Summary
Dit protocol beschrijft de isolatie en kweek van gemengde muis kleine darmcellen. Deze primaire kweken intestinale maken het onderzoek signaalroutes onderliggende darm peptidesecretie behulp van een aantal technieken.
Abstract
De darm is de grootste endocrien orgaan van het lichaam, met afscheidende entero-endocriene cellen die zich langs de lengte van het maag-epitheel. Ondanks hun fysiologisch belang, entero-endocriene cellen slechts een kleine fractie van de epitheliale celpopulatie en in het verleden hun karakterisatie aanzienlijke uitdaging resulteert in een afhankelijkheid cellijn modellen gepresenteerd. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de isolatie en de cultuur van gemengde muizen kleine darmcellen. Deze primaire kweken werden gebruikt om de signaalwegen onderliggende stimulatie en remming van darm peptidesecretie identificeren in responsie op een aantal voedingsstoffen en neuropeptiden als farmacologische middelen. Verder wordt in combinatie met het gebruik van transgene fluorescente reporter muizen, hebben we aangetoond dat deze primaire kweken een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van fluorescent-gemerkte entero-endocriene cellen bij het intracellular niveau, onder toepassing van werkwijzen zoals patchklemmen en eencellige calcium en cAMP-FRET beeldvorming.
Introduction
De algemene doelstelling van deze methode is om te isoleren en cultuur gemengde muizen darmcellen aan de studie van darm peptide secretie en live cell imaging van entero-endocriene cellen mogelijk te maken. Een vroege versie van deze procedure werd oorspronkelijk gepubliceerd in 2008 door Reimann et al. 1 en is sindsdien vormde de basis van een verdere 20 publicaties van onze groep. Voor dit manuscript, hebben we gekozen om zich te concentreren op de dunne darm culturen zoals ze zijn moeilijker vast te stellen dan colon culturen.
Entero-endocriene cellen scheiden een reeks darmpeptiden waaronder glucagon-achtig peptide 1 (GLP-1), glucose-afhankelijke insulinotrope peptide (GIP), cholecystokinine (CCK) en peptide YY (PYY) 2. Deze darmpeptiden hebben belangrijke fysiologische rol bij het orkestreren van de postprandiale respons zoals het vertragen van de darm doorvoer, versterking van glucose gestimuleerde insulineafgifte en inductie van verzadiging. GLP-1 mimetica and geneesmiddelen die de afbraak remmen momenteel goedgekeurd voor de behandeling van type 2 diabetes en er continue evaluatie van het therapeutisch potentieel van het stimuleren van de endogene secretie van dit peptide 3. Een beter begrip van entero-endocriene fysiologie en de mechanismen waarvan secretie ofwel gestimuleerd of geremd is dus van cruciaal belang.
Gut peptidesecretie kan worden onderzocht met verschillende in vitro en ex vivo experimentele modellen, elk met voor- en nadelen (voor een uitgebreide recente herziening ook betrekking tot het gebruik van in vivo modellen wordt Svendsen et al. 4). Ex vivo technieken zoals de geïsoleerde geperfuseerde darm 5 en 6 Ussingkamers worden momenteel gebruikt om gut peptidesecretie verkennen in reactie op verschillende stoffen. Het belangrijkste voordeel van deze methoden,vergeleken met primaire kweken, dat de directe omgeving van de entero-endocriene cellen blijft grotendeels intact en belangrijker, wordt de polariteit van de cellen behouden. Daarom is het mogelijk om informatie over welke celoppervlak een secretagogum handelt 6 wekken. Echter, deze zijn meestal low-throughput technieken en de kwaliteit van de gegevens die zijn afgeleid van hen is sterk afhankelijk van de integriteit en de levensvatbaarheid van het darmweefsel, wat onvermijdelijk verloop van tijd afnemen.
Intestinale organoids worden steeds meer gebruikt als in vitro modellen voor de studie van de entero- endocriene cel functie en ontwikkeling 7. Organoids, die kan worden afgeleid uit zowel muizen- als menselijke weefsels, hebben het voordeel van het vormen van 3D 'crypt-achtige' structuren die cel polariteit in kweek te handhaven. Echter, organoïde afgeleide entero-endocriene cellen nog niet volledig gekarakteriseerd en hun gelijkenis met natuurlijk L CELls blijft grotendeels onbekend. Primaire culturen hebben het voordeel dat dichterbij de fysiologische instelling waarbij entero-endocriene cellen niet worden onderhouden en gedifferentieerd kunstmatige omstandigheden gedurende lange tijdsperioden.
