Summary
Здесь мы представляем стереологический метод - оптическую фрактатор, используемый для количественной оценки образования новых нейронов и их выживания в гиппокампе крысы после электросудорожной стимуляции. При правильной реализации чувствительность и эффективность стереологических методов обеспечивают точные оценки с фиксированной и заданной точностью.
Abstract
Стереологические методы предназначены для описания количественных параметров без предположений о размере, форме, ориентации и распределении клеток или структур. Эти методы были революционными для количественного анализа мозга млекопитающих, в которых популяции объемных клеток слишком велики для подсчета вручную, а стереология теперь является методом выбора, когда оценки трехмерных величин необходимо извлекать из измерений на двумерных разделы. Все стереологические методы в принципе беспристрастны; Однако они полагаются на правильное знание о структуре интереса и характеристиках ткани. Стереология основана на систематической равномерной случайной выборке (SURS) с корректировкой выборки на наиболее эффективный уровень точности, обеспечивая достоверную количественную информацию обо всей представляющей интерес структуре. Здесь мы представляем оптическую фракцию в сочетании с иммуногистохимией BrdU tO оценить производство и выживание новообразованных нейронов в слое гранулированных клеток (включая субгранулярную зону) гиппокампа крысы после электросудорожной стимуляции, которая является одним из наиболее мощных стимуляторов нейрогенеза. Метод оптической фракции предназначен для оценки общего количества ячеек из толстых участков, отобранных из полной структуры. Толстые участки обеспечивают возможность наблюдения клеток в их полной трехмерной степени и, таким образом, обеспечивают легкую и надежную классификацию клеток на основе морфологических критериев. При правильной реализации чувствительность и эффективность оптического дробления обеспечивают точные оценки с фиксированной и заданной точностью.
Introduction
Количественная оценка клеток в трехмерной (трехмерной) структуре может потребовать получения оценок на основе объективных принципов. Даже сегодня в исследованиях часто используются двумерные (2-мерные) методы для представления данных трехмерных структур. Однако эти методы не учитывают гетерогенный характер структуры с точки зрения формы и распределения ячеек, что приводит к методическим ограничениям; Они делают предположения о представляющей интерес трехмерной структуре, и результаты не относятся к полной структуре. Эти ограничения уменьшают чувствительность и точность методов, а также увеличивают риск ошибок 1 .
Смещение в подсчете клеток можно избежать путем применения основанной на дизайне стереологии, которая имеет общее значение для получения количественной информации о количестве клеток в данной ткани или структуре. Хотя стереология ранее была очень трудоемким методом, прогресс в процедурах, мягкийИзделий и изображений, сделало его намного более эффективным и широко применимым. Стереология влечет за собой принципы статистической выборки и стохастической геометрической теории, чтобы обеспечить эффективные инструменты для оценки объема, площади поверхности, длины и количества объектов в трехмерной структуре путем отбора проб в двухмерных разделах 2 . Таким образом, стереология позволяет получить объективные количественные данные о структурных изменениях в срезах тканей, которые дают средние оценки истинных чисел без исчерпывающего анализа 1 . Стереология определяется как статистический вывод геометрических параметров из выборочной информации. Это может быть достигнуто путем беспристрастной выборки, то есть систематической случайной выборки, секций, а также правил подсчета, которые гарантируют, что все объекты имеют равные вероятности подсчета 3 . Хотя стереологические результаты могут иметь различную степень точности, как указано коэффициентом ошибки (CE), это может быть объявлениеОправдано в соответствии с присущей биологической дисперсией (коэффициент дисперсии (CV)) путем корректировки количества выборки по мере необходимости 4 , 5 . В нескольких предыдущих стереологических исследованиях были рассмотрены краткосрочные эффекты электросудорожной стимуляции (ECS) на пластичность гиппокампа у грызунов 6,7 . Данные этих исследований показывают начальное увеличение общего числа нейронов, а также повышенную синаптическую дифференцировку после повторных ECS. Однако эти исследования не оценивают непосредственно нейрогенез, так как они не используют специфические маркеры для пролиферации клеток.
