1 و NCI-H716) لتمييز مباشر مباراة. الآثار غير المباشرة على خلايا enteroendocrine ولتشريح الآليات الجزيئية الكامنة وراء اقتران حافزا لإفراز. رؤية Kuhre وآخرون 9 لإنتاج الببتيد وإفراز من خطوط الخلايا خلد "تشبه الخلايا L '. لقد كان هذا ضروريا خلايا enteroendocrine، المنتشرة على طول القناة الهضمية، تشكل أقل من 1٪ من الخلايا الظهارية في الأمعاء 10 والخلايا فرزها، في أيدينا، لا البقاء على قيد الحياة في الثقافة 1. لا تزال خطوط الخلايا أدوات مفيدة نظرا لحقيقة أنها هي خلية السكان متجانسة إلى حد كبير مما يفضي إلى التلاعب الجيني مثل الجينات إسكات. ونتيجة لذلك، فمن السهل للتحقيق في دور البروتينات التي لا يمكن استهداف دواء، عندما الفئران المعدلة وراثيا غير متوفرة. ومع ذلك، خطوط الخلايا ليست دائما نماذج صالحة من الخلايا الأولية. في حين أن هناك العديد من أوجه التشابه، والنتائج من الثقافات الأولية سلطت الضوء على مناسبة الاختلافات في مسارات إشارات تفعيلها من خلال بعض العناصر الغذائية في الخلايا L الأولية بالمقارنة مع خلايا GLUTag، على سبيل المثال (على سبيل المثال. peptones <الطبقة سوب = "XREF"> 11). الاهم من ذلك بالاشتراك مع المعدلة وراثيا الفئران مراسل فلوري، نموذج ثقافة الأساسي يتيح دراسة مفصلة للخلايا enteroendocrine الأساسي الفردية على مستوى الخلايا. وقد استخدمت خلايا L الموسومة Fluorescently داخل الثقافات الأولية من خلال مجموعتنا لتصحيح تحامل 1، 12 دراسة وحيدة الخلية الكالسيوم 11 و 13 و الأدينوزين الحلقي التصوير الأدينوزين-الحنق 14 دراسة، والتي أسفرت عن تقدم كبير في مجال enteroendocrine علم وظائف الأعضاء.
هو الأمثل لبروتوكول التالية لإجراء التجارب إفراز، وذلك باستخدام 24 لوحة جيدا أو لإعداد ما يصل إلى 16 أطباق التصوير، من الباب 10 سم من الأمعاء الدقيقة من ماوس الكبار واحد. بروتوكول يمكن تعديلها بسهولة لدراسة خلايا القولون عن طريق زيادة مرات الهضم وشاركتركيز llagenase.
Protocol
وقد وافق جميع الإجراءات الحيوانية من جامعة كامبريدج ورعاية الحيوان الأخلاقي مراجعة الهيئة ومطابقة للحيوانات (الإجراءات العلمية) لعام 1986 لوائح التعديل (SI 2012/3039).
1. إعداد مقدما
- وضع قسامة من مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) (~ 200 ميكرولتر) على الجليد في الذوبان.
ملاحظة: BMM يتصلب في درجة حرارة الغرفة (RT). - قبل دافئ 50 مل Dulbecco عقيمة عالية الجلوكوز في التعديل النسر متوسطة (DMEM) (بدون إضافات) و~ 40 مل الثقافة العقيمة المتوسطة (ارتفاع الجلوكوز DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 البنسلين U / مل و 0.1 ملغ / مل الستربتومايسين (P / S)، و 2 مم L-الجلوتامين) في 50 مل أنابيب الطرد المركزي في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
- قبل البرد الكالسيوم والمغنيسيوم التي تحتوي على الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- تزن من 15 ملغ كولاجيناز (XI الخام)، إضافة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل والحفاظ على الجليد.
مجموعة 2. الأنسجة
- إضافة ~ 20 مل L-15 متوسطة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل ووضعه على الجليد.
- الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم، أو غيرها من طريقة الزمني المعتمد 1.