Een alternatieve primaire kweek methode die toegepast is voor de beoordeling van de darm peptidesecretie is de isolatie van foetale ratten darmcellen (FRICS) 8. Echter, de cultuur van volwassen darmweefsel heeft een ontmoeting gehad met minder succes en een aantal verschillen zijn waargenomen in het reactievermogen van FRICS vs. volwassen muizen darmcellen (bijvoorbeeld glucose 8).
Entero-achtige cellijnen (bijv GLUTag, STC-1 en NCI-H716) werden traditioneel gebruikt om onderscheid te maken tussen vs. indirecte effecten op entero-endocriene cellen en onderliggende moleculaire mechanismen koppelen stimulans secretie ontleden; Zie Kuhre et al 9 voor peptide productie en secretie van 'L celachtige' geïmmortaliseerde cellijnen. Dit is nodig omdat entero-endocriene cellen, verspreid langs het maagdarmkanaal geweest, vormen iets minder dan 1% van darmepitheelcellen 10 en gesorteerde cellen, in onze handen, niet overleven in cultuur 1. Cellijnen blijft nuttige instrumenten vanwege het feit dat ze een grotendeels homogene celpopulatie die bevorderlijk is voor genetische manipulaties zoals gen-silencing. Derhalve is het gemakkelijk om de rol van eiwitten die niet farmaceutisch kunnen worden gericht, terwijl transgene muizen zijn niet beschikbaar onderzoeken. Echter, cellijnen zijn niet altijd geldig modellen van primaire cellen. Hoewel er veel overeenkomsten, bevindingen uit primaire culturen soms verschillen aangetoond tussen de signaleringsroutes geactiveerd door bepaalde voedingsstoffen in primaire L-cellen ten opzichte van GLUTag cellen, bijvoorbeeld (bijv. Peptonen <sup class = "xref"> 11). Cruciaal in combinatie met fluorescerende reporter transgene muizen, de primaire kweek model kunnen uitvoeriger behandeling van afzonderlijke primaire entero- endocriene cellen in het intracellulaire niveau. Fluorescent gemerkte L-cellen in primaire kweken zijn gebruikt door onze groep patch klemmen 1, 12 studies en eencellige calcium 11, 13 en cyclisch adenosine monofosfaat-FRET beeldvorming 14 studies die aanzienlijke vooruitgang opgeleverd op het gebied van entero fysiologie.
Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor het uitvoeren secretie experimenten onder toepassing van een 24-wells plaat of voor de bereiding van maximaal 16 beeldvorming gerechten, van een 10 cm deel van de dunne darm van een volwassen muis. Het protocol kan eenvoudig worden aangepast voor de studie van colon cellen door het verhogen digestietijden en collagenase concentratie.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de Universiteit van Cambridge dierenwelzijn en ethische toetsingscommissie en gelijkvormigheid aan het Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Wijziging Regulations (SI 2012/3039).
1. Voorbereiding
- Plaats een portie van basaalmembraanmatrix (BMM) (-200 pl) op ijs te ontdooien.
OPMERKING: De BMM stolt bij kamertemperatuur (RT). - Voorverwarmen 50 ml steriel hoog glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) (zonder toevoegingen) en ~ 40 ml steriel kweekmedium (hoog-glucose DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 U / ml penicilline en 0,1 mg / ml streptomycine (P / S) en 2 mM L-glutamine) in 50 ml centrifugebuizen in een waterbad bij 37 ° C
- Pre-chill calcium- en magnesium-bevattende fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Weeg 15 mg collagenase (XI ruw), aan een 50 ml centrifugebuis en houdt het op ijs.
2. Tissue Collection
- Voeg -20 ml L-15 medium in een 50 ml centrifugebuis en plaats op ijs.
- Euthanaseren een muis door cervicale dislocatie of andere goedgekeurde schema 1 methode.
