Summary
Detta protokoll beskriver en detaljerad metod för långsiktig ex vivo kultur och levande avbildning av en Drosophila imaginal skiva. Det visar fotoreceptor differentiering och ommatidial rotation i 10 h period av levande avbildning av ögat skivan. Protokollet är enkel och kräver inte dyra setup.
Abstract
Live avbildning ger möjlighet att kontinuerligt följa dynamiska cellulära och utvecklingsprocesser i realtid. Drosophila larver imaginal skivor har använts för att studera många biologiska processer, såsom cellproliferation, differentiering, tillväxt, migration, apoptos, konkurrens, cell-cellsignalering, och compartmental gränsbildning. Emellertid har metoder för långsiktig ex vivo kultur och levande avbildning av imaginal skivor inte varit tillfredsställande, trots många insatser. Nyligen har vi utvecklat en metod för långsiktig ex vivo kultur och levande avbildning av imaginal skivor i upp till 18 timmar. Förutom att använda en koncentration hög insulin i odlingsmediet, var en lågsmältande agaros används också för att bädda in skivan för att förhindra den från att bli under avbildningsperioden. Denna rapport använder ögon antenn skivor som ett exempel. Fotoreceptor R3 / 4-specifik mδ0.5-GA4 uttryck följdes för att visa att fotoreceptor differenkan observeras finfördelning på djupet och ommatidial rotation under en 10 h levande avbildning perioden. Detta är ett detaljerat protokoll som beskriver denna enkla metod.
Introduction
Drosophila larver imaginal skivor har varit en gynnad experimentellt system för att studera en mängd olika biologiska mekanismer. Dessa skivor invaginate från embryo epitel och bli sac-liknande strukturer som byggs upp av två epiteliala skikt, Peripodial Epitel (PE) och Disc Proper (DP) 1, 2. De imaginal skiv cellerna proliferera och progressivt differentiera under larv och PUPP stadier och slutligen utvecklas till de vuxna kroppsstrukturer. På grund av att den platta och enkla två-skiktsstruktur av de imaginal skivor, de är lätta att observera när dissekerades från larver. Trots flera försök av många grupper, de nuvarande metoderna för långtidsodling av imaginal skivor har inte varit tillfredsställande. Vi har nyligen utvecklat en odlingsmetod som kan upprätthålla den normala utvecklingen av flera imaginal skivor i upp till 18 timmar och som gör levande imaging 3 3 . Metoden är enkel, och ingen speciell luftning eller mediumcirkulation krävs.
En av de bäst studerade imaginala skivorna är den ögon-antennala skivan. Drosophila ögat är uppbyggt av cirka 800 ommatidier. Varje ommatidium består av åtta fotoreceptorceller (Rl-R8). I larvalögonskivan skiljer fotoreceptorcellerna efter passage av Morphogenetic Furrow (MF), som sveper över ögonskivan från bakre till främre 4 , 5 . Fotoreceptorerna i ett ommatidium skiljer sig i följd, börjar med R8, följt av R2 / R5, R3 / R4, Rl / R6 och R7 6 . Ommatidia i dorsal och ventral halvorna av ögat skivan undergå en 90 ° rotation i motsatta riktningar, vilket resulterar i motsatt kiralitet 7, 8. Rotations process sker i två steg: först, börjar en 45 ° rotation med och avslutas vid den sjätte ommatidia raden bakom MF; den andra 45 ° rotation är fullbordad vid omkring rad 16 9, 10. Denna studie användes ommatidial rotation, markeras med R3 / 4-specifik mδ0.5-GA4 11, för att visa den normala cellulära differentieringen och dynamik som kan observeras genom denna metod till kultur och leva-image ögat skivan.
Protocol
1. Pre-experimentell Setup
- Samla en fluga ägg som uttrycker kärn grönt fluorescerande protein (GFP) under mδ0.5-Gal4 och kulturen vid 25 ° C under 5 dagar.
- Mikrovågsugn 0,7 g lågsmältande agaros i 10 ml 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) tills agarosen är fullständigt upplöst. Hålla 0,7% lågsmältande gel i en 37 ° C inkubator fram till användning.
- Sterilisera all utrustning, inklusive pincett, sax, 42 mm x 0,17 mm täckglas, ett 9-brunnars glasprovplatta, och en magnetisk odlingskammare, med 70% etanol under mer än 12 timmar.
