Summary
Desarrollamos un método para eliminar, procesar, seccionar y teñir exitosamente, para la evaluación histopatológica, el tejido mamario que originalmente había sido fijado en diapositivas como monturas enteras. Este método puede promover la recolección y evaluación de monturas enteras de glándulas mamarias en estudios de referencia de pruebas reproductivas y de desarrollo.
Abstract
El desarrollo normal de las glándulas mamarias puede verse alterado por la exposición a tóxicos ambientales y productos farmacéuticos, exposición excesiva a hormonas y alteraciones genéticas. Las guarniciones enteras de la glándula mamaria son un método barato para capturar la progresión de los cambios morfológicos que pueden surgir después de la exposición. Sin embargo, en la vida posterior, cuando las anomalías son más propensas a desarrollarse, la única dependencia de este método puede no siempre proporcionar información suficiente para hacer un diagnóstico adecuado de la anomalía. Históricamente, en los estudios de guía de pruebas químicas, una única glándula mamaria se elimina en la necropsia y se prepara como hematoxilina y eosina (H & E) -stained sección. La incorporación de la recolección y análisis de todo el montaje mamario contralateral disminuye la probabilidad de una evaluación falso-negativa. La evaluación de la totalidad del soporte está limitada por la presencia de una o dos glándulas mamarias enteras en una diapositiva y, en algunos casos, las anomalías observadas en todo el soporte no sonT uniformemente representada en la sección H & E. El objetivo de este estudio fue desarrollar un protocolo para la conversión de coverslipped mamífero entero monta a H & E manchado secciones de modo que las lesiones que de lo contrario se han perdido o que son difíciles de diagnosticar se puede identificar. Aquí se detalla un método para producir una sección H & E embebida en parafina de alta calidad de una glándula mamaria que se preparó inicialmente como una montura completa. En comparación con un tejido que se preparó intencionalmente para la sección de H & E, todo el soporte requiere una preparación adicional para la eliminación y procesamiento del tejido. Sin embargo, este método se considera barato, ya que requiere reactivos de laboratorio comunes y poco tiempo adicional. Como resultado, este método puede proporcionar información invaluable sobre cómo las exposiciones químicas y ambientales alteran el desarrollo mamario normal, así como mostrar los cambios que se producen debido a las modificaciones genéticas.
Introduction
La madre entera mamaria es un método útil y barato implementado en muchos estudios de ratas y ratones para comprender tanto el desarrollo anormal normal como químicamente inducido. En general, una glándula mamaria recogida en diferentes etapas durante el desarrollo de los roedores ( es decir, la adolescencia, la pubertad, la mitad de la gestación tardía y la fase de involución) mostrará cambios morfológicos en los tejidos y la arquitectura celular influenciada por factores parácrinos, endocrinos y autócrinos 1 . En la rata envejecida, las porciones epitelial y estromal de la glándula se vuelven cada vez más densas, lo que dificulta la medición de los parámetros morfológicos en un montaje completo. Por lo tanto, es una práctica común para recoger una glándula para la evaluación histológica para identificar los cambios en un nivel microscópico. Ambos procesos son especialmente útiles en estudios que involucran exposición química ( es decir, ambiental o farmacéutica) o para examinar los cambios morfológicos acompañados de alteraciones genéticasAciones.
Las técnicas y capacidades para el uso de la glándula mamaria en la evaluación del riesgo continúan evolucionando. Mientras que la preparación de todo el montaje es rutinaria y estandarizada, las modificaciones al seccionamiento continúan 2 , 3 . Muchos grupos de investigación de diversos orígenes ( es decir, la academia, el gobierno y la industria) han adaptado las secciones coronales y longitudinales del tejido mamario como método preferido, mientras que algunos laboratorios siguen utilizando secciones transversales a través de la piel 4 . Este último método da como resultado una representación desordenada de la epidermis (piel), en lugar del tejido de interés: el epitelio de la glándula mamaria 2 . Las secciones coronales o longitudinales son más útiles para caracterizar el tejido normal 5 y mejoran en gran medida la detección de anomalías y lesiones debido al aumento del área superficial y el número de estructuras presentes. En general, esto hace que la moSin un método adecuado para la evaluación histopatológica comparativa de la glándula mamaria 1 , 2 . Si se utiliza un ratón o una rata, la recuperación y la preservación de las glándulas inguinales 4ª y 5ª es altamente recomendada para la comparación de todo el soporte con una sección contralateral de H & E.