يتم الحصول المعوية الأنسجة عادة من الفئران على خلفية C57BL6: ملاحظة. ومع ذلك، كما تم استخدام خلفيات وراثية أخرى مثل 129 / SvEv 15. تتطلب تجارب التصوير استخدام الفئران مراسل الفلورسنت مثل GLU فينوس 1. يتم الحصول عليها من أنسجة فئران بالغة (2-6 أشهر) من كلا الجنسين. ويعيش الفئران في individuaأقفاص مع libitum الإعلانية الحصول على المياه وطعام منتظمة LLY التهوية. ومع ذلك، والتجارب لاختبار تأثير اتباع نظام غذائي عالي الدهون، على سبيل المثال، على وظيفة الخلية enteroendocrine 16 لا يمكن أن يؤديها إذا كان معتمدا من قبل الترخيص للمشروع. - تشريح وإزالة بلطف الأمعاء الماوس (من البواب إلى بداية المستقيم) باستخدام ملقط ومقص تشريح. تخزينه في L-15 متوسطة على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
3. إعداد الأنسجة
- ضع الأنسجة المعوية في طبق بتري 10 سم تحتوي على ما يكفي PBS لتغطية الأنسجة. يستغرق 10 سم من النسيج المطلوب (على سبيل المثال الأمعاء الدقيقة العليا، أعلى 10 سم، والبعيدة إلى بوابة المعدة).
- طرد محتويات الأمعاء باستخدام البلاستيك ماصة باستير وبرود PBS.
- باستخدام ملقط، بدقة قبضة واحدة من نهاية الجزء الأمعاء ووضع غيض من ماصة باستير في ذلك. طرد محتويات مع المبردة PBS. كرر من كلا الطرفين حتى ماخوتم مسح rity محتويات بها. نقل إلى طبق بتري نظيفة تحتوي على برود برنامج تلفزيوني جديد.
- باستخدام ملقط، إزالة الأنسجة الدهنية ومساريق، مع الحرص على عدم سحب قبالة طبقة العضلات في نفس الوقت.
- قشر العضلة طبقة قبالة "مثل جورب" تحت المجهر تشريح باستخدام مجموعتين من ملقط غرامة.
ملاحظة: هذه الخطوة ليست ضرورية ولكن ينصح بشدة. هناك طرق بديلة لإزالة طبقة العضلات لواحد هو موضح هنا. على سبيل المثال، الأمعاء ويمكن خفض مفتوحة طوليا، أولا، قبل إزالة طبقة العضلات.- البحث عن نقطة انطلاق في نهاية المزيد القريبة من النسيج حيث يوجد رفرف المرئي من العضلات. سحب بلطف بعيدا كمية صغيرة من طبقة العضلات على طول الطريق حول الأمعاء.
ملاحظة: لتجنب تمزق في الطبقة العضلية أو ظهارة الأمعاء، والحد من قوة التوتر تحامل مساحة سطح أكبر بدلا من استخدام رآي بي إس من ملقط غرامة. - المشبك الأمعاء وأكبر قدر من رفرف العضلات وقت ممكن، وسحب بلطف بعيدا وبدء تقشير قبالة الطبقة العضلية من جميع أنحاء الأمعاء. لتجنب تمزيق كل من طبقة العضلات والبشرة، والحفاظ على إعادة تعديل وضع ملقط لإبقائها قريبة من بعضها البعض. وبهذه الطريقة، وإزالة الطبقة العضلية من طول الجزء الأمعاء وتجاهل.
- البحث عن نقطة انطلاق في نهاية المزيد القريبة من النسيج حيث يوجد رفرف المرئي من العضلات. سحب بلطف بعيدا كمية صغيرة من طبقة العضلات على طول الطريق حول الأمعاء.
- قطع الأمعاء مفتوحة طوليا وغسل يحوم في طبق بتري نظيفة مع PBS المبردة الطازجة. كرر إذا لزم الأمر لإزالة أي الكيموس المتبقية أو المخاط.
