Summary
Nonlytic sistemi di espressione di cellule di insetto sono sottoutilizzate per la produzione, il traffico cellulare / localizzazione, e analisi funzionale proteina ricombinante. Qui, descriviamo metodi per generare vettori di espressione e successiva espressione proteica transiente in cellule lepidotteri disponibili in commercio. La co-localizzazione di Bemisia tabaci acquaporine con proteine marker fluorescenti subcellulare è anche presentato.
Abstract
Sistemi di espressione di proteine eterologhi vengono utilizzati per la produzione di proteine ricombinanti, l'interpretazione di cellulari traffico / localizzazione, e la determinazione della funzione biochimica delle proteine a livello sub-organismi. Sebbene i sistemi di espressione baculovirus sono sempre più utilizzati per la produzione di proteine in numerose biotecnologico, farmaceutico e applicazioni industriali, sistemi nonlytic che non coinvolgono infezione virale benefici evidenti ma sono spesso trascurati e sottoutilizzate. Qui, si descrive un metodo per la generazione di vettori di espressione nonlytic e l'espressione della proteina ricombinante transiente. Questo protocollo consente la localizzazione cellulare efficace delle proteine ricombinanti e può essere utilizzato per discernere rapidamente proteina trafficking all'interno della cellula. Mostriamo l'espressione di quattro proteine ricombinanti in cellule di insetto commercialmente disponibile, inclusi due proteine acquaporina dalla insetto Bemisia tabaci, nonchécome proteine marker subcellulari specifici per la membrana plasmatica delle cellule e per lisosomi intracellulari. Tutte le proteine ricombinanti sono state prodotte come chimere con marcatori proteici fluorescenti a loro termini carbossile, che consente la rilevazione diretta delle proteine ricombinanti. La doppia transfezione di cellule con plasmidi ospitare costrutti per i geni di interesse e di un marcatore subcellulare noto consente per l'imaging cellulare dal vivo e una migliore validazione di localizzazione delle proteine cellulari.
Introduction
La produzione di proteine ricombinanti utilizzando sistemi di espressione di cellule di insetto offre numerosi vantaggi per lo studio delle proteine eucariotiche. Cioè, cellule di insetto possiedono simili modificazioni post-traduzionali, elaborazione e smistamento meccanismi come quelli presenti in cellule di mammifero, che è vantaggioso per la produzione di proteine correttamente ripiegate 1, 2, 3. Sistemi cellulari di insetto anche in genere richiedono meno risorse e meno tempo e fatica per la manutenzione di linee cellulari di mammiferi 4, 5. Il sistema di espressione baculovirus è uno di questi sistemi a base di cellule di insetto che è ora ampiamente utilizzato in molte discipline, compresa la produzione di proteine ricombinanti per la caratterizzazione delle proteine e terapie, la presentazione immunogenico di peptidi esteri e proteine virali per la produzione di vaccini, la sintesi di multi complessi -Concentrati, La produzione di proteine glicosilata, ecc. 1, 2, 4, 6. Esistono, tuttavia, situazioni in cui l'espressione baculovirus possono non essere applicabile 3, 7, e l'uso di sistemi di espressione insetti nonlytic e transitori può essere più appropriato. Specificamente, l'espressione cellulare di insetto transiente offre la possibilità per la rapida sintesi di proteina ricombinante, richiede meno sviluppo e manutenzione, non comporta lisi cellulare virale imposto, e fornisce un mezzo per studiare meglio il traffico cellulare durante la sintesi proteica 7, 8, 9, 10.
Questo protocollo descrive la rapida generazione di vettori di espressione usando due passaggi overlap extension PCR (OE-PCR) Escherichia coli. I plasmidi sono utilizzati per doppio trasfezione disponibili in commercio cellule di insetto coltivate e producono proteine rappresentativi. Il protocollo descrive la produzione e l'uso di due differenti proteine marker subcellulare fluorescenza marcata e dimostra colocalizzazione con due proteine acquaporina dalla insetto tabaci Bemisia. Il protocollo che segue fornisce la metodologia di base per OE-PCR, manutenzione insetto cellulare e trasfezione, e microscopia a fluorescenza per la localizzazione cellulare delle proteine target.
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Protocol
1. OE-PCR per la costruzione di plasmidi di espressione
Nota: Vedi Tabella 1 per tutti i primer utilizzati in OE-PCR. L'uso di un DNA polimerasi ad alta fedeltà è consigliato per tutte le amplificazioni. Tuttavia, poiché questi enzimi spesso non lasciano 3' A, è necessario effettuare una breve non amplificando incubazione, con una polimerasi Taq DNA a 'A-coda' della PCR prodotti prima loro clonaggio in un'espressione TA cellula di insetto vettore. Questo protocollo illustra un metodo per generare i plasmidi di espressione insetti ospitare proteine chimeriche, con le proteine fluorescenti fuse in-frame al terminale carbossilico dei geni di interesse (in questo caso, a due tabaci acquaporina proteine Bemisia) o proteine marker subcellulari (Figura 1).