Cuando se usan en combinación, la sección de H & E y el montaje completo proporcionan una descripción precisa de los cambios celulares y morfológicos inducidos por la exposición ambiental. Esto es especialmente cierto en ciertas cepas de roedores en las que el modelo posee una baja susceptibilidad a la formación de tumores o un tumor no es claramente visible. En algunas circunstancias, la obtención del tejido requerido no siempre es posible utilizando ambas técnicas ( es decir, cantidad de tejido insuficiente, recursos o resultados experimentales inesperados). En nuestro caso, se observaron anomalías en el montaje completo mamario, mientras que histopathoLos hallazgos lógicos en la glándula contralateral H & E eran en su mayoría normales. La abrumadora discrepancia entre las glándulas contralaterales nos llevó a desarrollar un procedimiento económico y eficiente para identificar las anomalías en los montajes en su conjunto. Utilizando un proceso de procesamiento y empotramiento modificado, se prepararon secciones de alta calidad H & E-manchadas de soportes enteros parafina-embebidos. Prevemos que este protocolo se convierta en una potente herramienta de detección de efectos de exposición química, mejorando las comparaciones entre laboratorios.
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Protocol
Todos los usos y procedimientos de los animales para este estudio fueron aprobados por el NIEHS Laboratory Animal
Comité de Atención y Uso y realizado en una Asociación para la Evaluación y Acreditación de
Laboratorio de Cuidado de Animales-instalación acreditada.
1. Preparación de montaje completo mamario 2 , 3 , 6 , 7
- Elimine las glándulas mamarias inguinales de un lado de un ratón hembra CD-1 no embarazada, como se describe en la referencia 3 , y colóquelas sobre una diapositiva cargada electrostáticamente.
- Cubra la glándula con papel antiadherente o película y coloque otra diapositiva en la parte superior. Añada presión ( es decir, pesos de agua) a la corredera para separar la glándula hacia fuera plana de modo que la glándula se pegue a la diapositiva para la fijación.
- Sumergir los portaobjetos en un fijador ( por ejemplo, etanol al 100%, cloroformo y ácido acético glacial en una relación 6: 3: 1)Durante la noche a temperatura ambiente.
- Quitar las glándulas del fijador y lavar en etanol durante 15-30 min. Después del lavado de 30 minutos, cambiar gradualmente a agua por verter 1/3 del etanol y agregar agua. Deje que el lavado se sienta durante 5 minutos cada vez, y repita con la adición de agua 3 veces.
- Mancha ( por ejemplo, solución de alumbre de carmín) durante 12-24 h.
NOTA: Los tejidos más gruesos requerirán tiempos de tinción más largos. Véase la referencia 3 para detalles de tinción. - Vierta la mancha después del tiempo asignado y enjuague los portaobjetos en agua durante 30 s. Deshidrate los tejidos lavando los portaobjetos en etanol al 70% durante 15 minutos, seguido de un lavado de 15 minutos en etanol al 95% y un lavado final en etanol al 100% durante 20 min.
- Borrar la grasa de los tejidos colocándolos en xileno durante un mínimo de 24 h, o más si el tejido es grueso, de modo que se eliminen las áreas opacas o blancas.
- Retirar el tejido del xileno y añadir rápidamente mMontar el medio en la corredera para evitar la deshidratación del tejido; Coloque un cubreobjetos en la parte superior. Deje que el portaobjetos se seque durante al menos 48 h.
- Evaluar el tejido entero para anomalías, como se describe en 2 .
NOTA: Cuando se detectan lesiones en montajes enteros y la seccion es necesaria para establecer su identidad, se deben seguir los siguientes pasos.
2. Extracción del soporte completo mamario de una diapositiva de vidrio
- Retire la cubreobjetos y el medio de montaje sumergiendo la diapositiva mamaria de montaje completo en un frasco de tinción de vidrio lleno de xileno durante la noche.
NOTA: Los tejidos más gruesos y los portaobjetos con solución de montaje excesiva pueden requerir tiempo adicional para la eliminación de la cubreobjetos. - Después de la inmersión inicial durante la noche, coloque los portaobjetos en xileno fresco y remoje durante 6 h. Realizar una inmersión final en xileno fresco durante la noche.