- Förbereda odlingsmediumet 3: Schneiders Drosophila-medium kompletterat med 2% fetalt bovint serum (FBS), 0,5% penicillin-streptomycin och 1,25 mg / ml insulin. För att undvika kontaminering, förbereda mediet i en cellkultur huva. Lagra den förberedda odlingsmedium vid 4 ° C och användes inom en månad.
- Rengör dissektion plattformen och försöksledaren's händer med 70% etanol före start av dissekering.
2. Skiv Dissection
- Lufttorka all utrustning från 70% etanol.
- Välj en tredje stadiet larv från en fluga flaska. För att undvika kontaminering från fluga flaskan, tvätta larven i 1x PBS 3x för att ta bort avfallet.
- Dissekera rengjorda larv i 1 ml odlingsmedium (vid RT) i 9 brunnar glasprovplatta under ett dissektionsmikroskop.
- Ta tag larven med en pincett vid ungefär en tredjedel av vägen från den bakre änden och en annan pincett vid mynningen kroken. Dra de två pincetten i motsatta riktningar för att frigöra inre vävnader.
- Ta bort spottkörtlarna, fett kroppen och nagelband från ögat-hjärnan komplex fäst munnen kroken. Om den ventrala nerv sladden fortfarande fäst, skära bort med en sax.
- Använd en pincett för att ta tag i munnen krok och en pincett för att ta bort en bit av vävnad som connects hjärnan och ögonskivor i ryggdelen.
OBS: Om denna vävnad inte tas bort, kommer de två ögon antenn skivor vara nära varandra och hjärnan. Ögon skivor kommer då inte ligga platt på täckglas, eftersom denna vävnad, hjärnan, och ögat-antenn skiva kommer att bilda en triangel. - Rotera hela komplexet till en ventral-uppåt läge. Ta bort glödtråd som ansluter krok eller skiva till hjärnan.
OBS: Om glödtråden inte tas bort, kommer ögon antenn skiva delas upp i två delar när munnen kroken tas bort.- Ta munnen kroken. Se till att inte skada ögat skivan under processen.
OBS: ögat skivan är nu fri på medellång och endast ansluten till hjärnan genom den optiska stjälken.
- Ta munnen kroken. Se till att inte skada ögat skivan under processen.
3. Montering
- Lufttorka och montera komponenterna i kammaren med en 42 mm x 0,17 mm täckglas. Bifoga ett dubbelt lager av O-ringar till centrum av locket glida att hålla the agaros.
- Montera kammaren med täckglas. Sätt 42 mm x 0,17 mm täck på scenen acceptor. Placera kisel O-ringen på täckglas. Placera basen. Låsa tätnings locker och placera locket (Figur 1).
- Noggrant överföra dissekerade öga-hjärna komplex till centrum av O-ringen med användning av en 20 pl mikropipett med en 10-200 mikroliter spets.
- Avlägsna det mesta av mediet och tillsätt 12 | il av 0,7% lågsmältande agaros (vid 37 ° C) till provet.
OBS: Läget i ögat skivan kan ändras med pincett innan solidifiering av agarosen. Agarosen kommer att stelna inom 5 min.- Lägg 1 ml odlingsmedium vid rumstemperatur till centrum av O-ringen; varje O-ring kan ladda upp till 4 prov. Se till att agarosen limmas på O-ringen för att undvika drivande av provet.
OBS: Ingen luftning eller cirkulation av mediet är nödvändig.
- Lägg 1 ml odlingsmedium vid rumstemperatur till centrum av O-ringen; varje O-ring kan ladda upp till 4 prov. Se till att agarosen limmas på O-ringen för att undvika drivande av provet.
4. konfokalmikroskopi
- Placera kammaren på scenen av ett inverterat konfokalmikroskop för 30 min för att jämvikta temperaturen. Detta kan förhindra Z-axeldrift under avbildning.
- Före långtids levande avbildning, kontrollera om vävnaden är intakt genom differentiell interferenskontrast mikroskopi.
- För att undvika fototoxicitet, använd en lasereffekt under 2 mW. Använd en 40X objektiv för avbildning.
- Förvärva 62 ^ m Z-stack bilder i 12 min vid en optisk intervall på 1 | im. Förvärva 40 cykler av skanningar under sammanlagt 10 timmar. Säkerställa att varje cykel innehåller 12 min av avbildning och 3 min av vilande.