Здесь мы представляем применение стереологического метода, метода оптической фракции 8 , 9 , для количественного определения общего количества вновь образованных нейронов в слое клеток гранулы гиппокампа крысы (GCL), включая субгранулированную зону (SGZ), а также Поскольку их долгосрочныеUrvival 10 , 11 . Мы подвергли крыс клиническому соответствующему графику ECS (три раза в неделю в течение 3 недель), который является одним из наиболее мощных стимуляторов нейрогенеза 12 . Контрольные животные обрабатывали с использованием той же процедуры, но без прохождения тока. В каждый из 21 дней экспериментов всем крысам вводили внутрибрюшинно 5-бром-2'-дезоксиуридин (BrdU), который включал в ДНК вместо тимидина во время деления клеток 13 . После экспериментов крыс поддерживали в течение четырех разных периодов времени (24 часа, 3 месяца, 6 месяцев и 12 месяцев). Используя принцип фракционирования, мы получили известную фракцию гиппокампа путем равномерной случайной выборки сечений и примененных оптических детекторов (3-D зондов) к выборочным и иммуноокрашенным толстым участкам ткани. Особенно отмечено, что замороженные участки обычно разрушаются по оси z во время процессаИ что в этом конкретном случае следует использовать оптические индикаторы, основанные на толщины среднего среднего сечения. По мере того, как фокальная плоскость оптических детекторов перемещалась на известное расстояние вниз по сектору, BrdU-положительные нейроны подсчитывались, когда их особенность, представляющая интерес, была четко распознана. В области стереологии есть некоторые дебаты об общем количестве частиц, которые должны быть подсчитаны 15 ; Обычно 150-200 нейронов подсчитываются в интересующей структуре для получения адекватной точности, т.е. коэффициента 7-8% 8 . Количество положительных нейронов BrdU было завершено с использованием стереологического программного обеспечения с визуализацией с помощью стандартного микроскопа, оснащенного камерой, и следующих целей: 2X, 4X и 10X, а также 100-процентный масляный иммерсионный объектив (числовая апертура = 1,40) и моторизованный этап , Движения в направлении z измерялись цифровым микрокатором. Окончательное увеличениеБыл 3000X.
Protocol
Все процедуры для животных выполнялись в соответствии с руководящими указаниями Датской инспекции экспериментальных животных и одобрены местным этическим комитетом экспериментальных животных.
1. Обработка тканей
ПРИМЕЧАНИЕ. После транскардиальной перфузии и постфиксирования в 4% параформальдегиде (PFA), разведенном в 0,2 М фосфатном буфере в течение ночи при 4 ° C, мозг переносят в 30% сахарозу в фосфатно-буферный солевой раствор (PBS) в течение трех дней при 4 ° C. После этого мозг замораживают на сухом порошке сухого льда и хранят при -80 ° C до секционирования.
- Отделите правое и левое полушария вдоль средней линии мозга с помощью скальпеля, а затем выберите одно или другое полушарие случайным образом в первом мозге, а затем систематически сдвиньте правое и левое полушарие ( рис. 1А ). Установите образцовое полушарие на диск образца с длинной осью, перпендикулярной к дискуС использованием монтажной среды.
- Поместите пронумерованные многодозовые контейнеры для предварительного охлаждения в криостате.
- Установите диск образца в криостат и разрежьте всю гиппокампу (Bregma 1.80 до - 7.04 16 ) на секции толщиной 80 мкм в корональной плоскости ( рис. 1B ).
- Поместите все пробоотборные секции последовательно в охлажденные многотопливные контейнеры, чтобы гарантировать, что секции сохранены в порядке резания.
- Полностью накройте секции криопротектором и держите контейнеры при -20 ° C до дальнейшего использования.
2. Иммуноокрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы отслеживать отдельные разделы во время процедуры окрашивания, поместите выбранные участки в 25-луночные окрашивающие сети. Используйте каждую 5- ю секцию, давая среднее конечное число 12 (8-16) участков на гиппокамп для иммунного окрашивания и последующего подсчета клеток.
- Перед подселекцией каждой n- й секции со случайным началом между секцией 1 и секцией n ( рис. 1C ) переносите контейнеры от -20 ° C до комнатной температуры (RT).
- Используйте, например, кисть, чтобы передать секции в порядке номеров в 25-луночные окрашивающие сети, помещенные в чашки Петри, заполненные PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ. С этого момента держите секции в сетчатых сетках, которые помещаются в соответствующие стеклянные тарелки, помещенные на орбитальный шейкер (раздел 2.3 - 2.9). - Перенесите окрашивающие сетки в соответствующие стеклянные чашки и промывайте секции дважды в течение 10 минут в PBS при комнатной температуре до инкубации в 3% перекиси водорода (H 2 O 2 ), разбавленной в дистиллированной воде (dH 2 O) в течение 20 минут.