- نسيج اللحم المفروم مع شفرة المشرط الجراحي لتحقيق ساحات ~ 1-2 ملم 2 وإضافة هذه إلى ~ 20 مل فترت PBS في أنبوب الطرد المركزي 50 مل باستخدام ماصة باستور. لتجنب قطع الأنسجة التمسك ماصة، وقطع رأس والرطب ماصة من قبل الطحن مع برنامج تلفزيوني.
- يهز بلطف أنبوب لمواصلة غسل قطعة نسيج. السماح للأنسجة لتسوية وتصب أو صipette قبالة غالبية PBS وكرر مع برنامج تلفزيوني جديد حتى تبدو PBS واضح.
4. إعداد المغلفة BBM-اللوحة / أطباق والهضم المتوسطة
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية في نسيج الثقافة هود (مع الخطوات حضانة في 37 ° C حمام الماء).
- يعد حل BMM 2٪ في DMEM المبردة (بدون إضافات). أثناء العمل، والحفاظ على حل على الجليد. للحصول على حل 2٪، إضافة 140 ميكرولتر إذابة BMM إلى 7 مل DMEM (ما يكفي لإعداد واحدة 24 لوحة جيدا).
- إضافة 250 ميكرولتر 2٪ BMM حل لكل بئر (لوحة 24 أيضا) أو في الزجاج طبق التصوير السفلي.
- احتضان لوحات مغلفة / أطباق لمدة 30 دقيقة على الأقل في حاضنة عند 37 درجة مئوية للسماح للبلمرة كافية من BMM.
- إضافة DMEM استعد قبل 50 مل (بدون إضافات) إلى كولاجيناز 15 ملغ (من خطوات 1.2 و 1.4) لتشكيل 0.3 ملغ / مل حل وعكس إلى حل.
- علىم حله تماما، وذلك باستخدام 20 مل حقنة، تصفية حل كولاجيناز من خلال 0.2 ميكرون تصفية العقيمة في العقيمة 50 أنبوب جديد للطرد المركزي مل. تسمية هذه باعتبارها وسيلة عملية الهضم.
5. الأنسجة الهضم
- إزالة قطعة نسيج من PBS باستخدام 10 مل ماصة المصلية وإضافة إلى أنبوب معقم 50 مل الطرد المركزي التي تحتوي على DMEM معقمة المبردة (بدون إضافات)، دوامة ثم قم بإزالة DMEM.
ملاحظة: لتجنب الأنسجة التمسك ماصة المصلية، الرطب من قبل سحن مع DMEM قبل الاتصال مع الأنسجة. - "دايجست" 1 و 2: إزالة الحطام الخلية والخلايا واحد
- إضافة 7 مل الهضم المتوسطة إلى قطع الأنسجة وتعطي أنبوب دوامة.
- احتضان لمدة 5 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
- يهز بلطف (لا يدوم) أنبوب ل~ 3 ق.
- السماح للأنسجة لتسوية وتجاهل المتوسطة الهضم، المتحفظةحجم صغير للنظر في تحت المجهر.
ملاحظة: وخاصة عند البدء، فإنه ينصح بشدة لتفقد كمية صغيرة من كل "هضم" (~ 30 ميكرولتر) تحت المجهر لقياس التقدم المحرز في عملية الهضم. إذا لاحظت العديد من الخبايا في هذه المرحلة، قد يكون اهتزاز قوي جدا. للصور تمثيلية لما مراحل مختلف "هضم" تبدو عادة مثل، انظر الشكل 1. - كرر الخطوات 5.2.-5.2.4 (مع متوسط الهضم الطازج).
- "ملخصات" 3-5: جمع شظايا سرداب
- إضافة 7 مل الهضم المتوسط إلى الأنسجة.
- احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- أثناء الحضانة، ويهز كل 5 دقائق لمدة 10-12 ثانية.
ملاحظة: الهز هو أقوى من هز ل 'هضم' 1 و 2.
- أثناء الحضانة، ويهز كل 5 دقائق لمدة 10-12 ثانية.