- Utilizzare OE-PCR, che consiste di due cicli di amplificazione indipendenti, per generare: (1) sequenze codificanti i geni di interesse (B. tabaciacquaporina 1: BtDrip1; B. tabaci acquaporina 2: BtDrip2_v1) fusa in-frame con una variante proteina fluorescente verde chiamato EGFP o (2) i marcatori subcellulari (peptide recettore Drosophila melanogaster sesso: DmSPR; Homo sapiens fosfolipasi A2: HsPLA2) con la sequenza codificante mCherry. legare direttamente i prodotti finali OE-PCR nel plasmide pIB / V5-His-TA.
- Per il primo giro di OE-PCR (indicato da AD e A'-D' in figura 1), utilizzare un primer senso gene-specifico (mostrato in grassetto nella tabella 1) e un primer antisenso chimerico (in corsivo nella tabella 1) corrispondente alla finale 15 bp (senza il codone di stop) del gene di interesse / marcatore subcellulare e 15 bp del 5'-end della proteina fluorescente desiderato (EGFP o mCherry) per generare un prodotto con un sbalzo 3' .
Nota: Vedere la Tabella 2 per le condizioni di PCR. - In un tubo separato, utilizzare un gene-specific fluorescente innesco antisenso proteina (mostrato con una sottolineatura nella Tabella 1) e un primer senso chimerico contenente 15 bp all'estremità 3 'del gene di interesse / marcatore subcellulare e 15 bp dal 5'-end del fluorescente desiderato proteine per generare un prodotto con un sbalzo 5' .
Nota: Vedere la Tabella 2 per le condizioni di PCR. Il modello PCR può essere un prodotto di PCR sequenza convalidato o, più preferibilmente, il DNA plasmidico ospitare la sequenza desiderata. Lo studio qui descritto utilizza plasmidi sequenza-convalidato. - Separare i prodotti PCR con 1% gel di agarosio (utilizzando le normali agarosio molecolare-grade).
- Accise e purificare i prodotti delle dimensioni attese (vedi Tabella 2) usando un kit di estrazione del DNA gel disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali per il kit specifico utilizzato in questo protocollo).
- Utilizzare i prodotti di PCR gel-purificati dal punto 1.1.4 per generare il ricoprimento eprodotti XTension (indicate con A '' - D '' in Figura 1). Utilizzare un primer senso gene-specifico per il gene di interesse / marcatore subcellulare e il corrispondente gene-specifico primer antisenso per la proteina fluorescente per generare la sequenza chimerica desiderata.
Nota: Vedere la Tabella 2 per le condizioni di PCR. Può essere necessario determinare empiricamente la quantità ottimale di primo turno prodotti di estensione sovrapposizione aggiungere alla miscela di reazione per ottenere il pieno-lunghezza del prodotto finale chimerico PCR. - Separare il secondo turno OE-PCR prodotti di 1% gel di agarosio. Accise e purificare i prodotti usando un kit di estrazione del DNA gel disponibile in commercio.
- Incubare di secondo OE-PCR prodotti gel-purificata con 1 unità di Taq DNA polimerasi maestro miscela per 10 min a 72 ° C per generare i prodotti (cioè A-code) 3' adenylated necessari per TA clonazione.
- Legare i prodotti risultanti adenylatednel vettore di espressione pIB e utilizzando tecniche di clonazione molecolare standard per trasformare chimicamente competenti (shock termico) o elettrocompetenti (elettroporazione) cellule di Escherichia coli. Overnight piastra sul terreno contenente il marcatore di selezione appropriata (cioè, ampicillina o carbenicillina).
- Eseguire colonia PCR 12 utilizzando un primer specifico vettoriale e un primer specifico inserto per identificare colonie insert-positivi che sono state trasformate con i plasmidi di espressione ospitare un inserto nell'orientamento 5'-3' . Preparare colture overnight di colonie generando prodotti PCR delle dimensioni attese.
- Isolare DNA plasmidico utilizzando un kit disponibile in commercio purificazione del DNA secondo le istruzioni del produttore (si veda la tabella Materiali per il kit specifico utilizzato in questo protocollo). Convalidare l'integrità sequenza di ciascun inserto mediante sequenziamento diretto del DNA.