- Перенесите секции в три разных раствора соляной кислоты (HCl) (1 М при 0 ° С в течение 10 мин, 2 М при комнатной температуре в течение 10 мин и 2 М при 37 ° С в течение 20 мин) до нейтрализации в 0,1 М тетраборате натрияT RT в течение 20 мин.
- После инкубации 3 × 10 мин в 1% Triton X-100, разбавленной в PBS (промывочный буфер), переносите секции в промывочный буфер, содержащий 10% фетальной бычьей сыворотки (блокирующий раствор) в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Инкубируйте секции в течение 48 часов при 4 ° C в мышином анти-BrdU, разбавленном 1: 100 в блокирующем растворе.
- Промойте секции 3 × 10 мин в промывочном буфере и инкубируйте в течение 48 ч в пероксидазе хрена, разбавленной 1:10 в промывочном буфере.
- Передача секций в PBS в течение 5 × 10 мин, а затем в течение 7 мин в 0,01% диаминобензидина (DAB), разбавленного в PBS, до того, как они будут перенесены в аналогичный раствор DAB, содержащий 0,02% H 2 O 2 в течение 10 минут при RT.
- Выполните серию промывок (2 × 10 мин в PBS и 2 × 10 мин в фосфатном буфере без добавления хлорида натрия) и смонтируйте секции в порядке количества на слайдах микроскопа.
- Просушите секции в течение приблизительно 30 мин перед тем, как конкретизировать крезилФиолетовый.
- Поместите слайды микроскопа в слайд-стойку.
- Пересушивают секции в течение 10 мин в чашках для нанесения пятен, содержащих dH 2 O, а затем переносят слайды до 0,02% крезил-фиолетового в dH 2 O в течение 15 мин.
- Повторите шаг 2.12 перед дегидрацией три раза в этаноле (96% в течение 5 мин и 99% в течение 2 × 2 мин).
- Поместите секции в ксилоле в течение 2 × 15 минут и покройте слайды с помощью среды для быстрой сушки для монтажа.
- Наконец, оставьте скользящие слайды в течение примерно 24 часов, прежде чем их можно будет использовать для микроскопии.
3. Оценка общего количества меченых BrdU нейронов с использованием оптической фракционирующей системы
ПРИМЕЧАНИЕ. Проведите экспериментальное исследование, включающее несколько животных, для определения оптимальных параметров выборки, таких как количество анализируемых участков и количество оптических детекторов в пределах выборочных разделов. Этот пилот также обеспечиваетПредварительное CV (стандартное отклонение / среднее значение) и возможность настройки СЕ (см. Раздел 3.9.3) для получения удовлетворительной точности оценок, определенных исследователем (более подробно см. Ниже). Аналогичным образом выполнить анализ z-распределения для решения следующих вопросов: усадка ткани, качество окрашивания по всему участку и распределение клеток по оси z 14 .
- Проверьте толщину ткани в секциях, чтобы убедиться, что они подходят для использования оптической фракционирующей машины, например, достаточно толстой для выбранной высоты выталкивателя, включая защитные зоны (см. Ниже). ПРИМЕЧАНИЕ. Толщина ткани измеряется в нескольких местах в интересующей области.
- Поместите слайды на моторизованную ступень микроскопа и включите предпочтительное стереологическое программное обеспечение.
- Отделите интересующую область, используя объектив с низким увеличением (2X или 4X), прежде чем перейти на 100-кратное масло(См. Рис. 2А ).
- Используя определенную точку счетной рамки ( например, на углу или рядом с ней), найдите верхнюю часть секции, двигаясь вдоль фокальной плоскости, пока не появится какая-то особенность секции. Зарегистрируйте эту z-позицию как 0 (см. Рис. 2B ).
- Переместите фокальную плоскость вниз по ткани до тех пор, пока одна и та же конкретная точка отсчетной рамки не окажется на последнем z-уровне ткани в фокусе и не отметит это положение. Толщина локальной ткани определяется от 0 до этой конечной точки и может считываться по оси z. Зарегистрируйте толщину ткани (см. Рисунок 2B ).