NOTA: El cubreobjetos se caerá fácilmente de la diapositiva después del último remojo. - Con agAmado mano, sostener la diapositiva y cuidadosamente quitar el cubreobjetos con un par de fórceps para asegurarse de que se quita en una sola pieza.
NOTA: En el caso de que la cubreobjetos todavía esté unida a la diapositiva de cristal, continúe remojándola hasta que pueda quitarla con poco esfuerzo. - Una vez que el cubreobjetos se quita, sostenga la diapositiva perpendicularmente a una placa de Petri de vidrio que contenga xileno, tome cuidadosamente una cuchilla de afeitar desechable y deslice la cuchilla en un solo movimiento por la corredera.
- Una vez que el tejido se elimina, sumerja rápidamente la almohadilla mamaria en una placa de Petri de vidrio llena de xileno para asegurar que el tejido no se seque al aire.
NOTA: Tenga cuidado con este paso. Todo el montaje es delgado (≤ 1 mm), y frágil de procesamiento de xileno. Cualquier impresión o desgarro puede cambiar la morfología del tejido y complicar las evaluaciones posteriores.
3. Procesamiento de tejidos
- Una vez que el tejido se encuentra en la placa de Petri,A un casete histológico marcado. Agarrar el borde de la almohadilla de grasa con fórceps con punta dentada y con punta redonda para minimizar el daño tisular.
- Usando una maquinilla de afeitar, corte los tejidos más grandes (especialmente para las ratas) por la mitad y colóquelos en dos casetes etiquetados separados que acomodarán el tamaño del tejido fino. Coloque el lado derecho del tejido hacia arriba (use el ganglio linfático como referencia). Asegúrese de que el tejido sin el ganglio linfático se mantiene en la misma posición vertical cuando se transfiere al casete.
- Coloque el cassette en un recipiente de xileno hasta 2 h antes de colocarlo en el procesador de tejidos.
NOTA: Se recomienda procesar las muestras el mismo día en que se colocan en el cassette. La inmersión prolongada en xileno no ha sido probada. - Cargue el número máximo de casetes en el procesador de tejidos a mano.
- Antes de comenzar, programe todos los reactivos que se utilizarán para este proceso en la lista de reactivos del procesador. Para automatizar el movimientoDe una estación a la siguiente, utilice las opciones del menú y cree un nuevo programa. Cuando se hayan completado todos los pasos, seleccione 'OK' para continuar.
NOTA: El procesador permitirá la revisión de todos los detalles de la estación antes de comenzar.- Automatizar el procesador para empapar los cassettes en xileno durante 30 minutos a 37 ° C, seguido por un segundo remojo en xileno fresco en las mismas condiciones. Automatizar el procesador para eliminar los cassettes de la solución de xileno y transferir los tejidos a la siguiente estación que contiene una mezcla de parafina de xileno: fundido 1: 1, fijada a 60 ° C, durante 30 min.
NOTA: El procesador transferirá los cassettes a una nueva cámara que contenga parafina fundida durante 1 h. Después de 1 h, las muestras se transferirán automáticamente a una nueva cámara de parafina fundida fresca y se procesarán durante 2 h adicionales. Ambos pasos se llevan a cabo a 60ºC. - A continuación, el procesador transfiere las cassettes a la estación que contieneFfin durante 1 h. A continuación, las muestras se transfieren automáticamente a la estación final de parafina fundida fresca y se procesan durante 2 h adicionales. Ambos pasos se llevan a cabo a 60ºC.
- Automatizar el procesador para empapar los cassettes en xileno durante 30 minutos a 37 ° C, seguido por un segundo remojo en xileno fresco en las mismas condiciones. Automatizar el procesador para eliminar los cassettes de la solución de xileno y transferir los tejidos a la siguiente estación que contiene una mezcla de parafina de xileno: fundido 1: 1, fijada a 60 ° C, durante 30 min.
4. Incorporación del tejido mamario procesado
- Coloque los casetes en el tanque de retención de parafina de 58 ° C de la estación de empotramiento hasta que esté listo para incrustar el tejido en el molde.
- Retire la cubierta del casete para determinar el mejor tamaño de molde para el tejido. Asegúrese de que el molde es lo suficientemente grande como para acomodar el tejido, y dejar suficiente espacio para tener un borde libre de tejido de parafina alrededor del perímetro.