- Per il primo giro di OE-PCR (indicato da AD e A'-D' in figura 1), utilizzare un primer senso gene-specifico (mostrato in grassetto nella tabella 1) e un primer antisenso chimerico (in corsivo nella tabella 1) corrispondente alla finale 15 bp (senza il codone di stop) del gene di interesse / marcatore subcellulare e 15 bp del 5'-end della proteina fluorescente desiderato (EGFP o mCherry) per generare un prodotto con un sbalzo 3' .
Nota: Per mantenere condizioni sterili, effettuare tutte le manipolazioni cellulari che richiedono l'apertura del pallone di coltura di tessuto all'interno di una cappa a flusso laminare. Accendere la lampada germicida UV cappa a flusso laminare almeno 1 h prima manipolazioni cellulari. Indossare guanti nitrile e decontaminare la superficie del banco, pipette, utensili, tubi e boccette con etanolo al 70% prima del loro utilizzo. Familiarità con tecniche di base di coltura cellulare è raccomandato 13.
- Utilizzare cellule TNI (a linea coltura cellulare stabilito derivante dalla Trichoplusia tessuto ovarico ni) atti a mezzo privo di siero e mantenerli come coltura monostrato aderente in terreno insetto privo di siero a 28 ° C in T25 palloni di coltura tissutale.
- Mantenere le cellule Sf9 (una linea di coltura cellulare stabilito derivante dalla Spodoptera frugiperda tessuto ovarico) Analogamente ma utilizzando TNM-FH cultura insetto mezzo integratorecato con 10% siero fetale bovino (FBS).
- Seme della cultura iniziale da Sf9 o cellule TNI congelato rimuovendo azionari fiale da -80 ° C e permettendo loro di scongelare in un bagno d'acqua a 37 ° C. Decontaminare le fiale con il 70% di etanolo dopo lo scongelamento e disporli sul ghiaccio.
- Aggiungere 4 ml di mezzo cellula di insetto in un pallone T25 e trasferimento 1 ml di sospensione cellulare di insetto scongelati. Porre il pallone in un 28 ° C, incubatore non umidificata e permettono alle cellule di fissare per 30-45 min.
- Sostituire il mezzo semina con 5 mL del mezzo appropriato e trasferire i flaconi ad un 28 ° C incubatore non umidificato. Monitorare confluenza delle cellule al giorno. Passage le cellule quando raggiungono il 90% di confluenza.
Nota: Copertura completa di pallone T25 corrisponde a ~ 5 x 10 6 cellule. - Passaggio della cella di insetto.
- Per il passaggio delle cellule, prima rimuovere il mezzo esausto dal pallone contenente cellule confluenti utilizzando una sterile 5 ml pipetta sierologica.Inclinare il pallone in modo che il fluido scorre verso un angolo, lontano dal monostrato cellulare. Rimuovere con attenzione il supporto con una pipetta senza disturbare le cellule.
- Rimuovere le cellule tni risciacquando delicatamente le fiasche T25 contenenti il monostrato confluente con 4 ml di terreno di insetto privo di siero utilizzando nuovo, sterile, 5 mL pipetta sierologica. Spostare la punta della pipetta attraverso il pallone e lentamente l'irrigazione per rimuovere le cellule debolmente attaccati al fondo fiasco.
- Verificare l'adeguato distacco delle cellule, eliminando tutti i supporti, ruotando la beuta sopra, ed osservando che il fondo del pallone è chiara.
- Per le cellule Sf9, che aderiscono più strettamente, aggiungere 4 mL di terreno TNM-FH fresco e utilizzare un raschietto cella per rimuovere le cellule attaccate. Utilizzare una pipetta sierologica 5 ml a mescolare delicatamente e ridurre aggregazione delle cellule.
- Utilizzare un contatore automatico di cellule per stimare il numero di cellule di insetto vitali per volume di terreno. Trasferire 0,1 ml di cellule / medio impasto a 1,5 mLprovetta da microcentrifuga. In una provetta da microcentrifuga da 0,5 mL separato, aggiungere 10 ml di cellule / medio impasto a 10 ml di trypan blu.
- Rimuovere un vetrino camera contaglobuli dalla confezione e aggiungere 10 microlitri della / medio impasto blu cellula / trypan a ciascun lato della diapositiva conteggio. Inserire il vetrino nel contatore delle cellule e determinare la densità cellulare e la vitalità.
- Utilizzando la densità cellulare, calcolare e aggiungere il corretto volume del mezzo di cellule di insetto (fino a 5 mL) a nuovi, fiasche T25 sterili.
- Trasferire circa 1-1,5 x 10 6 cellule per fiaschi T25 con mezzi freschi; etichettare i flaconi con la linea cellulare, data, mezzo utilizzato, il numero di cellule aggiunto e numero di passaggio (P n + 1 generazione, dove P n è il numero di passaggio per la precedente generazione di cellule); e posizionare i contenitori in un incubatore a 28 ° fino a 72 h.