- Документируйте полное проникновение пятна и распределение ячеек в полной толщине секции.
ПРИМЕЧАНИЕ. Распределение меченых BrdU нейронов используется в качестве руководства для определения необходимых защитных зон. Хотя однородное распределение клеток имеет решающее значение,Приемлемо наблюдать меньшее количество клеток вблизи верхней и нижней части секции, указывая на эффект потерянных крышек (подробнее см. Dorph-Petersen et al., 2009).- Образцы BrdU-меченых нейронов и регистрируют их z-положение вместе с толщиной локального сечения, измеренной в выбранном углу каждой счетной рамки.
- Постройте число BrdU-положительных нейронов как функцию их z-позиции.
- Зафиксируйте высоту зонда и защитных зон на основании средней толщины сечения и распределения ячеек (см. 3.1 и 3.2).
ПРИМЕЧАНИЕ. Высота рассеивателя должна быть меньше толщины сечения, чтобы избежать артефактов вблизи поверхностей. Этот риск можно обойти, включив защитные зоны в верхнюю и нижнюю части секции. - Определите длину шага между векторами.
- Выделите интересующую область по всем разделам, которые необходимо проанализировать, и зарегистрируйте области.
- Суммируйте эти области, а затем разделите bY число объектов, которые будут помещены в эту область.
ПРИМЕЧАНИЕ. Основываясь на предыдущем опыте, хорошей отправной точкой является 75 зондов. Это обеспечит аппроксимацию области и соответствующих позиций выборки ( шаг A) (подробности см. В West, 2012). - Возьмите квадратный корень из шага A, который предоставит размер xy-step.
- Определите размер счетной рамки.
- Задайте размер счетного кадра произвольной единицей и выполните пилотную выборку BrdU-положительных нейронов, используя параметры, полученные в разделах 3.3 и 3.4.
ПРИМЕЧАНИЕ. Размер должен определяться эмпирически путем проб и ошибок, но рекомендуется, чтобы он был настроен так, чтобы обеспечить выборку из 2-3 ячеек на каждого детектора 8 .
- Задайте размер счетного кадра произвольной единицей и выполните пилотную выборку BrdU-положительных нейронов, используя параметры, полученные в разделах 3.3 и 3.4.
- После этого заключительного этапа экспериментального исследования начнется выборка клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ. Полученные параметры выборки должны приводить к подсчетам приблизительно 150-200 клеток iN каждое животное, которое является достаточным для получения эффективного стереологического дизайна 8 . - Подсчитайте BrdU-положительные нейроны, используя 100-масляный иммерсионный объектив и окончательное увеличение 2000-3000 ×. В каждом оптическом детекторе идентифицируйте любые маркированные по BrdU нейроны, которые четко распознаются интересующей особенностью (в настоящем исследовании критерием является то, что передний фронт нейронов, помеченных BrdU, впервые попадает в фокус), расположены Внутри рамки отсчета или касаться линий включения ( рисунок 2B ). Не считайте BrdU-положительные нейроны, которые, когда они четко распознаются интересующей вас функцией внутри высоты рассеивателя, касаются линий исключения. Крайне важно соблюдать скрупулезно эти правила подсчета во всей стереологической количественной оценке.
ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку BrdU включает во все делящиеся ячейки, морфология используется для различения нейронов и других типов клеток. NeuRon - явное ядро с нейтральной цитоплазмой и темным ядрышком. BrdU-позитивные клетки распознаются как новообразованные нейроны на основе их относительно большего размера по сравнению с глиальными клетками. Следует отметить, что в исследованиях кратковременной пролиферации (например, <24 ч) двойное окрашивание с использованием незрелых нейронных маркеров может быть необходимым условием 17 . - Оцените общее количество BrdU-положительных нейронов в каждом мозге, умножив общее количество клеток, подсчитанных (Σ Q - ), на обратные фракции выборки:
для
где
Q- - средняя толщина сечения, взвешенная по числу, h - высота рассеивателя, asf - доля выборки площади, ssf - сечение sА t i - толщина сечения в i- м счетном кадре с количеством клеток 
В рассеивателе 14 , 18 . - Вычислите коэффициент ошибки (СЕ) 8, который является дисперсией выборки BrdU-положительных нейронов в систематической равномерно случайной выборке (SURS).