OPMERKING: Darmweefsel is veelal afkomstig van muizen op een C57BL6 achtergrond. Echter, andere genetische achtergronden ook gebruikt bv 129 / SvEv 15. Afbeeldexperimenten vereisen het gebruik van fluorescerende reporter muizen bijv GLU-Venus 1. Weefsel wordt verkregen van volwassen muizen (2-6 maanden) van beide geslachten. De muizen worden ondergebracht in individually geventileerde kooien met ad libitum toegang tot water en regelmatige chow. Echter, experimenten om het effect van een vetrijk dieet te testen, bijvoorbeeld op enteroendocrine celfunctie 16 kan worden uitgevoerd als dit wordt ondersteund door een project licentie. - Ontleden en verwijder voorzichtig muizendarm (van pylorus naar het begin van het rectum) met behulp van een tang en dissectie schaar. Bewaar het in L-15 medium op ijs tot gebruik.
3. Weefselbereiding
- Plaats darmweefsel in een 10 cm petrischaaltje met PBS genoeg om het weefsel te bedekken. Neem 10 cm gewenste weefsels (bijv bovenste dunne darm, top 10 cm distaal van pylorus).
- Spoelen darminhoud behulp van een plastic Pasteur pipet en gekoelde PBS.
- Behulp van een tang, delicaat grip ene uiteinde van de intestinale segment en plaats het uiteinde van een Pasteur pipet erin. Spoel inhoud met gekoelde PBS. Herhaal vanaf beide uiteinden totdat de majoteit van de inhoud werd gespoeld. Transfer naar een schone petrischaal met vers gekoeld PBS.
- Behulp van een tang, verwijder het vetweefsel en mesenterium, zorg om niet af te trekken van de spierlaag tegelijkertijd.
- Schil de spierlaag off "als een sok" onder een dissectie microscoop met twee sets van fijne pincet.
OPMERKING: Deze stap is niet noodzakelijk, maar wordt sterk aanbevolen. Er zijn andere manieren om het verwijderen van de spierlaag het hier beschreven. Bijvoorbeeld kan de darm worden opengesneden lengterichting eerst vóór het verwijderen van de spierlaag.- Een uitgangspunt bij het meer proximale uiteinde van het weefsel, wanneer er een zichtbare flap spier. Trek weg een kleine hoeveelheid spierlaag helemaal rond de darm.
Opmerking: Om scheuren van de spierlaag of darmepitheel voorkomen, verminderen de spankracht door klemmen een groter oppervlak in plaats van de tips van de fijne pincet. - Klem de darm en zoveel mogelijk van de spierlap mogelijk, trek uit elkaar en beginnen afpellen van de spierlaag van rond de darmen. Om te voorkomen dat het scheurt zowel de spierlaag en epitheel, houden bijstelling van de positie van de tang om ze dicht bij elkaar. Zo verwijdert de spierlaag van de gehele lengte van de intestinale segment en ontdoen.
- Een uitgangspunt bij het meer proximale uiteinde van het weefsel, wanneer er een zichtbare flap spier. Trek weg een kleine hoeveelheid spierlaag helemaal rond de darm.
- Snij de darm geopend lengterichting en wassen met de wervelende in een schone petrischaal met gekoelde verse PBS. Herhaal dit indien nodig om de resterende chyme of slijm te verwijderen.
- Gehakt weefsel met een chirurgisch scalpel vierkantjes van ~ 1-2 mm 2 bereiken en deze toe tot ~ 20 ml gekoelde PBS in een 50 ml centrifugebuis met behulp van een Pasteur pipet. Om weefselstukjes vasthouden aan de pipet te voorkomen, afgesneden van de tip en nat de pipet door tritureren met PBS.
- Schud de buis verder wassen stukken weefsel. Laat het weefsel bezinken en gieten of pipette van de meerderheid van de PBS en herhaal met verse PBS totdat de PBS duidelijk kijkt.
4. Bereiding van BBM-beklede plaat / Schotels en digestiemedium
OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd in een weefselkweek kap (met incubatiestappen bij 37 ° C waterbad).
- Bereid een 2% oplossing in gekoeld BMM DMEM (zonder toevoegingen). Tijdens het werken, houd de oplossing op ijs. Voor een 2% oplossing, voeg 140 ul ontdooid BMM 7 ml DMEM (genoeg om een 24-putjesplaat te maken).