- Añadir 3-4 mm de parafina fundida en el molde y orientar la superficie de montaje mamaria total, que era adyacente a la parte inferior de la corredera de vidrio y la parte inferior de la casete, hacia arriba en el molde.
- Transferir el molde a una placa de enfriamiento y ajustar rápidamente el tejido según sea necesario para que esté paralelo al molde bOttom
NOTA: Una vez que la parafina se endurezca, el tejido se asegurará en su lugar. - Usando fórceps calientes, coloque la parte inferior etiquetada del casete encima del molde; Presione firmemente con la pinza.
- Agregue parafina fundida adicional al molde en un movimiento continuo para cubrir el casete entero. Mueva el molde de la placa caliente a una placa fría para completar el endurecimiento del bloque.
- Retire el bloque del molde cuando la parafina se solidifica completamente para evitar grietas o burbujas de aire.
NOTA: Guarde los tejidos embebidos en parafina a temperatura ambiente hasta que estén listos para seccionar.
5. Seccionando el tejido mamario embebido en parafina en el micrótomo
- Antes de seccionar, incubar los bloques de parafina a -20 ° C durante 1 h.
NOTA: Habrá un medio de montaje residual en el bloque del tejido original de cubreobjetos cubierto. El enfriamiento del bloque mejora la sección de los bloques y la cinta. - Prepare el micrófonoRotome girando el baño de agua, conteniendo agua destilada fresca, y ajustar la temperatura a 42-45 ° C. Coloque una cuchilla fresca de bajo perfil sobre el micrótomo y póngala a 4 μm.
NOTA: La calidad de la sección se reduce con secciones más gruesas de 4 μm debido a la presencia de medio de montaje residual en el tejido. - Inserte el bloque en el micrótomo con la cera mirando hacia la hoja y alineada con el plano vertical. Luego, humedezca una sección de gasa en agua fría y colóquela en el bloque durante varios minutos.
- Sección del bloque girando la rueda grande en un movimiento de las agujas del reloj, en combinación con la rueda avanzada gruesa, hasta que se obtiene una cara completa o una sección representativa del bloque.
NOTA: El tejido es delgado debido a la eliminación de xileno durante todo el proceso de montaje. Alinee el bloque correctamente con la cuchilla para minimizar el número de cortes en la obtención de una sección representativa. - Elige la cintaCon cuidado, flotar cuidadosamente la cinta en el baño de agua caliente (45 ° C) (preparado de antemano), permitir que las arrugas de los tejidos para disipar y cuidadosamente flotar una sección sobre un portaobjetos de vidrio limpio.
- Coloque los portaobjetos en posición vertical sobre una rejilla de secado para eliminar el exceso de agua. Incubar las diapositivas en una caja de diapositivas ligeramente abierta durante la noche a 37 ° C.
6. Manchado manual y automático de los tejidos mamarios seccionados
- Antes de la tinción, los portaobjetos se almacenan a temperatura ambiente.
- Para la tinción automatizada, seleccione H & E de las opciones de manchas en el menú principal. La desparafinización, la tinción y la deshidratación se completan en el tintero automatizado. Utilice un medio de montaje y una cubreobjetos para montar las secciones.
- Si mancha manualmente las diapositivas, desparafinar las secciones sumergiendo las diapositivas en xileno durante 5 min. Se transfiere a xileno fresco y se repite durante 5 min.
- Rehidratar las diapositivas sumergiéndolasDos veces en etanol al 100% durante 3 min cada uno, seguido de dos repeticiones en etanol fresco al 95% y dos lavados separados en 1 x tampón de lavado a 5 min cada uno.
- Enjuague los portaobjetos en agua destilada.
- Añadir las diapositivas a la hematoxilina durante 1-2 min. Retire los portaobjetos y enjuáguelos con agua corriente durante 5 min.
NOTA: Filtre la hematoxilina antes de cada uso. - Coloque las diapositivas en ácido acético glacial al 1% durante 30 s para promover la diferenciación del color y luego enjuague con agua corriente del grifo durante 1 min.
- Añadir diapositivas a 1X PBS durante 30 s a 1 min para azul de las secciones de tejido, seguido de un 5 min enjuague en agua del grifo y luego en 95% de alcohol durante 15 - 20 s.