- Сначала вычислите шум , который равен общему числу подсчитанных BrdU нейронов:
- Затем вычислите дисперсию в SURS:
ПРИМЕЧАНИЕ. Мы оценили площадь и количество клеток в гиппокампе для плавного перехода от секции к секции и, следовательно, использовали «класс гладкости» m = 1 (1/240) 8 , 19
где
P i - количество точек, подсчитываемых для объекта в i- й секции, а n - количество секций 4 , 20 . - Наконец, вычислим СЕ оценки:
ПРИМЕЧАНИЕ. Как правило, оптимальная точность обычно достигается, когда значение СЕ меньше половины наблюдаемого CV, так как OCV 2 = ICV 2 + CE 2 , где OCV является наблюдаемым CV и ICV является неотъемлемым CV 4 .
- Сначала вычислите шум , который равен общему числу подсчитанных BrdU нейронов:
Q- - средняя толщина сечения, взвешенная по числу, h - высота рассеивателя, asf - доля выборки площади, ssf - сечение sА t i - толщина сечения в i- м счетном кадре с количеством клеток 
В рассеивателе 14 , 18 . 
FРисунок 1: Схематическая иллюстрация, показывающая обработку ткани в соответствии с принципами фракционирования, используемыми в настоящем исследовании.
После экспериментов полусферы разделяются, а правое или левое полушарие выбираются систематически и случайным образом (А). Полный головной мозг, проходящий по всему гиппокампу, разрезают на корональные секции (В) размером 80 мкм, после чего каждую пятую секцию подвергают субсэмплированию, начиная случайным образом между секциями с 1 по 5 для окончательного иммуноокрашивания и стереологического количественного определения (С). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Иллюстрация, показывающая стереологическую процедуру отбора проб с использованием оптических детекторов.
(A) После гистологической обработки hИппокампал GCL / SGZ был разграниченным, а оптические устройства были применены равномерно и случайным образом по области. (B) В оптических отстоях (слева) BrdU-положительные нейроны учитывались только в том случае, если их характеристика, представляющая интерес, была четко распознана в пределах высоты рассеивателя и находилась внутри рамки отсчета или касалась линии включения (справа). Нейроны, касавшиеся линии исключения, не учитывались. Шкала шкалы = 10 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Representative Results
Параметры выборки
Анализируя z-распределение в экспериментальном исследовании ( рис. 3 ), мы обнаружили равномерное распределение BrdU-положительных нейронов на высоте отвода. Измерялась усадка секций; Конечная средняя толщина составляла 26,4 мкм (19,0-32,0 мкм) в срезах, первоначально разрезанных при 80 мкм. Основываясь на толщине ткани и распределении меченных нейронами BrdU, высота рассеивателя была установлена равной 10 мкм, а зоны защиты в верхней и нижней частях секции были установлены на 5 мкм и 4-17 мкм соответственно. В зависимости от плотности ячеек площадь отсчетных кадров составляла 1414 или 5210 мкм 2 . Длина шага составляла 220 мкм в направлениях х и у, а подсчет клеток проводили в среднем по 12 (диапазон 8-16) участков на животное. Эти параметры выборки привели к среднему значению 133 (диапазон 33-372) BrdU-положительные клетки, подсчитанные в 173 (107-204), в каждом полушарии мозга.
В качестве примера мы получили следующие значения CV и CE для BrdU-положительных нейронных оценок у крыс, обработанных ECS: 24 часа: CV = 0,59, CE = 0,11; 3 месяца: CV = 0,34, CE = 0,12; 6 месяцев: CV = 0,43, CE = 0,09; 12 месяцев: CV = 0,22, CE = 0,09.
Мы количественно подсчитали общее количество новообразованных нейронов и их долгосрочную выживаемость в гиппокампе крысы после ECS, используя оптическую фракцию в сочетании с методикой окрашивания BrdU 10 , 11 . Конечные результаты показали базальный нейрогенез в четырех группах контрольных животных, которые существенно не отличались в зависимости от времени выживания ( рис. 3 ). Кроме того, ECS вызвало значительное увеличение общего количества BrdU-положительных нейронов при 24(259%, р <0,0001), 3 (229%, р <0,001), 6 (152%, р <0,05) и 12 месяцев (162%, р <0,05) после экспериментов по сравнению с контрольными животными.