Nota: cellule di insetto possono essere continuamente propagate, sebbene le cellule possono essere meno ricettivo a trasfezione e / o eterologoespressione della proteina dopo 30 passaggi. Trattare tutti scartato cellule / media con soluzione di candeggina al 10% e autoclave ware plastica monouso prima dello smaltimento.
3. Insect cellule trasfezione
- Inizializzare una beuta T25 con fino a 1 x 10 6 cellule tni o Sf9 in un mezzo appropriato cellula di insetto (mezzo privo di siero per insetti Tni e TNM-FH per Sf9) e crescere per confluenza per 72 ore a 28 ° C.
- Rimuovere e scartare il vecchio medio e sloggiare le cellule con 4 ml di terreno fresco insetto privo di siero (vedere i passi 2.6.2 e 2.6.3, sopra).
- Stimare la densità cellulare utilizzando un contatore automatico di cellule (vedere fase 2.6.4, sopra).
- Aggiungere circa 7 x 10 5 cellule ai piatti fondo di vetro individuali 35 mm e permettono alle cellule di fissare per 20-25 min a 28 ° C.
- Per ogni trasfezione, aggiungere 2 pg di DNA plasmidico (sia da un plasmide per singoli trasfezioni o 2 ug di ciascuno dei due plasmidi per Dotrasfezioni üble) a 0,1 ml di mezzo di insetto senza siero (senza FBS sia Sf9 e trasfezioni TnI) in una sterile 1,5 mL provetta da microcentrifuga.
- In un tubo separato, mescolare 8 ml di reagente di trasfezione con 0,1 ml di terreno di insetto senza siero e poi trasferire tale soluzione al tubo contenente il DNA plasmidico di interesse. Leggermente vortice e incubare a temperatura ambiente per 20 - 30 min.
- Diluire la miscela plasmide-trasfezione dalle fasi 3.5 e 3.6 con 0,8 ml di terreno di insetto senza siero modo che il volume totale equivale a 1 ml.
- rimuovere accuratamente i supporti dai piatti di vetro contenenti cellule attaccate. Sovrapporre le cellule attaccate con il mezzo-trasfezione plasmide diluito.
- Incubare le cellule a 28 ° C per 5 h.
Nota: Le condizioni per la trasfezione richiedono ottimizzazione empirico per efficienza di trasfezione massima (ad esempio, trasfezione overnight anziché 5 h, la quantità di DNA plasmidico utilizzato, la chimica del reagente di trasfezioneusato, ecc.). - Rimuovere ed eliminare il mezzo di trasfezione e lavare delicatamente le cellule con 1 ml di mezzo privo di siero insetto, facendo attenzione a non staccare le cellule.
- Aggiungere 2 ml di mezzo di cellule di insetto fresco (privo di siero medio insetti per Tni e TNM-FH per Sf9) e incubare a 28 ° C per 48-72 ore.
Nota: Anche in questo caso, le condizioni lo richiedono ottimizzazione empirica per l'espressione della proteina eterologa massima.
4. confocale microscopia a fluorescenza
- A 48-72 h dopo la trasfezione, le cellule lavare una volta con 1 ml di IPL-41 medio insetto e poi coprire con 2 mL di IPL-41 per l'imaging.
Nota: Questa fase di lavaggio riduce lo sfondo auto-fluorescenza osservato con mezzo di cellule di insetto utilizzato nella normale manutenzione delle cellule. - Aggiungere 4 gocce di reagente Hoechst colorazione live-cell (vedere la tabella di materiali per l'colorazione nucleare specifica utilizzata in questo protocollo) al mezzo e incubare a 28 ° C per 20-25 min.
Nota: NUC aggiuntivemacchie Lear potranno essere sostituiti, anche se il colorante dovrebbe avere un profilo fluorescenza unico da EGFP e mCherry. - Posizionare una piastra da 35 mm nella scansione laser sé racchiuso microscopio confocale (vedere la tabella dei materiali per lo strumento specifico utilizzato in questo protocollo).
- Regolare il microscopio per condizioni di osservazione Hoechst, EGFP, e mCherry: Hoechst eccitazione / emissione - 359/461 nm; EGFP eccitazione / emissione - 489/510 nm; mCherry eccitazione / emissione - 580/610 nm.
- Eseguire una prima scansione utilizzando un obiettivo 10x per confermare l'espressione fluorescente e quindi passare alla modalità di scansione utilizzando un obiettivo contrasto acqua-immersione 60X fase.