- Contar con solución de eosina durante 30 s a 1 min. Después de esto, deshidratar dos veces las láminas en etanol fresco al 95%, seguido de dos repeticiones frescas en etanol al 100%. Realizar cada lavado durante 5 min.
- Borrar las diapositivas en xileno, con dos cambios en xileno durante 5 minutos cada uno.
- CubreobjetosLa sección de tejido con el medio de montaje y seque durante toda la noche a temperatura ambiente.
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Representative Results
Este método es eficaz para ayudar con los diagnósticos que de otro modo podrían haberse perdido si la sección contralateral original de H & E de la almohadilla mamaria no mostraba ningún cambio histológico. Sin embargo, el resultado sólo será útil si se toma cuidado durante la preparación inicial de montaje completo, así como durante la preparación del tejido para la evaluación histológica. La incrustación de parafina proporcionará protección y ayudará a preservar el tejido para futuras secciones.
Para determinar el grosor ideal del tejido mamario, se prepararon secciones de 4 μm y 6 μm. Hemos probado profundidades que fueron mayores que el margen de error de ± 1 μ m en el microtome. Las secciones de un espesor de 6 μm ( Figura 1A ) eran muy densas con células compactas. En general, las diapositivas carecía de detalles celulares distintos que serían necesarios para hacer un identificador adecuadoCión. El grosor óptimo fue de 4 μm ( Figura 1B ). Estos tejidos proporcionaron los mejores resultados, donde las áreas epiteliales y estromales y los tipos de células correspondientes se distinguieron fácilmente.
Se utilizaron diapositivas de un gran estudio en curso para ilustrar la facilidad y utilidad de este método. En varios casos, se encontró que la sección original de H & E de descendientes CD-1 de 14 meses de edad virgen femenina tenía hallazgos contradictorios en comparación con la montura total mamaria contralateral del mismo animal. Las lesiones eran evidentes en todo el montaje, pero no pudieron identificarse sin más secciones y tinción. Se eligieron muestras de dos animales diferentes como casos representativos. En ambos casos, se utilizó una única sección para la tinción, pero se hicieron varios cortes hasta que se obtuvo una sección representativa. Se necesitaron muy pocos cortes para obtener una sección representativa, ya que las preparaciones anterioresSt de la almohadilla de grasa, dejando la glándula muy delgada en comparación con una glándula mamaria originalmente preparado para la inclusión de parafina, que está rodeado por una almohadilla de grasa gruesa. La Figura 2 A y la Figura 3 A ilustran secciones histológicas de las glándulas que se evaluaron como normales. Ambas glándulas muestran estructuras ductales rodeadas por una población robusta y homogénea rica en adipocitos. Cada conducto está revestido por una sola capa de células epiteliales cuboidales simples y es mantenido por una segunda capa de células basales, compuesta principalmente de células mioepiteliales, pero también abarca poblaciones de células madre y progenitoras. Las preparaciones completas contralaterales representativos (Figuras 2B y la Figura 3 B) demostraron conductos y estroma con un aumento de la opacidad. Sin embargo, fue difícil determinar si la opacidad fue el resultado de alteraciones hiperplásticas, inflamatorias o neoplásicas conUt con una sección de H & E que podría proporcionar detalles celulares distintos.
Los montajes enteros contralaterales de los mismos animales se usaron para implementar el método descrito aquí y se pueden observar en la Figura 2 C y D y en la Figura 3 C y D. Las muestras de la Figura 2 C y D fueron diagnosticadas como inflamación perivascular debido al aumento del número de linfocitos que estaban presentes alrededor de un vaso sanguíneo grande en la sección de glándulas mamarias. Para el segundo caso, la arquitectura lobular de la glándula mamaria se mantuvo pero se agrandó multifocalmente por el aumento del número y el tamaño de los alvéolos y conductos normales (hiperplasia lobuloalveolar). Las células epiteliales alveolares estaban bien diferenciadas, redondas, a menudo vacuoladas, y formaban una capa concéntrica alrededor de un lumen que contenía típicamente fluido proteináceo. DucSt fueron alineados por las células columnares y eran similares a las células alveolares, con un epitelio bien diferenciado que formó una capa concéntrica. Este fenotipo se observa con mayor frecuencia en las glándulas mamarias de ratones y ratas con embarazo medio. Esto no debe confundirse con las estructuras lobuloalveolares en las glándulas mamarias de ratas macho adultas 8 . En la glándula mamaria masculina adulta, los alvéolos son prominentes y los conductos son infrecuentes, pero los alvéolos y los conductos están revestidos de epitelio estratificado, con células cubitales altas y vacuoladas hasta cubitales cortas.