Рисунок 3: Количественные данные об общем числе BrdU-положительных нейронов в GCL / SGZ гиппокампа крысы 10 , 11 .
Горизонтальные полосы представляют собой средние значения. Сокращения: GCL, слой гранулированных клеток; SGZ, субгранулированная зона; Ч, часов; М, месяцев. **** p <0,0001, *** p <0,001 и * p <0,05 по сравнению с контролем (n = 11-12 на группу). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Используя ECS как методологию для индукции нейрогенеза, мы обнаруживаем немедленное увеличение 260% в формировании новых BrdU-положительных нейронов в гиппокампе. В этом пуле остро продуцируемых нейронов мы обнаружили 40% истощения с 1-го по 3-й месяц, причем почти 50% новообразованных нейронов выжили по крайней мере через 12 месяцев после лечения 10 , 11 . Считание нейронов с маркировкой BrdU следовало строгой схеме выборки, в результате чего весь гиппокамп разрезался на секции толщиной 80 мкм с последующей выборкой каждой пятой секции с случайным началом выборки между первой и пятой секциями. Предоставление этих разделов выбирается систематически случайным образом, это, безусловно, отличный способ уменьшить дисперсию конечного результата без исчерпывающего подсчета 1 . Эта схема выборки позволила нам подсчитать BrdU-положительные нейроны в среднем 12 (8-16) гиппокампаВ каждом мозге крысы с конечной точностью 9-11%.
При использовании метода фракционирования важно знать фракцию высоты сечения, в которой выполняется подсчет, поскольку усадка и деформация ткани часто возникают при гистологической обработке 14 . Действительно, в этом исследовании мы наблюдали существенную усадку толщины. Кроме того, следует отметить, что может произойти дифференциальная усадка ткани, как представлено в Dorph-Petersen et al. 2001. Однако, пока полная аналитическая структура представляет интерес, эти ограничения не приводят к смещению общего числа частиц, то есть BrdU-положительных нейронов. В исследованиях, где усадка тканей является особой проблемой, всегда следует указать, что результаты получены в деформированной ткани. В этом исследовании мы подсчитали на высоте рассеивателя 10 мкм. Сечения настоящего исследования имели конечную среднюю толщину 26 мкм, 5 мкмЗащитной зоны вверху и средней защитной зоны 11 мкм в нижней части секции. Эти параметры приемлемы, поскольку защитные зоны должны быть приблизительно диаметра частиц, отобранных для отбора проб.
После разграничения GCL / SGZ, детекторы были равномерно рандомизированы в пределах выделенной области. Детекторы должны располагаться с фиксированной длиной шага, которая оптимизирует выборку и подсчет, чтобы эффективно получать оценки с точностью, определенной исследователем. Оптимальная точность обычно достигается путем подсчета до 150-200 клеток в каждой представляющей интерес структуре 5 . В настоящем исследовании мы подсчитали среднее значение 133 (диапазон 33-372) BrdU-положительных нейронов в каждом гиппокампе крысы. Из-за низкого количества клеток у некоторых контрольных животных наш подсчет BrdU-положительных нейронов упал ниже общепринятого количества клеток, необходимых для получения подходящей точности, что привело к относительно высоким значениям CE для этих случаев. ЧАСОднако, поскольку мы получили значения CE менее половины CV-значений (см. Раздел репрезентативного результата), дополнительной выборки и подсчета не требуется. Высокие значения CV показывают, что наибольший вклад в наблюдаемую вариацию исходит из биологических изменений. Действительно, мы могли бы утверждать, что среднее число BrdU-положительных нейронов, подсчитанных в настоящем исследовании, было выше, чем необходимо. Например, у одной группы крыс мы достигли значения СЕ 9% и наблюдали CV-значение 43%. В этом конкретном случае мы могли бы ориентироваться на точность около 20%. Таким образом, точность общего количества BrdU-положительных нейронов в настоящем исследовании достаточна для того, чтобы фиксировать реальные эффекты воздействия на истинное количество частиц. Из-за довольно большого биологического разнообразия в определенных группах животных одни и те же оценки могли быть получены с приемлемой точностью, несмотря на меньшую затрату усилий. Высокие биологические отклонения внутри групп могутКомпенсируется увеличением числа животных.