- تسمح الأنسجة غير المهضومة ليستقر وجمع المتوسطة الهضم في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إذاالأنسجة التي يتم جمعها عن طريق الخطأ إلى جانب المتوسطة، والسماح لها لتسوية إزالته باستخدام ماصة المصلية 10 مل وتحويلها إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على أنسجة غير مهضوم.
- أجهزة الطرد المركزي التي تم جمعها متوسطة / طاف في RT لمدة 3 دقائق في 100 × ز.
- تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه خلية في 5 مستنبت استعد قبل مل من سحن لطيف وتوضع جانبا.
- تفقد كمية صغيرة من تعليق الخلية تحت المجهر (انظر الملاحظة من الخطوة 5.2.4).
ملاحظة: من الناحية المثالية، شظايا سرداب تبدأ في الظهور في "هضم" 3 جنبا إلى جنب مع الحطام الخلية والخلايا واحدة. يحتوي "ملخصات" 4 و 5 عددا أكبر بكثير من شظايا سرداب مع انخفاض الحطام الخلية (الشكل 1). ضبط اهتزاز كثافة عند الضرورة أي إذا كان النسيج لا هضم وشظايا سرداب لا تظهر، هزة بقوة أكبر. - وقد كرر الخطوات 5.3.1-5.3.6 حتى 5 "هضم"أنجزت أو حتى يتم هضم معظم الأنسجة (6 تشرين هضم قد تكون هناك حاجة).
- مرة واحدة كل supernatants من "هضم" 3-5 (أو 3-6) تم جمعها، الطرد المركزي هضم supernatants في RT لمدة 3 دقائق في 100 × ز.
- للتجارب إفراز، والجمع بين supernatants من "هضم" 3-5 (أو 3-6) قبل الطرد المركزي.
ملاحظة: هناك حاجة الأنسجة أقل للتجارب التصوير، وبالتالي اختيار طاف هضم هذا هو أنظف (غياب الحطام الخلية والخلايا واحدة) مع عدد أكبر من شظايا سرداب. هذا هو عادة "هضم" 4 أو 5. - تجاهل طاف وبلطف إعادة تعليق بيليه من قبل الطحن حتى عدم وجود كتل مرئية. إعادة تعليق بيليه في مستنبت قبل تحسنت تستكمل مع 10 ميكرومتر Y-27632 هيدروكلوريد (لمنع anoikis 17). استخدام 5 مل للتجارب إفراز و 2 مل مستنبت للتجارب التصوير.
- منقيتعليق الخلية من خلال مرشح 100 ميكرون (لإزالة أي نوع من الأنسجة غير المهضومة). تشغيل 2 مل مزيد من مستنبت قبل تحسنت من خلال تصفية لغسل (إجمالي حجم: 7 مل و 4 مل لإفراز والتصوير، على التوالي).
ملاحظة: ترشيح ليست ضرورية، ومع ذلك، شظايا الأنسجة أكبر لا تميل إلى التمسك لوحة / أطباق.
الشكل 1: صور الممثل "هضم" من طريقة ثقافة الأمعاء الصغيرة الأساسي. (A) مادة نموذجية من "هضم" 1 و 2 تحتوي على الخلايا وحيدة في المقام الأول والحطام الخلية. (B) مثال من المنتجات من "هضم" 3. السهام السوداء تشير إلى شظايا سرداب الظهور في المواد الهضم. (C) نموذجي من "هضم" 4 أو 5. لوحة (D) يمثل تجميع هضم المواد من"هضم" 3-5 مرت من خلال مرشح 100 ميكرون لإزالة أكبر شظايا الأنسجة غير المرغوب فيها ينظر في (C). وقد تم نقل كل الصور باستخدام المجهر المقلوب الرقمي مع الهدف 20X. الحانات النطاق = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
6. الثقافات تصفيح المعوية (المخصب لخلايا القبو)
- إزالة حل BMM الزائدة من لوحة أو الأطباق، وإضافة 250 ميكرولتر قبل تحسنت مستنبت في إفراز جيدا.
تركت التصوير الأطباق دون المتوسط حتى تنتقل إلى الخطوة التالية بسرعة لمنع طبق من الجفاف: ملاحظة. - لوحة 250 ميكرولتر تعليق خلية لكل بئر (لوحة 24 أيضا) أو في زجاج صحن القاع.
