Transferencia de la capacidad de formación de glándulas mamarias entre las células epiteliales basales mamarias y las células lumminales mamarias mediante vesículas extracelulares / exosomas

Summary

Este protocolo describe métodos para purificar, cuantificar y caracterizar vesículas extracelulares (EVs) / exosomas de células epiteliales mamarias no adherentes / mesenquimales y para usarlas para transferir la capacidad de formación de glándulas mamarias a células epiteliales mamarias luminales. Los EVs / exosomas derivados de células epiteliales mamarias de tipo tallo pueden transferir esta propiedad celular a células que ingieren los EVs / exosomas.

Abstract

Las células pueden comunicarse a través de exosomas, ~ 100-nm vesículas extracelulares (VE) que contienen proteínas, lípidos y ácidos nucleicos. Las vesículas extracelulares derivadas de células epiteliales mamarias no adherentes / mesenquimales (NAMEC) pueden aislarse a partir del medio NAMEC mediante ultracentrifugación diferencial. Basándose en su densidad, los VE pueden purificarse mediante ultracentrifugación a 110.000 x g. La preparación EV de la ultracentrifugación puede separarse adicionalmente usando un gradiente de densidad continuo para evitar la contaminación con proteínas solubles. Los EV purificados pueden entonces ser evaluados adicionalmente usando un análisis de seguimiento de nanopartículas, que mide el tamaño y el número de vesículas en la preparación. Las vesículas extracelulares con un tamaño comprendido entre 50 y 150 nm son exosomas. Los EVs / exosomas derivados de NAMEC pueden ser ingeridos por células epiteliales mamarias, que pueden medirse mediante citometría de flujo y microscopía confocal. Algunas propiedades de las células madre mamarias ( por ejemplo, la capacidad de formación de glándulas mamarias) puedenSe transfiere desde el tallo-como NAMECs a las células epiteliales mamarias a través de la NAMEC derivados EVs / exosomes. Las células epiteliales mamarias primarias aisladas EpCAM ^hi / CD49f no pueden formar glándulas mamarias después de ser trasplantadas en almohadillas de grasa de ratón, mientras que las células epiteliales mamarias basales EpCAM ^lo / CD49f ^hi forman glándulas mamarias después del trasplante. La captación de EVs / exosomas derivados de NAMEC por EpCAM ^hi / CD49f para células epiteliales mamarias luminales les permite generar glándulas mamarias después de ser trasplantadas en almohadillas de grasa. Los EVs / exosomas derivados de las células epiteliales mamarias de tipo madre transmiten la capacidad de formación de glándulas mamarias a EpCAM ^hi / CD49f para las células epiteliales mamarias luminales.

Introduction

Los exosomas pueden mediar en la comunicación celular mediante la transferencia de membrana y proteínas citosólicas, lípidos y ARN entre las células ¹ . Se ha demostrado que la comunicación mediada por exosomas está implicada en muchos procesos fisiológicos y patológicos ( es decir, presentación de antígenos, desarrollo de tolerancia ² y progresión tumoral ³ ). Los exosomas a menudo tienen contenidos similares a los de las células de origen que los liberan. Por lo tanto, los exosomas pueden llevar a las propiedades celulares específicas de las células de origen y la transferencia de esta....

Protocol

Todas las investigaciones relacionadas con animales cumplieron con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales.

1. Aislamiento y validación de vesículas / exosomas extracelulares

1. Cultivo de células basales epiteliales mamarias, NAMECs ⁴ , con medio libre de suero libre de 500 mL de MCDB 170, pH 7,4 + 500 mL de DMEM / F12 con bicarbonato sódico (0,2438%); EGF (5 ng / ml); Hidrocoritisona (0,5 mu g / ml); Insulina (5 mu g / ml); Extracto de pituitaria bovina (BPE; 35 μg / ml); Y GW627368X (1 μg / ml) en platos de 15 cm.
2. Después de contar las células con un hemoci....

Results

Debido a que se ha demostrado que el bloqueo de la señalización PGE2 / EP4 desencadena la liberación de EV / exosoma a partir de células madre mamarias basales ⁴ , este trabajo presenta un método para aislar los EVs / exosomas inducidos del cultivo de células basales epiteliales mamarias (NAMEC). Dado que NAMECs se cultivan en suero libre de medio, no hay pre-existentes EVs / exosomas derivados de suero [ ^13] . Para las células cultivadas e.......