Representative Results
I detta exempel, var R3 / R4 fotoreceptorer märkta med mδ0.5-GA4 att övervaka fotoreceptor differentiering. mδ0.5-GA4 driver starkt uttryck i R4 och svagare expression i R3 11, vilket gör det till en utmärkt markör för R3 och R4, såväl som för förfarandet enligt ommatidial rotation. I film 1, var R3 och R4 märkt med GFP. I början av den 10 timmar levande-bildåtergivningssessionen, fanns 8 rader av ommatidial kluster (Figur 2A och Film 1) och 14 rader av ommatidial kluster i slutet (Figur 2B). Hastigheten för ommatidial differentiering var 1,67 h per rad, vilket är nära en hastighet av 1,5-2 h / rad i in vivo skivor 7, 8, 9, 10, 11,s = "xref"> 12, 13, 14. Baserat på de relativa positionerna för R3 och R4, inträffade ommatidial rotation i ex vivo odlade skivan under levande avbildning (figur 2A 'A '', B', och B ''). En enda R3 / R4 kluster märktes med en vit sfär i den första bildrutan i filmen 2. I början, visas R3 / R4 axel för att vara vinkelrätt mot ekvatorn (figur 2C och Movie 2). Det verkar sedan för att rotera 15 °, 30 ° och 45 ° i 3 (figur 2C '), 6 (figur 2C ''), och 9 (figur 2C ''') h, respektive. Dessa data tyder på att denna metod kan upprätthålla fotoreceptor differentiering under 10 h levande avbildning.
Figure 1: Schematiskt diagram avdelnings Assembly. Schematiskt diagram av kammarenheten: (1) Sätt dubbla lager O-ring-fäst täckglas på scenen acceptor. (2) Placera kisel O-ringen på täckglas. (3) Placera basen. (4) Lås tätnings locker. (5) Ladda provet i centrum av O-ringen och placera locket. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Live avbildning av R3 / R4 Differentiering och rotation. R3 / R4 märkt med mδ0.5-Gal4 uttryckande kärnform GFP under 10 h av levande avbildning. Alla siffror fångades från Movie 1. (A) Bild tagen i början. (
Film 1:rce.jove.com/files/ftp_upload/55748/Movie_1.avi" target = '_ blank'> Klicka här för att ladda ner filmen.
Discussion
I denna studie ger vi ett detaljerat protokoll för en långsiktig levande imaging experiment på Drosophila imaginal skivor. Vi tillbringade en hel del tid att öva noggrann dissektion för att undvika skivskador och för att möjliggöra fastsättning av skivan nära täck. Vi försökte Poly-L-lysin (PLL) och lågsmältande agaros för att hålla vävnaden; i slutändan, den lågsmältande agaros visade en bättre förmåga att hålla vävnaden. Även om endast ögat skiva användes i detta dokument för att demonstrera den normala förekomsten av fotoreceptor differentiering och ommatidial rotation under 10 h levande avbildning period, kan detta förfarande också tillämpas på åtminstone en annan skiva, vingskivan, såsom visas i en tidigare studie 3. Dessutom odlingsmediet förberedelse och levande bild installation är enkla och inte kräver luftning eller medel cirkulation.
Kontinuerlig levande avbildning kan ge en tydlig tidssekvens av biologisk events. I vår tidigare rapport från glia differentiering och migration i ögat skivan, förutsatt att vi direkt bevis på att omslags glia skilja från befintliga glia efter att migrera till den främre delen av ögat skivan 3. Långsiktiga ex vivo kultur möjliggör för den specifika laseraktiverade märkning av celler, såsom den foto omvandling av KAEDE fluorescerande proteinet, för att följa deras beteenden 3. Den kan också rymma testning av kemikalier som tillsätts direkt till odlingsmediet; således kan den användas som en läkemedelsscreening plattform. Eftersom en del dynamisk process inträffa inom några minuter eller sekunder, är hög temporal upplösning krävs. För att förbättra tidsupplösningen, lätt ark mikroskopi 15, 16 eller roterande skiva mikroskopi 17 kan vara ett bra alternativ.