Figura 1 : Espesor recomendado para el montaje completo de glándulas mamarias de ratón en secciones de H & E. A) 6 mu m y B) 4 mu m. Las resoluciones de las estructuras de la glándula mamaria no fueron óptimas para la evaluación histopatológica utilizando el espesor (6 - & #181; m), por lo que se recomienda la sección de 4 μm. Esta figura se ha modificado de Tucker et al. 9 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Montaje completo de la sección de H & E de la inflamación perivascular. Esta imagen es una glándula mamaria de ratón que se recogió en diestrus. A) Sección glándula mamaria H & E fijada con formalina sin alteraciones histopatológicas. B) Sección de montaje total contralateral, con áreas de mayor opacidad (área en caja). C) Aumento de 20x de una sección de H & E de un montaje entero mamario (área encajonada). Los grupos de células mononucleares rodearon el vaso sanguíneo y se extendieron en el tejido adiposo circundante. D) ThLa ampliación de 40x de una sección H & E de un montaje completo mamario (área en caja) muestra con mayor detalle que la mayor parte de la población mononuclear consiste en linfocitos y destaca la gravedad de la inflamación perivascular. Esta figura se ha modificado de Tucker et al. 9 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Montaje completo a la sección de H & E de hiperplasia alveolar lobular . Esta imagen es una glándula mamaria de ratón que se recogió en diestrus. A) Sección glándula mamaria H & E fijada con formalina sin alteraciones histopatológicas. B) Sección de montaje total contralateral con mayor opacidad en las áreas ductal y estromal (en cajaun). C) Aumento de 20x de una sección de H & E de un montaje entero mamario (área encajonada). La arquitectura lobular se mantuvo pero se agrandó multifocalmente por el aumento del número y el tamaño de los alvéolos y conductos normales (hiperplasia lobuloalveolar). D) La ampliación de 40x de una sección de H & E de un montaje entero mamario (área encajonada) revela que los lobules agrandados contienen un número creciente de alvéolos y de conductos que son alineados por las células epithelial bien-diferenciadas, vacuolated-frecuentes, que forman los lúmenes que contienen Fluido proteináceo. Esta figura se ha modificado de Tucker et al. 9 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El montaje completo de la glándula mamaria es una poderosa herramienta que puede usarse para ilustrar el desarrollo mamario normal y las alteraciones morfológicas que pueden surgir y persistir después de la exposición a químicos, incluyendo los disruptores endocrinos. Cuando se evalúan conjuntamente un conjunto completo y una sección de H & E del mismo animal, pueden proporcionar una instantánea visual precisa de las primeras alteraciones, que pueden progresar hacia un estado más enfermo.
La capacidad de obtener esta información útil radica en asegurar que se toma cuidado para preservar y no comprometer la morfología glandular al retirar el tejido. Mientras que el roedor tiene varios sitios de la glándula mamaria ubicados bilateralmente a lo largo de la pared dorsal, se recomienda recoger la 4ª y 5ª glándulas para minimizar la recuperación del tejido muscular. La zona de unión del pezón y el ganglio linfático también deben estar presentes, ya que sirven como marcos morfológicos útiles. La glándula también se debe esparcir y estirarA través de una superficie plana ( es decir, una diapositiva de cristal, cartulina o tela) para imitar de cerca la estructura natural del tejido in situ . Las anormalidades dentro de la glándula mamaria generalmente no son visibles hasta después de que la glándula se haya desgrasado en xileno o haya sido manchada con carmín. A diferencia del tejido mamario que se preparó originalmente para el corte histológico, un soporte completo retirado del vidrio para su inclusión en parafina será extremadamente delgado y frágil. Las impresiones de fórceps y las lágrimas en los tejidos deben ser evitadas, ya que posiblemente alterarán la morfología celular y dificultarán las evaluaciones histopatológicas del producto final.