Можно утверждать, что золотой стандарт для получения точных номеров клеток влечет за собой исчерпывающий подсчет всех объектов, представляющих интерес. Однако в большинстве исследований головного мозга это не является возможным из-за большого количества клеток. Хотя намного эффективнее, чем исчерпывающий подсчет клеток, необязательная фракционирующая единица занимает относительно много времени по сравнению с простым скринингом различий в количестве клеток, что является предпочтительным, если точное количество клеток не является существенным. Наш опыт показывает, что различия более чем на 20-30% могут быть обнаружены чисто процедурами скрининга.
Если выполнить правильно, выборка с использованием стереоизображений на основе дизайна обеспечивает объективные и точные оценки эффективным образом 1 . Беспристрастное свойство стереологии дает оценки, которые при тиражировании приближают истинное значение популяции и повышают воспроизводимостьОценка 21 . Первоначально должен быть получен репрезентативный образец всей представляющей интерес структуры (в этом исследовании должен быть получен гиппокамп GCL / SGZ), что позволяет оценивать в статистически достоверном подмножестве разделов 4 . Чтобы получить соответствующее количество разделов и подсчет зондов, мы применяем SURS, что уменьшает дисперсию по сравнению со случайной выборкой 8 . Кроме того, SURS гарантирует, что частицы, представляющие интерес в структуре, отбираются с одинаковыми вероятностями, независимо от их размера, формы, ориентации и распределения в структуре. Поскольку такую стереологию следует настоятельно рекомендовать, когда получение точных и непредвзятых оценок является центральным аспектом проекта.
Disclosures
У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Susanne Sørensen за квалифицированную техническую помощь. Эта работа была поддержана грантами Фонда The Velux; Фонд Яша; Aase и Ejnar Danielsens Foundation; Фонд братьев Хартманн; Директор Джейкоб Мэдсен и жена Ольга Мадсенс; Доктор Софус Карл Эмиль Фриис и жена Дорис Фрайс; Фонд 1870 года; Фонда Торбена и Алисы Фримодтса и Фонда неврологических исследований. Редактирование рукописей было выполнено Ingewood Biomedical Editing.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 5'-bromo-2'deoxyuridine - BrdU | Sigma-Aldrich | 19-160 | |
| Cresyl Violet | Sigma-Aldrich | C5042 | Contains the following materials for 1 L: 0.2 g cresyl violet; 2.0 g sodiumacetate, 3 H2O; 3 ml glacial acetic acid; 1000 ml destilled water |
| Cryoprotectant | Capital Region Pharmacy, DK | 861334 | Contains the following materials: Sucrose; polyvinylpyrrolidon PVP 40; sodiumphosphatebuffer (0.2 M); ethylenglycol; demineralized water. |
| dH2O | Capital Region Pharmacy, DK | 817205 | |
| Diaminobenzidine – DAB | Sigma-Aldrich | D5637 | |
| Envision-HRP | DAKO | K4001 | Peroxidase labeled polymer conjugated to goat anti-mouse immunoglobulins |
| Ethanol - 70 % | Plum A/S | 201098 | |
| Ethanol - 96 % | Plum A/S | 201104 | |
| Ethanol - 99.9 % | Plum A/S | 201111 | |
| Fetal Bovine Serum | In Vitro | BI-04-003-1A | |
| H2O2 30% | Capital Region Pharmacy, DK | 896456 | |
| HCl | J. T. Baker | 6081 | |
| Mounting medium | Sakura | 4583 | Tissue Tek |
| Mouse-anti-BrdU | Becton-Dickinson | 347580 | |
| PBS buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 853436 | pH = 7.4 |
| PFA | VWR | 28,794,295 | pH = 7.4 |
| Phosphate buffer | Capital Region Pharmacy, DK | 866533 | 0.1 mol/l, pH 7.4 |
| Rapid drying mounting medium | Histolab Products AB | 801 | Pertex |
| Sodium Tetraborate | Merck A/S | 1,063,080,500 | |
| Sucrose | Merck A/S | 1,076,515,000 | |
| Triton X-100 | Merck A/S | 1,086,031,000 | |
| Xylene | VWR | 28,973,363 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Cover slips | Menzel-Gläser | 24x50 mm #0 | |
| Cryostat | Leica | CM1860 | |
| Digital Microcator | Heidenhain | VRZ 401 | |
| Glass dishes | Brain Resaerch Laboratories | 1256 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Microscope camera | Olympus | DP72 | |
| Microscope slides | VWR | 48311-703 | SuperFrost+ |
| Motorized stage | Prior | H101A | |
| Multidish Containers | Sigma-Aldrich | D6315-1CS | Nuclon 12-wells |
| New-Cast software | Visiopharm | ver. 4.5.6.440 | |
| Objective 2x | Nikon | CFI Plan UW 2X | |
| Objective 4x | Nikon | CFI Plan Fluor 4X | |
| Objective 10x | Nikon | CFI Plan Fluor 10X | |
| Objective 100x oil immersion | Nikon | CFI Plan Apo Lambda DM 100X Oil | Numerical aperture 1.40 |
| Orbital shaker | Gemini BV | CM-9 | Sarstedt |
| Slide rack | Sakura | 4465 | |
| Slide staining dishes | Sakura | 4457 | Tissue-Tek |
| Specimen disc | Leica | 14037008637 | |
| Staining nets | Brain Research Laboratories | 2512 | 25-wells |
References
- Boyce, R. W., Dorph-Petersen, K. A., Lyck, L., Gundersen, H. J. Design-based stereology: Introduction to basic concepts and practical approaches for estimation of cell number. Toxicol. Pathol. 38 (7), 1011-1025 (2010).