- Voeg 250 ul 2% BMM oplossing per putje (plaat met 24 putjes) of per glazen bodem imaging schaal.
- Incubeer beklede platen / schotels voor ten minste 30 minuten in een incubator bij 37 ° C zodat er passende polymerisatie van de BMM.
- Voeg 50 ml voorverwarmde DMEM (zonder toevoegingen) naar 15 mg collagenase (volgens de stappen 1.2 en 1.4) van een 0,3 mg / ml te vormen en zwenken oplossen.
- Opce volledig opgelost, met behulp van een 20 ml spuit, filtreer de collagenase oplossing door een steriel 0,2 urn filter in een nieuwe steriele 50 ml centrifugebuis. Label deze als de vertering medium.
5. Tissue Spijsvertering
- Verwijder het weefsel stukken uit de PBS met een 10 mL serologische pipet en aan een steriele 50 ml centrifugebuis die gekoelde steriele DMEM (zonder toevoegingen), draai en verwijder DMEM.
Opmerking: Om weefsel vasthouden aan de serologische pipet voorkomen door nat wrijven met DMEM voorafgaand aan contact met het weefsel. - 'Digest 1 en 2: verwijdering van celafval en enkele cellen
- 7 ml digestiemedium aan het weefsel stukken en geven de buis een werveling.
- Incubeer gedurende 5 min in een waterbad bij 37 ° C.
- Schud (niet krul) de buis gedurende -3 s.
- Laat het weefsel bezinken en gooi de digestiemedium, reserveren van eenklein volume te kijken naar onder de microscoop.
OPMERKING: Vooral bij het starten, wordt sterk aanbevolen om een klein volume van elke 'digest' (~ 30 pi) onder de microscoop inspecteren om de voortgang van het verteringsproces meten. Als veel crypten worden waargenomen in dit stadium kan het schudden te hard zijn. Voor representatieve beelden van wat de verschillende 'digest' stadia typisch eruit, zie figuur 1. - Herhaal stap 5.2.-5.2.4 (met verse spijsvertering gemiddeld).
- 'Digests' 3-5: Collection of fragmenten crypt
- Voeg 7 ml spijsvertering medium aan het weefsel.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Tijdens de incubatie schud elke 5 min gedurende 10-12 s.
Opmerking: Het schudden is krachtiger dan schudden 'digest' 1 en 2.
- Tijdens de incubatie schud elke 5 min gedurende 10-12 s.
- Toestaan onverteerd weefsel bezinken en verzamel de vertering medium in een 15 ml centrifugebuis. Alsweefsel ongeluk verzameld samen met het medium, laat het bezinken, te verwijderen met behulp van een 10 ml serologische pipet en over te dragen naar de 50 ml centrifugebuis die onverteerd weefsel.
- Centrifuge verzamelde medium / supernatant bij kamertemperatuur gedurende 3 min bij 100 x g.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 ml voorverwarmd kweekmedium door voorzichtige trituratie en vernietiging.
- Inspecteert een klein volume van de celsuspensie onder de microscoop (zie toelichting uit stap 5.2.4).
LET OP: In het ideale geval crypte fragmenten beginnen te verschijnen in 'verteren' 3 samen met de cel puin en enkele cellen. 'Digests' 4 en 5 bevat een significant groter aantal crypt fragmenten met verminderde celresten (figuur 1). Passen schudden intensiteit noodzakelijk dat wil zeggen als het weefsel niet verteert en crypte fragmenten worden niet weergegeven, schud krachtiger. - Herhaal stap 5.3.1-5.3.6 tot 5 'verteert' zijn geweestvoltooid of totdat het merendeel van het weefsel werd gedigesteerd (a 6e digest kan nodig zijn).
- Zodra alle supernatanten van 'digesties' 3-5 (of 3-6) zijn verzameld, gecentrifugeerd verteren bovenstaande vloeistoffen bij kamertemperatuur gedurende 3 min bij 100 x g.
- Uitscheiding experimenten, combineren de supernatanten van 'digesties' 3-5 (of 3-6) voorafgaand aan centrifugatie.