- Regolare la potenza del laser (5-7%), sensibilità del rivelatore (47-49%), la velocità di scansione, profondità Z, e zoom digitale per ottimizzare il contrasto e risoluzione dell'immagine. Immagine le cellule a 1.5X zoom digitale per dare un totale di 90X di amplificazione.
Nota: i parametri del microscopio richiedono una regolazione empirica ottimaleraccolta di immagini e può essere specifico per lo strumento in uso. - Esportare i dati grezzi come file di immagini TIFF e modificare (colture e sovrapposizione) per la generazione di figura.
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Representative Results
OE-PCR
OE-PCR consente la sintesi di prodotti di DNA chimeriche che, una volta inserito in un vettore di espressione, per consentire la produzione di proteine chimeriche ricombinanti corrispondenti a qualsiasi gene prova di interesse e l'proteina marcatore fluorescente. La figura 1 rappresenta uno schema generale per la produzione di vettori di espressione contenenti PiB B. aquaporin tabaci sequenze codificanti (BtDrip1 e BtDrip2_v1) in-frame con il fluorescente EGFP proteina marker. In questo scenario, sono state prodotte due proteine chimeriche BtDrip contenenti EGFP ai loro termini carbossilici. Questo protocollo inoltre dimostrato metodi per sviluppare due proteine insetti subcellulari marcatore, DmSPR e PLA2G15 (Figura 1), ottenuta come chimere con mCherry a loro termini carbossile. EGFP e mCherry stati scelti perché i loro spettri di emissione sono sufficientemente divergenti, consentendo tlui rilevamento indipendente e co-localizzazione di segnali da proteine di prova (ad es., BtDrip-EGFP) e il DmSPR- e PLA2G15-mCherry-etichettato proteine marker. Tutte le reazioni PCR prodotte bande di dimensioni attesi e sono stati clonati con successo in pIB. Tutti i plasmidi sono stati confermati mediante sequenziamento del DNA per contenere gli inserti appropriati nell'orientamento corretto e in-frame con marcatori proteici fluorescenti.
espressione della proteina ricombinante transiente in coltura cellulare di insetto
Seguendo la costruzione di vettori di espressione corrispondenti a pIB / BtDrip1-EGFP, pIB / BtDrip2_v1-EGFP, pIB / DmSPR-mCherry, e pIB / PLA2G15-mCherry, le cellule sono state trasfettate e l'espressione di proteine ricombinanti in cellule vive è stata visualizzati utilizzando confocale a fluorescenza microscopia (Figura 2). trasfezione di successo ed espressione ricombinante BtDrip1-EGFP è evidente by la presenza di fluorescenza verde sulla superficie delle cellule TNI (Figura 2B, 2F). Verde fluorescenza si osserva nelle cellule trasfettate con TNI BtDrip2_v1-EGFP (Figura 2J, 2N), indicando l'espressione intracellulare di BtDrip2_v1. Analogamente, le cellule trasfettate con TNI pIB / DmSPR-mCherry (Figura 2C, 2K) o pIB / PLA2G15-mCherry (figura 2G, 2O) mostrano fluorescenza rossa, indicando l'espressione dei rispettivi chimere.
Co-localizzazione delle proteine ricombinanti BtDrip e marcatori subcellulari
La doppia transfezione di cellule TNI permette la co-espressione di due proteine fluorescenti-marcato. immagini sovrapposte di cellule transfettate TNI che sono arancione / giallo indicano che le cellule porto plasmidi che producono sia EGFP e mCherry e suggeriscono che le proteine sono co-localizzate all'interno dello stesso sustrutture bcellular (Figura 2D, 2H, 2L e 2P). Ciò conferma i risultati precedenti che BtDrip1 e DmSPR sono espressi sulla superficie cellulare 14, 15, 16. Una sovrapposizione di cellule TnI doppio trasfettate con pIB / BtDrip1-EGFP e pIB / DmSPR-mCherry mostra sovrapposizione dei segnali di fluorescenza verde e rosso (Figura 2D), suggerendo co-localizzazione di BtDrip1-EGFP e DmSPR-mCherry sulla superficie cellulare . In precedenza, Maroniche et al. 17 dimostrato che PLA2G15 è un marker di lisosomi intercellulari quando espresso in cellule Sf9 come una chimera con mCherry. Anche se è stato previsto che la proteina ricombinante BtDrip2_v1-EGFP sarebbe traslocare alla superficie cellulare, è stato precedentemente dimostrato che la proteina chimerica è stato principalmente localizzata intracellulare nelle cellule trasfettate TNI 15. A sostegno di questo, c'era poco EVIDENCE per la co-localizzazione di segnali fluorescenti verde e rosso quando BtDrip2_v1-EGFP è stato co-espresso con pIB / DmSPR-mCherry (Figura 2L). Al contrario, la co-espressione di pIB / BtDrip2_v1-EGFP e pIB / PLA2G15-mCherry determinato una significativa sovrapposizione dei segnali fluorescenti verde e rosso citoplasmatici (Figura 2P), suggerendo fortemente che BtDrip2_v1 è probabile trafficata ai lisosomi intracellulari.