Den nuvarande kultur tillstånd är inte perfekt. Det har inte stöd för skivtillväxt. cell pKlyvning stöds endast i upp till 12 h 3 . Efter 12 timmar i ex vivo- kulturen börjar frekvensen av fotoreceptor differentiering minska 3 . Detta kan bero på bristen på vissa näringsämnen eller hormoner. Eftersom den stora skillnaden i detta odlingsmedium är den höga koncentrationen av insulin, kan däggdjursinsulinet delvis efterlikna funktionen hos endogena insulinliknande peptider. Tillsats av flyxtrakt, insektsblodsocker-trehalos och olika koncentrationer av molthormon-20-hydroxiseksymen var inte fördelaktiga 3 . Emellertid är 12-18 h kulturperioden tillräcklig för att studera många utvecklingsprocesser. Alternativa odlingsmetoder för odling av larvbildsskivor har jämförts 3 , och vårt odlings- och bildningsförhållande ger det längsta tidsfönstret och tydligheten för levande bildbehandling. Även om skivor inom levande larver och puppar kan avbildas direkt18, 19, 20, 21, 22, fönstret upplösning och tid för observationer är begränsade. Sen larver och PUPP skivor kan odlas under en lång tid 23, 24, men skivorna genomgår betydande morfogenes. För att dra nytta av de platta, 2D larver skivor, är vår odling och avbildningsmetod den bästa lösningen hittills.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Chun-lan Hsu och Yu-Chi Yang för att förbereda flugan mat och underhålla Fly lager, och Su-Ping Lee och IMB Imaging Core för deras hjälp med konfokalmikroskopi. Denna studie stöddes av bidrag till YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, MEST 103-2311-B-001 -035 -MY3) från National Science rådet och ministeriet för vetenskap och teknik i Kina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | AMRESCO | 0780-2PK | |
| 42 mm x 0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F9665 | |
| Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
| 40X objective | C-Apochromat 40X/1.2W Korr objective | ||
| Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |
References
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. 2, Cold Spring Harbor. NY. 747-842 (1993).
- Auerbach, C. The development of the legs, wings and halteres in wild type and some mutant strains of Drosophila melanogaster. Proc. R. Soc. Edinb. B. 58, 787-815 (1936).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long-term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113 (3), 841-850 (1991).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev Biol. 120 (2), 366-376 (1987).
- Wolff, T., Ready, D. F. The Development of Drosophila Melanogaster. , Cold Spring Harbor Press. 1277-1316 (1993).
- Adler, P. N. Planar signaling and morphogenesis in Drosophila. Dev Cell. 2 (5), 525-535 (2002).
- Choi, K. W., Benzer, S. Migration of glia along photoreceptor axons in the developing Drosophila eye. Neuron. 12 (2), 423-431 (1994).
- Strutt, D. I., Mlodzik, M. Ommatidial polarity in the Drosophila eye is determined by the direction of furrow progression and local interactions. Development. 121 (12), 4247-4256 (1995).
- Gaengel, K., Mlodzik, M. Egfr signaling regulates ommatidial rotation and cell motility in the Drosophila eye via MAPK/Pnt signaling and the Ras effector Canoe/AF6. Development. 130 (22), 5413-5423 (2003).
- Li, C., Meinertzhagen, I. A. Conditions for the primary culture of eye imaginal discs from Drosophila melanogaster. J Neurobiol. 28 (3), 363-380 (1995).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).
- Treisman, J. E. Retinal differentiation in Drosophila. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (4), 545-557 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene,, Wittbrodt, F., J,, Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. Quantitative in vivo imaging of entire embryos with Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy. Curr Opin Neurobiol. 18 (6), 624-632 (2008).
- Winter, P. W., Shroff, H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging. Curr Opin Chem Biol. 20, 46-53 (2014).
- Bosveld, F., et al. Mechanical Control of Morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-Jointed Planar Cell Polarity Pathway. Science. 336 (6082), 724-727 (2012).
- Ghannad-Rezaie, M., Wang, X., Mishra, B., Collins, C., Chronis, N. Microfluidic Chips for In Vivo Imaging of Cellular Responses to Neural Injury in Drosophila Larvae. Plos One. 7 (1), (2012).
- Heemskerk, I., Lecuit, T., LeGoff, L. Dynamic clonal analysis based on chronic in vivo imaging allows multiscale quantification of growth in the Drosophila wing disc. Development. 141 (11), 2339-2348 (2014).
- Taylor, J., Adler, P. N. Cell rearrangement and cell division during the tissue level morphogenesis of evaginating Drosophila imaginal discs. Dev Biol. 313 (2), 739-751 (2008).
- Ward, R. E., Reid, P., Bashirullah, A., D'Avino, P. P., Thummel, C. S. GFP in living animals reveals dynamic developmental responses to ecdysone during drosophila metamorphosis. Dev Biol. 256 (2), 389-402 (2003).
- Gibbs, S. M., Truman, J. W. Nitric oxide and cyclic GMP regulate retinal patterning in the optic lobe of Drosophila. Neuron. 20 (1), 83-93 (1998).
- Fristrom, J. W., Logan, W. R., Murphy, C. Synthetic and Minimal Culture Requirements for Evagination of Imaginal of Drosophila-Melanogaster in-Vitro. Dev Biol. 33 (2), 441-456 (1973).