- لوحة قطرة من الحكمة في البطيء "التعرج" عبر البئر. السماح شظايا سرداب ليستقر ب ~ 5 دقائق قبل أن ينتقل لوحة إلى thالبريد الحاضنة.
ملاحظة: يجب أن نشجع حتى توزيع الأقبية / الخلايا داخل البئر.
- لوحة قطرة من الحكمة في البطيء "التعرج" عبر البئر. السماح شظايا سرداب ليستقر ب ~ 5 دقائق قبل أن ينتقل لوحة إلى thالبريد الحاضنة.
- احتضان لوحة أو أطباق ليلا 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
ملاحظة: A أحادي الطبقة "غير مكتمل" يجب أن يكون تشكيلها. للحصول على صورة تمثيلية للثقافات الثلاث التالية يغسل، انظر الشكل 2A. - "الفيضانات" أطباق التصوير مع 2 مل-استعد قبل مستنبت لكل طبق.
ملاحظة: هذه الأطباق تكون مناسبة للتصوير لمدة تصل إلى ~ 72 ساعة بعد الطلاء. الثقافات القولون عادة تستمر لفترة أطول، وتصل إلى 7 أيام. الخلايا التي لم تنضم يمكن إزالة خطوة غسل. الثقافات الأولية هي الآن جاهزة لاستخدامها في التجارب.
Representative Results
استخدام الخطوات الهضم التسلسلي يسمح جمع وإعداد نظيفة نسبيا من شظايا سرداب أن بالذهب لإجراء التجارب. على هضم الأولين إزالة الخلايا وحيدة في المقام الأول والحطام خلية من المواد هضم (الشكل 1A). أثناء هضم الثالث، تظهر شظايا سرداب في المواد هضمها (الشكل 1B). يساعد على هضم 4 و 5 العائد عدد أكبر من شظايا سرداب مع الخلايا واحد أقل (الشكل 1C). تصفية المواد المجمعة من هضم 3-5 يزيل أكبر قطعة من النسيج عسر الهضم، والتي قد تكون ضارة للثقافة، مما ينتج عنه إعداد سرداب جزء نظيف (1D الشكل).
وبعد 18-24 ساعة من الثقافة، ويلاحظ الطبقات الوحيدة من الخلايا المعوية صغيرة الابتدائية (الشكل 2A). باستخدام الثقافات ولدت من الفئران المعدلة وراثيا معربا عن تحديدا كالcium استشعار الفلورسنت، GCaMP3 تحت سيطرة المروج proglucagon 11، خلايا L يمكن تمييزها بسهولة ويتخلل داخل الثقافة (الشكل 2B). في الثقافات الأمعاء الصغيرة الأولية، مركبات تستهدف G ف -CA 2+ ط ط والمخيم التي تعتمد على مسارات حفز إفراز GLP-1 (لمنهجية التجربة إفراز ترى رايمان وآخرون 1). بومبيزين (BBS، و 100 نيوتن متر) وشارك في تطبيق forskolin و 3 إيسوبوتيل-1-الميثيل (IBMX) (F / I، 10 ميكرومتر لكل منهما) تسببت التحفيز 2- و 11 أضعاف، من GLP-1 نسبة إلى الإفراج القاعدية، على التوالي (الشكل 2C). معين التعبير خلية L من GCaMP3 يسمح تحديد ورصد في الوقت الحقيقي من تعبئة الكالسيوم في الخلايا L الفردية. كلا نانومتر بومبيزين 100 (BBS) و 30 ملي كلوريد البوتاسيوم (بوكل) حفز الزيادات العابرة في الكالسيوم داخل الخلايا تدل على ف G المعروف </ الفرعية> - ومسارات كهربي يقترن في الخلايا L الابتدائية (الشكل 2D).