Figura 1: Schema di costruzione costrutti di espressione utilizzando Overlap Extension PCR (OE-PCR). OE-PCR è usata per costruire PIB vettori di espressione contenenti il Bemisia tabaci aquaporin-1 / EGFP (BtDrip1-EGFP), B. tabaci aquaporin-2_variant 1 / EGFP (BtDrip2_v1-EGFP), Drosophila melanogaster recettore sesso peptide / mCherry (DmSPR- mCherry), e Homo sapiens fosfolipasi-A2 / mCherry(HsPLA2G15-mCherry) prodotti. Il primo ciclo di OE-PCR genera frammenti corrispondenti ai cDNA full-length di interesse, BtDrip1 (A), BtDrip2_v1 (B), DmSPR (C), e HsPLA2G15 (D), contenente una piccola 3' regione di sovrapposizione corrispondente 5'-end sia del EGFP o mCherry proteine marker fluorescenti. Contemporaneamente, cDNA full-length da EGFP e mCherry sono PCR amplificato e contengono una piccola regione 5' di sovrapposizione corrispondente ai 3'-estremità BtDrip1 (A '), BtDrip2_v1 (B'), DmSPR (C'), o HsPLA2G15 ( D'). Si noti che tutti i primer usati per amplificare il cDNA di interesse (cioè BtDrip1, BtDrip2_v1, DmSPR e HsPLA2G15) nel primo ciclo di OE-PCR hanno le codone di stop normalmente presenti alla estremità 3 'di ciascuna sequenza codificante. Tutti primo turno OE-PCR prodotti vengono amplificati, separate da eletti gel di agarosiorophoresis e gel purificati. Il secondo ciclo di OE-PCR utilizza coppie pool dei prodotti di PCR gel purificato dal primo ciclo di OE-PCR come template per l'amplificazione degli integrali prodotti chimerici. Per ogni reazione, il primer senso corrisponde al 5'-end del cDNA di interesse sequenze codificanti e il primer antisenso è complementare all'estremità 3 'del EGFP o mCherry, con il suo codone di stop intatta (A '', B' 'C'' e D ''). I quattro di secondo OE-PCR prodotti gel purificati, adenylated con Taq polimerasi, e ligato nel vettore di espressione pIB / V5-historisches. I plasmidi sono propagate in E. coli, e il DNA plasmidico purificato è usato per trasfettare cellule di insetto. Il B. tabaci Acquaporine BtDrip1 e BtDrip2_v1 sono mostrati in blu scuro e ciano, rispettivamente, e i marcatori subcellulari DmSPR e PLA2G15 sono mostrati in arancione e rosa, rispettivamente. EGFP è shproprio in verde e mCherry è in rosso. frecce colorate indicano la direzione (primer senso nella direzione e antisenso forward primer nella direzione inversa) e la posizione di primer gene-specifici (il colore di un primer indica la fonte della sequenza primer). Vedi Tabella 1 per i dettagli di primer. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Imaging in diretta di Double-transfettate cellule TNI Esprimendo ricombinante BtDrip1-EGFP, BtDrip2_v1-EGFP, DmSPR-mCherry e proteine PLA2G15-mCherry. Trichoplusia ni cellule (TNI) sono stati doppio trasfettate con pIB / BtDrip1-EGFP e pIB / DmSPR-mCherry (AD), pIB / BtDrip1-EGFP e pIB / PLA2G15-mCherry (EH), pIB / BtDrip2_v1-EGFP e pIB / DmSPR -mCherry (<strong> IL), o pIB / BtDrip2_v1-EGFP e pIB / PLA2G15-mCherry (MP). Immagini sono state catturate con un microscopio confocale a scansione laser con un contrasto oggettiva acqua immersione 60X fase (NA 1,2) a 90X amplificazione. I pannelli Hoechst mostrano immagini rappresentative di cellule vive di nuclei delle cellule macchiati (ex / em = 359/461 nm). I pannelli EGFP mostrano l'espressione di fluorescenza di cellule trasfettate con chimere EGFP (ex / em = 489/510 nm). I pannelli mCherry mostrano l'espressione di fluorescenza di cellule trasfettate con chimere mCherry (ex / em = 580/610 nm). Il pannello di unione mostra la sovrapposizione dei tre canali di fluorescenza (cioè Hoechst, EGFP, e mCherry). bar scala = 10 micron. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sistemi di espressione di proteine eterologhe sono strumenti importanti per la produzione di proteine ricombinanti utilizzati in numerose applicazioni a valle 4. Scegliendo tra i diversi sistemi di espressione disponibili dipende l'obiettivo finale per la proteina di interesse. Diversi sistemi di espressione delle cellule di insetto sono disponibili che offrono alternative flessibili per sistemi di espressione delle cellule procariote ed eucariote 5, 6. Sistemi di insetti che richiedono l'infezione baculovirus per guidare l'espressione della proteina sono di gran lunga il sistema di insetto più popolare e diffuso, con molte di queste proteine utilizzate nella ricerca e applicazioni terapeutiche 1, 2, 3. espressione baculovirus, tuttavia, hanno delle limitazioni, tra cui: 1) il ciclo virale comporta la lisi della cellula ospite; 2) le cellule ospiti che vengono lisate tipicamente rilascio elevato amoUNTS di enzimi degradativi; 3) la generazione di linee cellulari stabili richiede tempo e può non essere fattibile per proteine citotossiche; 4) espressione discontinua richiede una manutenzione frequente; 5) generazione vettore spesso richiede più passaggi di clonaggio; 6) densità cellulari di insetto sono spesso inversamente proporzionali alle infezioni virali; e 7) proteine ricombinanti sono principalmente trafficate ad alti livelli alla superficie cellulare o vengono secreti 3, 7, 9, 10. Nonlytic espressione genica transitoria basato su trasfezione delle cellule di insetto con il DNA plasmidico offre una tecnica alternativa per la produzione di proteine ricombinanti, senza che alcune delle sfide univoco associato con baculovirus 7, 8. Vale a dire, l'espressione transiente cellula di insetto offre turn-around corto sulla costruzione del vettore e la sintesi proteica, evita challeng es associate all'infezione virale e lisi cellulare, e fornisce un mezzo affidabile per osservare il traffico cellulare di proteine.
Qui, due costrutti di espressione validati sono stati usati per determinare la localizzazione subcellulare del B. tabaci acquaporina proteine BtDrip1 e BtDrip2_v1. DmSPR-mCherry è un marcatore per la membrana plasmatica delle cellule 16 e PLA2G15-mCherry localizza all'interno lisosomi cellulari 17. La figura 2 mostra il valore di tali marcatori per valutare le posizioni delle proteine di interesse, in questo caso, la co-localizzazione di BtDrip1-EGFP con DmSPR-mCherry sulla superficie cellulare e BtDrip2_v1-EGFP con PLA2G15-mCherry all'interno lisosomi. Pertanto, come mostrato qui e nelle inchieste precedenti 14, 15, 16, 18, 19,ass = "xref"> 20, questa metodologia può essere utilizzata per determinare rapidamente il traffico proteine all'interno delle cellule di insetto. Sebbene l'espressione della proteina e il traffico all'interno delle cellule tni illustrata (figura 2), è importante notare che il protocollo può essere ottimizzato e applicato ugualmente bene ad altre linee cellulari di insetto (Sf9, Sf21, BM-N, S2, etc.) .
Come tutti i sistemi di espressione proteica eterologhi, ci sono delle limitazioni per la produzione di proteine transitorio all'interno delle cellule di insetto da coltura. Vale a dire, la percentuale di cellule positive per l'espressione plasmide derivato è tipicamente inferiore a quella ottenuta da baculovirus o da utilizzando linee cellulari stabili. Così, la quantità di proteina ricombinante (s) prodotta può essere inferiore in un sistema transitorio; Tuttavia, l'uso di diversi promotori e l'incorporazione di miglioratori genetici possono superare questa limitazione potenziale 7, 21, 22. Tsuo protocollo dimostra la co-trasfezione di cellule TNI con due vettori PIB, ogni ospitare differente proteina codificanti sequenze (Figura 2). Benché simili efficienze di trasfezione sono stati osservati per tutti i quattro vettori di espressione utilizzati per trasfettare le cellule tni (dati non mostrati), questo non è sempre possibile. Quindi, esperimenti con tali vettori di espressione transiente rendere necessario l'ottimizzazione empirico (ad esempio, la variazione nella quantità di ciascun vettore, tempo trasfezione, reagente di trasfezione chimica, ecc) per raggiungere efficienze di trasfezione equivalenti e / o livelli di espressione della proteina ricombinante. Inoltre, è possibile che l'aggiunta di una proteina fluorescente può influenzare o limitare il traffico subcellulare di proteine target 23, 24. L'identificazione del subcellulare co-localizzazione delle due proteine dall'osservazione della fluorescenza con proteine marker non necessarily indica interazioni dirette proteina-proteina tra le proteine di interesse 24, 25. Quindi, è necessaria cautela nell'interpretazione tali risultati co-localizzazione.