Discussion

Los exosomas a menudo llevan características de las células que las liberaron, y la cantidad de exosomas liberados puede ser inducida por los estímulos [ ^4] . El medio de cultivo de células puede ser recogido y sometido a ultracentrifugación diferencial para EV / exosome colección ( Figura 1 ]. Actualmente no existe un acuerdo general sobre un método ideal para aislar EVs / exosomas. El método óptimo utilizado aquí ha sido determinado por la aplicación descendente

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCDB 170	USBiológico	M2162
DMEM/F12
Optima L-100K	Rotor Beckman	393253
SW28 Ti Rotor	Beckman	342204
SW41 Rotor	Beckman	331306
NANOSIGHT LM10	Malvern	NANOSIGHT LM10	para análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
Optiprep	Sigma-Aldrich	D1556	Solución al 60% (p/v) de iodixanol en agua (estéril).
Anticuerpo CD81	GeneTex	GTX101766	1:1.000 en 5% p/v de leche en polvo descremada, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 & deg; C, durante la noche
Anticuerpo CD9	GeneTex	GTX100912	1:1.000 en leche en polvo descremada al 5% p/v, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 & deg; C, durante la noche
Anticuerpo CD63	Abcam	Ab59479	1:1.000 en 5% p/v de leche en polvo descremada, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 ° C, durante la noche
Anticuerpo TSG101	GeneTex	GTX118736	1:1.000 en leche en polvo descremada al 5% p/v, 1x TBS, 0,1% Tween 20 a 4 & deg; C, durante la noche
GAPDH	GeneTex	GTX100118	1:6,000 en 5% p/v de leche en polvo descremada, 1x TBS, 0.1% Tween 20 a 4 & deg; C, durante la noche
CFSE (carboxifluoresceína succinimidil diacetato éster)	Thermo	V12883
FACSCalibur	BD Biosciences	analizador de
colagenasa Tipo IV	Thermo	17104019
tripsina	Thermo 27250018
ITS	Sigma-Aldrich	I3146	una mezcla de insulina humana recombinante, transferrina humana y selenito de sodio
accutasa	ebioscience	00-4555-56	una mezcla de enzimas naturales con actividad enzimática proteolítica y colagenolítica
dispasa	STEMCELL	7913	5 mg/mL = 5 U/mL
anticuerpo anti-CD49f	Biolegend	313611	1:50
anticuerpo anti-EpCAM	Biolegend	118213	1:200
FACSAria	BD Biosciences clasificador	de
			regalos del Dr. Robert Weinberg
permount	Thermo Fisher Scientific	SP15-500
bicarbonato de sodio	Zymeset	BSB101
EGF	Peprotech	AF-100-015
Hidrocoritisona	Sigma-Aldrich	SI-H0888
Insulina	Sigma-Aldrich	SI-I9278
BPE (extracto de hipófisis bovina)	Hammod Cell Tech	1078-NZ
GW627368X	Plato de	Cayman 10009162
15 cm	Falcon
centrífuga de sobremesa	Eppendrof	Centrífuga 3415R
tubo ultracentrífugo	Beckman 344058
PBS (solución salina tamponada con fosfato)	Corning	46-013-CM
BCA Ensayo de proteínas	Thermo Fisher Scientific	23228
Microscopía electrónica de transmisión	Hitachi	HT7700
gelatina	STEMCELL	7903
plato de cultivo de 10 cm	Falcon
placa de cultivo de 6 pocillos	Corning	3516
hembra C57BL/6 ratones	NLAC (Centro
de Animales de Laboratorio FBS (Suero Fetal Bovino)	BioWest	S01520
gentamicina	Thermo Fisher Scientific
Pen/Estreptococo	Corning	30-002-CL
DNasa I	5PRIMER	2500120
isofluorano	Halocarbono	NPC12164-002-25
formaldehído	MACRON	H121-08
EtOH (etanol)	J.T. Baker	800605
ácido acético glacial	Panreac	131008.1611
sulfato de aluminio y potasio	Sigma-Aldrich	12625
Xileno	Leica	3803665
0.22 μ membranas m	Merck Millipore	Millex-GP
AUTOCLIP Pinzas para heridas, 9 mm	BD Biosciences	427631
AUTOCLIP Aplicador de pinzas para heridas	BD Biosciences	427630
CellMask™ Rojo	Intenso Thermo Fisher Scientific	Tinción de membrana plasmática	C10046