الشكل 2: بيانات تمثيلية المستمدة من الثقافات الأمعاء الصغيرة الأولية. الصور مثال على الثقافات الصغيرة الابتدائية المختلطة المعوية تستخدم ل(A) إفراز و (B) تجارب التصوير وظيفة في 24 ساعة الطلاء. (A) الصورة مأخوذة من 24 لوحة جيدا، وذلك باستخدام المجهر المقلوب الرقمي مع الهدف 4X. شريط مقياس = 500 ميكرون. وقد تم تحديد (B) عن طريق GLU-لجنة المساواة العرقية س الفئران ROSA26 GCamP3، وخلايا L في مجال الرؤية (خلايا خضراء) من قبل مضان من GCaMP3. يمثل مقياس شريط 50 ميكرون. وقد تم قياس (C) GLP-1 إفراز ردا على بومبيزين (BBS، و 100 نيوتن متر) وforskolin / 3-إيسوبوتيل-1-الميثيل (IBMX) (F / I، 10 ميكرومتر لكل منهما). تم احتساب نسبة GLP-1 إفرازمن خلال قياس مستويات GLP-1 في supernatants ولست] الخلية. تمثل البيانات الوسائل ± SEM من ن = 3 لكل حالة. (D) مضان GCaMP3 (يعكس الكالسيوم عصاري خلوي) من خليتين المبينة في الفقرة (ب) رصد في الوقت الحقيقي ردا على كلوريد البوتاسيوم (بوكل، 30 ملم) وBBS (100 نيوتن متر). تم إجراء التصوير خلية واحدة باستخدام مجهر مضان مقلوب مع هدف النفط الغمر 40X. كان متحمس GCaMP3 في 475/10 نانومتر، وذلك باستخدام 75 W مصباح زينون قوس ومستوحد اللون التي تسيطر عليها برامج التصوير مضان. وسجلت الانبعاثات مع كاميرا عالية الدقة الرقمية جهاز اقتران الشحنة (CCD) باستخدام مرآة مزدوج اللون ومرشح عرض النطاق الترددي 510-560 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يصف هذا البروتوكول العزلة والثقافة من الخلايا المعوية صغيرة الفئران مختلطة لتمكين دراسة إفراز الأمعاء الببتيد والتصوير خلية واحدة من خلايا enteroendocrine المسمى.
لزيادة احتمال الثقافات الأمعاء الصغيرة أن تكون ناجحة، من المهم أن البروتوكول وتنفيذه في أسرع وقت ممكن (من الناحية المثالية، ضمن 3 ساعات من حصاد الأنسجة) وأن الأنسجة يتم الاحتفاظ في وسط الجليد الباردة أو المخزن المؤقت السابق في عملية الهضم، للحد من موت الخلايا. وفي حين أنه ليس من الضروري، وخاصة للثقافات القولون، وشجعت بقوة إزالة الطبقة العضلية من الأمعاء الدقيقة. وقد بروتوكول ثقافة المعوية صغيرة موحدة قدر الإمكان. ومع ذلك، فمن المهم الإشارة إلى أن أي عملية الهضم هي متطابقة. هناك العديد من الخطوات خلال هذا البروتوكول حيث يمكن إدخال التغير على أساس يوما بعد يوم مثل درجة إزالة العضلات، وحجم رانه المفروم "قطع الأنسجة، وقوة الهز، وقوة من دفعة معينة من كولاجيناز الخ. ومن ثم فهي ذات أهمية قصوى لتفقد aliquots من كل من يختلف "هضم" تحت المجهر لتقييم التقدم المحرز في عملية الهضم وخياط والهز وعدد من وفقا لذلك "هضم". فمن المستحسن أن يهز بلطف أكثر لتبدأ، وإذا شظايا سرداب ليست واضحة من "هضم" 3 فصاعدا، لبدء تهتز بقوة أكبر.
من تجربتنا، وخلايا enteroendocrine لا تتكاثر في الثقافة، وعادة ما فقدت من الثقافات الأمعاء الصغيرة في غضون 4 أيام. ومع ذلك، وهذا يسمح متسع من الوقت لإجراء تجارب الأمعاء الببتيد إفراز (تقوم عادة على مدى 2 ساعة، 18-24 ساعة بعد الطلاء) لاختبار محفزات الفسيولوجية و / أو وكلاء الدوائية. التجارب التي تتطلب الحضانة بين عشية وضحاها قبل التجربة إفراز أيضا على سبيل المثال ممكنافي حالة ما قبل المعالجة مع السعال الديكي السم 15.