OPMERKING: minder weefsel nodig voor afbeeldexperimenten Daarom kan voor de samenvatting supernatant die de schoonste (afwezigheid van celafval en enkele cellen) met het grotere aantal crypte fragmenten. Dit is typisch 'digest' 4 of 5. - Verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de pellet door tritureren totdat er geen klonten zichtbaar. Resuspendeer de pellet in voorverwarmde kweekmedium aangevuld met 10 pM Y-27632 dihydrochloride (te anoikis 17 te voorkomen). Met 5 ml secretie experimenten en 2 ml kweekmedium voor afbeeldexperimenten.
- Filtercelsuspensie door een 100-um filter (één onverteerd weefsel te verwijderen). Voer een verdere 2 ml voorverwarmd kweekmedium door het filter (totaal volume: 7 ml en 4 ml uitscheiding en imaging, respectievelijk) wassen.
OPMERKING: filteren is echter niet essentieel, grotere weefselfragmenten neiging niet te hechten aan de plaat / borden.
Figuur 1: Representatieve beelden van 'verteert' uit primaire dunne darm kweekmethode. (A) Origineel materiaal van 'digesties' 1 en 2 die in hoofdzaak enkele cellen en celresten. (B) Een voorbeeld van uit "digest 3. De zwarte pijlen geven crypt fragmenten die in het verteren materiaal. (C) Typerend 'digest' 4 of 5 Deelfiguur (D) voorstelt samengevoegd verwerken materiaal'digesten' 3-5 door een 100 urn filter om de ongewenste grotere weefselfragmenten zien in (C) te verwijderen. Alle foto's zijn genomen met een digitale omgekeerde microscoop met een 20X objectief. Schaalbalken = 100 urn. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
6. Plating Intestinale Cultures (verrijkt voor cryptcellen)
- Overtollige BMM oplossing uit plaat of schotels en voeg 250 ul voorverwarmde kweekmedium per secretie goed.
LET OP: In beeld brengen van gerechten worden achtergelaten zonder medium kunt u doorgaan naar de volgende stap te snel om te voorkomen dat het gerecht uitdroogt. - Plaat 250 ul celsuspensie per putje (plaat met 24 putjes) of per glazen onderste schaal.
- Plate druppelsgewijs in een langzame 'zig-zag' beweging over de put. Toestaan crypte fragmenten nemen met ~ 5 minuten alvorens de plaat aan The incubator.
NB: Dit moet een gelijkmatige verdeling van crypten / cellen in de put aan te moedigen.
- Plate druppelsgewijs in een langzame 'zig-zag' beweging over de put. Toestaan crypte fragmenten nemen met ~ 5 minuten alvorens de plaat aan The incubator.
- Incubeer plaat of schotels een nacht bij 37 ° C en 5% CO2.
OPMERKING: Een 'fragmentarisch' monolaag zou hebben gevormd. Een representatief beeld van kweken na driemaal wassen, zie figuur 2A. - 'Flood' imaging gerechten met 2 mL pre-verwarmd kweekmedium per schaal.
LET OP: Deze gerechten zal geschikt zijn voor beeldvorming voor maximaal ~ 72 uur na plating. Colon culturen duren meestal langer, tot 7 dagen. Cellen die niet gehecht kan worden verwijderd door een wasstap. Primaire culturen nu worden gebruikt voor experimenten.
Representative Results
Het gebruik van seriële digestiestappen maakt het verzamelen van een relatief zuiver preparaat van crypte fragmenten te plateren voor experimenten. De eerste twee digesties verwijderen hoofdzakelijk enkelvoudige cellen en celresten uit het verteren materiaal (Figuur 1A). Tijdens de derde digest, crypt fragmenten worden in het gedigereerde materiaal (Figuur 1B). Verteert 4 en 5 een opbrengst groter aantal crypt fragmenten met minder enkelvoudige cellen (Figuur 1C). Filteren van het gepoolde materiaal digesties 3-5 verwijdert grote stukken onverteerd weefsel, die schadelijk zijn voor de kweek kan worden, waardoor een schone crypte fragment bereiding (figuur 1D).