espressione genica transitoria non offre diversi vantaggi rispetto ai sistemi di espressione baculovirus attualmente disponibili. espressione transiente richiede meno tempo e manodopera per la costruzione di vettori e per la sintesi di proteine ricombinanti, espressione transiente non comporta la lisi cellulare associato al ciclo di vita patogenicità del baculovirus, e l'espressione transiente può fornire un sistema di studio meglio per il traffico subcellulare proteine 3, 7, 9. Questo protocollo evidenzia la facilità e la velocità di costrutti costruzione attraverso l'incorporazione diretta di un gene di interesse nel vettore di espressione pIB utilizzando overlap extension PCR (Figura 1 26. Inoltre, anche se EGFP 27 e 28 sono stati inseriti mCherry qui in termini carbossile di due proteine aquaporin B. tabaci, OE-PCR potrebbe anche essere utilizzato per posizionare molte altre proteine marker fluorescente variante 26 al termini ammino di queste proteine. È da notare che, oltre a numerosi plasmidi di espressione create utilizzando OE-PCR, molte cassette tradizionali espressione clonazione sono stati preparati e possono essere utilizzati per produrre virtualmente qualsiasi proteina di interesse in-frame con le proteine fluorescenti EGFP, Venus e mCherry, fusi sia nella ammino o estremità terminali. Tali cassette di espressione sono disponibili su richiesta.
L'era della "genomica" ha fornito un volume senza precedenti e l'accesso alle significativa data. Tuttavia, il divario continua ad allargarsi tra scoperta del gene e l'assegnazione della funzione di prodotti genici; in tal modo, strumenti empirici aggiuntivi sono disperatamente necessari per accelerare la genomica funzionale. Considerando che, gene-editing e altri sistemi di manipolazione genica in vivo in definitiva possono fornire approcci esilarante per assegnare la funzione del gene, eterologhi sistemi di espressione proteica probabilmente rimarrà importante per la biomanufacture di preziose proteine e per decifrare la struttura e funzione delle proteine. Questo protocollo descrive un metodo per la maggiore costruzione di plasmidi di espressione e l'espressione transiente di proteine ricombinanti in cellule di insetto.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo Lynn Forlow-Jech e Dannialle LeRoy per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di base CRIS a USDA ARS, Programma Nazionale 304 - Crop Protection e la quarantena [del progetto # 2020-22620-022-00D] per JAF e JJH Menzione dei nomi commerciali o prodotti commerciali in questo articolo è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti. USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA Polymerase | EMD Millipore | 71085-3 | High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products |
| ExTaq DNA Polymerase | TaKaRa-Clontech | RR001B | DNA polymerase used for A-tailing of PCR products |
| EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix | Lucigen | 30033-1 | DNA polymerase used for bacterial colony PCR |
| Biometra TProfessional Gradient Thermocycler | Biometra/LABRepCo | 070-851 | |
| Agarose LE | Benchmark Scientific | A1705 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Montage DNA Gel Extraction Kit | EMD Millipore | LSKGEL050 | |
| pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit | ThermoFisher | K89020 | Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution. |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAcube Robotic Workstation | Qiagen | 9001292 | |
| Purifier Vertical Clean Bench | Labconco | 3970401 | |
| Tni cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10005 | |
| Sf9 cultured insect cell Line | Allele Biotech | ABP-CEL-10002 | |
| Serum-Free Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10002 | |
| TNM-FH Insect Culture Medium | Allele Biotech | ABP-MED-10001 | |
| IPL-41 Insect Medium | ThermoFisher | 11405081 | |
| Cellfectin II Transfection Reagent | ThermoFisher | 10362100 | |
| 16 cm Disposable Cell Scrapers | Sarstedt | 83.1832 | Cell scrapers with two-position blade |
| 25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps | Life Science Products | CT-229331 | |
| Transfer Pipets | Fisher | 1371120 | |
| Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes | Life Science Products | CT-229475 | |
| PipetteBoy | VWR | 14222-180 | |
| 5 mL Serological Pipettes | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| 0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes | Fisher | 14230200 | |
| Polypropylene Biohazard Autoclave Bags | Fisher | 01828C | |
| 35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes | Matsunami Glass | D35-14-1.5-U | 35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated |
| Incubator, Model 1510E | VWR | 35823-961 | |
| Countess II FL Cell Counter | ThermoFisher | AMQAF1000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent | ThermoFisher | C10228 | |
| Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | FV10i-LIV | |
| HsPLA2/pCS6 plasmid DNA | transOMIC Technologies | TCH1303 | |
| pmCherry Vector | Clontech | 632522 | |
| NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) | ThermoFisher | R37605 |
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