تقنية ثقافة الأولية المقدمة هنا هي طريقة راسخة، كما يتضح من حجم الانتاج البحوث أنتجت على مر السنين. وقد استخدم نموذج ثقافة الأساسي لدراسة إفراز مجموعة متنوعة من الببتيدات الأمعاء، بما في ذلك GLP-1 1، GIP 18 و 19 PYY، ردا على المواد الغذائية المتنوعة وغير الغذائية 14 و 20 المحفزات والمثبطات. وعلاوة على ذلك، تم تطبيق نفس الأسلوب بنجاح إلى ثقافة الخلايا المعوية الإنسان 21. في كثير من الأحيان، وهو مزيج من طريقة زراعة الخلايا الأولية جنبا إلى جنب مع نموذج تجريبي إضافي على سبيل المثال. فيفو السابقين أو في الجسم الحي يمكن أن توفر معظم البصيرة 6. والجدير بالذكر وعلى النقيض من الأساليب الأخرى، وهذا الأسلوب له ايمتطبيقات portant خارج قياس الإفراج الأمعاء الببتيد. لقد أثبتنا أن الثقافات الأمعاء الصغيرة الأولية المستمدة من الفئران المعدلة وراثيا مراسل هي أدوات قوية لاستجواب مسارات الإشارات بين الخلايا إلى جانب أن القناة الهضمية إفراز الببتيد، وذلك باستخدام مثلا كا 2+ وأجهزة استشعار المخيم، GCaMP3 11 و 13 و 14 Epac2camps، على التوالي، فضلا عن تقنيات الكهربية 12.
كما هو الحال مع جميع النماذج في المختبر، والثقافات المعوية الأولية لديها بعض القيود المتأصلة بما في ذلك فقدان قطبية الخلايا الظهارية في الثقافة، فضلا عن فقدان إمدادات الدم والغدد العرقية. ومن الصعب تقدير الآثار المحتملة لهذه الظروف المصطنعة على وظيفة الخلية enteroendocrine. ومع ذلك، فإن البيانات التي تم الحصول عليها من ثقافات الأولية في كثير من الأحيان للترجمة في الجسم الحي في SETTIنانوغرام (مثل آثار الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة على GLP-1 إفراز 15).
ثقافات المعوية الأساسية هي تقنية متعددة مع العديد من التطبيقات المحتملة. وقدموا بالفعل رؤية الميكانيكية الهامة في تنظيم إفراز الأمعاء الببتيد.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
أجريت GLP-1 المناعية فحوصات من قبل مختبر الكيمياء الحيوية الأساسية الفحص في مستشفى أدينبروكس.
، على مر السنين، تم دعم هذا العمل من قبل ويلكوم ترست (حاليا منح النشطة 106262 / Z / 14 / Z و106263 / Z / 14 / Z) ومجلس البحوث الطبية (MRC) (منح MRC_MC_UU_12012 / 3 و MRC_MC_UU_12012 / 5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 mL, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/digestion |
| Centrifuge tubes, 50 mL, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 °C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 °C. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | - | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | - | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium) |
References
- Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. Glucose sensing in L cells: A primary cell study. Cell Metab. 8, 532-539 (2008).
- Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. Gut chemosensing mechanisms. J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).
- Lovshin, J. A., Drucker, D. J. Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).
- Brighton, C. A., et al. Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors. Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).
- Brubaker, P. L., Vranic, M. Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides. Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).
- Gerbe, F., et al. Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium. J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).
- Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells. Peptides. 77, 9-15 (2016).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).
- Emery, E. C., et al. Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1. Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).
- Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells. Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).
- Tolhurst, G., et al. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).
- Richards, P., et al. High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells. Peptides. 77, 21-27 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells. Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).
- Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans. Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).
- Moss, C. E., et al. Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents. Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).
- Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells. Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).