- West, M. J. Introduction to stereology. 2012 (8), Cold Spring Harb. Protoc. 843-851 (2012).
- West, M. J. Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: issues of precision and bias. Trends Neurosci. 22 (2), 51-61 (1999).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J. Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Anat. Rec. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kaae, S. S., Chen, F., Wegener, G., Madsen, T. M., Nyengaard, J. R. Quantitative hippocampal structural changes following electroconvulsive seizure treatment in a rat model of depression. Synapse. 66 (8), 667-676 (2012).
- Chen, F., Madsen, T. M., Wegener, G., Nyengaard, J. R. Repeated electroconvulsive seizures increase the total number of synapses in adult male rat hippocampus. Eur Neuropsychopharmacol. 19 (5), 329-338 (2009).
- Gundersen, H. J., Jensen, E. B. V., Kiëu, K., Nielsen, J. The efficiency of systematic sampling in stereology - reconsidered. J.Microsc. 193 (3), 199-211 (1999).
- West, M. J. Design based stereological methods for estimating the total number of objects in histological material. Folia Morphol.(Warsz). 60 (1), 11-19 (2001).
- Olesen, M. V., Wörtwein, G., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation, but not chronic restraint stress, causes structural alterations in adult rat hippocampus - a stereological study. Hippocampus. 25 (1), 72-80 (2015).
- Olesen, M. V., Wortwein, G., Folke, J., Pakkenberg, B. Electroconvulsive stimulation results in long-term survival of newly generated hippocampal neurons in rats. Hippocampus. 27 (1), 52-60 (2017).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biol Psychiat. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Cameron, H. A., Mckay, R. D. G. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J.Comp. Neurol. 435 (4), 406-417 (2001).
- Dorph-Petersen, K. A., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. G. Tissue shrinkage and unbiased stereological estimation of particle number and size. J.Microsc. 204 (3), 232-246 (2001).
- Schmitz, C., Hof, P. R. Recommendations for straightforward and rigorous methods of counting neurons based on a computer simulation approach. J Chem. Neuroanat. 20 (1), 93-114 (2000).
- Paxinos, G., Watson, C. The rat brain in stereotaxic coordinates. , 2nd edn, Academic Press. Sydney. (1986).
- Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice. Development. 130 (2), 391-399 (2003).
- Fabricius, K., Wortwein, G., Pakkenberg, B. The impact of maternal separation on adult mouse behaviour and on the total neuron number in the mouse hippocampus. Brain Struct. Funct. 212 (5), 403-416 (2008).
- Dorph-Petersen, K. A., et al. Volume and neuron number of the lateral geniculate nucleus in schizophrenia and mood disorders. Acta neuropathologica. 117 (4), 369-384 (2009).
- Eriksen, N., et al. Application of stereological estimates in patients with severe head injuries using CT and MR scanning images. Br. J. Radiol. 83 (988), 307-317 (2010).
- Gundersen, H. J. Stereology: the fast lane between neuroanatomy and brain function--or still only a tightrope? Acta Neurol. Scand. Suppl. 137, 8-13 (1992).