Na 18-24 uur kweek worden monolagen van primaire dunne darm cellen waargenomen (Figuur 2A). Gebruik culturen gegenereerd uit transgene muizen die het specifiek calCium fluorescentie sensor GCaMP3, onder controle van de promoter proglucagon 11, L cellen omlijnd en verspreid in de kweek (figuur 2B). In primaire kweken dunne darm, verbindingen gericht de Gq-Ca 2+ i en i cAMP afhankelijke paden stimuleerde de secretie van GLP-1 (uitscheiding experiment methode zien Reimann et al. 1). Bombesine (BBS, 100 nM) en gezamenlijk aanbrengen van forskoline en 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (F / I, 10 pM elk) veroorzaakt een 2- en 11-voudige stimulatie van GLP-1 afgifte ten opzichte basale respectievelijk (Figuur 2C). Specifieke L celexpressie van GCaMP3 maakt de identificatie van en de real-time monitoring van calcium mobilisatie in individuele L-cellen. Beide 100 nM bombesine (BBS) en 30 mM kaliumchloride (KCl) gestimuleerde tijdelijke stijgingen van intracellulair calcium indicatief is voor de bekende Gq </ sub> - en elektrogeen-gekoppelde trajecten in primaire L-cellen (Figuur 2D).
Figuur 2: Representatieve gegevens afkomstig van primaire kweken dunne darm. Voorbeeld afbeeldingen gemengde primaire dunne darm kweken gebruikt voor (A) secretie en (B) afbeeldexperimenten onderbrengen 24 uur plating. (A) Beeld uit een 24-putjesplaat, met een digitale omgekeerde microscoop met een 4x objectief. Schaal bar = 500 urn. (B) Met GLU-Cre x ROSA26 GCamP3 muizen L cellen in het gezichtsveld (groene cellen) geïdentificeerd door de fluorescentie van GCaMP3. Schaalbalk staat voor 50 urn. (C) GLP-1 uitscheiding werd gemeten als reactie op bombesine (BBS, 100 nM) en forskoline / 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) (F / I, 10 pM elk). Percentage GLP-1 uitscheiding berekenddoor het meten van GLP-1 niveaus in de supernatanten en cellysaten. De gegevens stellen de gemiddelden ± SEM van n = 3 voor elke omstandigheid. (D) GCaMP3 fluorescentie (reflecterend cytosolische calcium) van de twee cellen beschreven in (B) volgde onmiddellijk plaats in reactie op kaliumchloride (KCl, 30 mM) en BBS (100 nM). Single cell imaging werd uitgevoerd met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met een 40X olie-immersie objectief. GCaMP3 werd geëxciteerd bij 475/10 nm, onder toepassing van een 75 W xenon booglamp en een monochromator gecontroleerd door fluorescentie beeldverwerkingssoftware. Emissie werd opgenomen met een hoge-resolutie digitale ladingsgekoppelde inrichting (CCD) camera met een dichroïsche spiegel en een 510-560 nm bandbreedtefilter. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Dit protocol beschrijft de isolatie en kweek van gemengde muis kleine darmcellen de studie van darm peptidesecretie en single cell imaging gemerkte entero-endocriene cellen mogelijk.
Om de waarschijnlijkheid van de dunne darm kweken slagen vergroten, is het belangrijk dat het protocol zo snel mogelijk (bij voorkeur binnen 3 uur van het oogsten van het weefsel) wordt uitgevoerd en dat het weefsel in ijskoud medium gehouden of buffer voorafgaand aan het verteringsproces, om celdood te beperken. Hoewel het niet essentieel is, vooral voor colon culturen, is het verwijderen van de spierlaag van de dunne darm sterk aangemoedigd. De dunne darm cultuurprotocol gestandaardiseerd zoveel mogelijk. Het is echter belangrijk op te merken dat er geen verteringsproces is identiek. Er zijn veel stappen in dit protocol, waar variabiliteit op een dag-tot-dag basis kan worden ingevoerd bijvoorbeeld de mate van de spier te verwijderen, de grootte van thij gehakt 'weefselstukjes de sterkte schudden, de potentie van een bepaalde partij collagenase enz. Het is daarom van het grootste belang hoeveelheden van elk van de verschillende "digesten inspecteren onder de microscoop om de voortgang van het verteringsproces maat en de ratel en het aantal 'digest' dienovereenkomstig beoordelen. Het wordt aanbevolen om meer schud om te beginnen en zo de crypte fragmenten niet duidelijk uit 'digest' 3 verder te gaan trillen krachtiger.
Vanuit onze ervaring, entero-endocriene cellen niet vermenigvuldigen in cultuur en zijn meestal verloren van de dunne darm culturen binnen 4 dagen. Toch is dit laat voldoende tijd om gut peptidesecretie experimenten fysiologische prikkels en / of farmacologische middelen te testen (gewoonlijk over 2 uur, 18-24 uur na plateren uitgevoerd). Experimenten die een incubatie overnacht vóór de afscheiding experiment zijn ook mogelijk bvbij voorbehandeling met pertussis toxine 15.
De primaire kweek techniek hier wordt gepresenteerd is een bekende methode, zoals blijkt uit de omvang van de onderzoeksoutput het heeft door de jaren heen geproduceerd. De primaire kweek model werd gebruikt om de uitscheiding van een verscheidenheid aan darmpeptiden, waaronder GLP-1 1, GIP 18 en 19 PYY bestuderen in reactie op diverse nutriënten en non-nutriënten 14, 20 prikkels en remmers. Verder dezelfde techniek is met succes toegepast voor de kweek van humane darmcellen 21. Vaak is een combinatie van de primaire celkweek werkwijze tezamen met een aanvullend experimenteel model bv. ex vivo of in vivo kan de meest inzicht 6 te bieden. Met name en in tegenstelling tot andere methoden, deze techniek heeft important toepassingen buiten het meten van darm neuropeptidevrijgave. We hebben aangetoond dat primaire dunne darm kweken afgeleid van transgene reportermuizen krachtige instrumenten voor het ondervragen van intracellulaire signaleringsroutes gekoppeld met peptidesecretie gut, waarbij bijvoorbeeld Ca2 + en cAMP sensors, GCaMP3 11, 13 en Epac2camps 14 respectievelijk en elektrofysiologische technieken 12.
Zoals bij alle in vitro modellen, de primaire kweken intestinale hebben bepaalde inherente beperkingen waaronder het verlies van polariteit van de epitheliale cellen in kweek, en het verlies van toevoer en innervatie bloed. Het is moeilijk om de mogelijke gevolgen van deze kunstmatige omstandigheden te schatten op enteroendocrine celfunctie. Echter, gegevens verkregen uit primaire culturen vaak transleerbaar in de in vivo setti geweestng (zoals de invloed van korte-keten vetzuren op GLP-1 uitscheiding 15).
De primaire intestinale culturen zijn een veelzijdige techniek met vele mogelijke toepassingen. Zij hebben reeds belangrijk mechanistisch inzicht in de regulering van de darm peptide secretie.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
GLP-1 immuno-assays werden uitgevoerd door de Core Biochemical Assay Laboratory in Addenbrooke's Hospital.
Dit werk heeft in de loop der jaren, ondersteund door de Wellcome Trust (momenteel actief subsidies 106262 / Z / 14 / Z en 106263 / Z / 14 / Z) en de Medical Research Council (MRC) (subsidies MRC_MC_UU_12012 / 3 en MRC_MC_UU_12012 / 5).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 mL, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/digestion |
| Centrifuge tubes, 50 mL, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 °C). For making up digestion medium, pre-warm to 37 °C. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | - | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | - | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40X oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 mL, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | - | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1,000 in final culture medium) |
References
- Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. Glucose sensing in L cells: A primary cell study. Cell Metab. 8, 532-539 (2008).
- Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. Gut chemosensing mechanisms. J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).
- Lovshin, J. A., Drucker, D. J. Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).
- Brighton, C. A., et al. Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors. Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).
- Brubaker, P. L., Vranic, M. Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides. Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).
- Gerbe, F., et al. Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium. J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).
- Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells. Peptides. 77, 9-15 (2016).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).
- Emery, E. C., et al. Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1. Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).
- Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells. Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).
- Tolhurst, G., et al. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).
- Richards, P., et al. High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells. Peptides. 77, 21-27 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells. Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).
- Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans. Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).
- Moss, C. E., et al. Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents. Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).
- Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells. Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).