Una vez que todo el soporte ha sido embebido en parafina, antes de seccionar, se recomienda dejar que los bloques se incuban a -20 ° C durante 1 h. Este paso mejora la capacidad para obtener una sección de tejido representativa óptima en una cinta. Seccionamiento del tejido a 6 μm ( Figura 1A ) 9 Figura 1B ] 9 , todas las características celulares, incluyendo el tejido epitelial y los infiltrados estromales circundantes, fueron fácilmente identificados. También debe observarse que, aunque estas secciones estaban previamente teñidas con carmín, la mancha no era visible después de la sección y no interfirió con la tinción de H & E. Por lo tanto, no era necesario un paso de eliminación de tinción en el protocolo. Aunque las secciones de tejido se tiñeron únicamente con H & E, se espera que con modificaciones menores, otras tinciones histoquímicas y posiblemente inmunohistoquímicas podrían ser aplicables una vez que se complete la sección. Sin embargo, estaba más allá del alcance de este protocolo y requerirá más investigación para determinar las condiciones óptimas para estas manchas.
Este procedimiento se desarrolló porque observamos discrepancias entre los pacientes queLe monta y contralateral H & E manchado glándulas mamarias de las mismas secciones del mismo animal. Existen protocolos mamarios similares 6 , 10 ; Sin embargo, los procedimientos no fueron detallados ni fáciles de seguir. Esos métodos establecieron una base para el desarrollo de nuestro protocolo. Morfología normal de las glándulas se observó en el H & E teñidas secciones de tejido ( Figura 2 A y Figura 3 A ] 1 , mientras que el conjunto complementario monta reveló numerosos anormales características morfológicas ( Figura 2 B y Figura 3 B ) [ 9] . Mediante la realización de histología en los montajes en su conjunto, podríamos clasificar las características anormales. Por ejemplo, la inflamación perivascular y la hiperplasia lobuloalveolar se identificaron en dos casos separados que fueron dispares en comparación conE hallazgos de H & E observados en los lados contralaterales ( Figura 2 C y D y Figura 3 C y D ) 9 .
A juicio de los autores, no hay informes conocidos de discrepancias en la glándula mamaria similares a los observados en nuestro estudio en curso. Sin embargo, esto puede ser debido a problemas de diseño experimental en lugar de la falta de ocurrencia, ya que la glándula mamaria a menudo sólo se recogen para una aplicación o análisis que no implica la morfología, como RT-PCR o Western blots. Sin embargo, muchos experimentos incorporan múltiples aplicaciones que requieren una cantidad adecuada de tejido para cada punto final. Las glándulas inguinales son la opción preferida para montajes enteros y aplicaciones aguas abajo, ya que rara vez tienen el tejido circundante contaminante como las glándulas torácicas ( es decir, la contaminación muscular) y porque los ganglios linfáticos mamarios inguinales proporcionan valorPuntos de referencia para la orientación y la comparación a través de las glándulas. Por lo tanto, decidir qué glándula y cuánto de la glándula se dedicará a cada aplicación influirá en la precisión de la detección. La priorización para el uso de la glándula mamaria debe ser para: 1) un montaje completo compuesto de la totalidad de las glándulas 4ª y 5ª , 2) histología de la 4ª glándula contralateral que contiene algún ganglio linfático para uso como hito y 3) La 5ª glándula contralateral (sin ganglio linfático contaminante) para aplicaciones aguas abajo ( es decir, ARN, ADN y proteína). Si una anormalidad es visible en la necropsia, un montaje completo debe tomar preferencia para la recolección histológica.
Como con cualquier protocolo, hay limitaciones que lo acompañan; La necesidad de destruir permanentemente todo el soporte durante la sección y tener un tejido limitado para uso en análisis alternativos, por ejemplo. Por lo tanto, le recomendamos documentar ampliamente montajes enteros con un escritorio sCanner para producir imágenes digitales para futuros análisis y referencia. Además, si la tinción no ocurrirá dentro de un mes, limite el número de secciones cortadas para conservar el tejido para cualquier análisis futuro. Los beneficios de este montaje completo para el método de sección H & E superan las limitaciones, de modo que puede aplicarse universalmente a estudios mamarios que involucran múltiples disciplinas, especialmente la toxicología. Varios estudios que utilizan sustancias químicas con efectos endocrinos conocidos han incluido una versión modificada de este protocolo, lo que demuestra su aplicabilidad 11 , 12 , 13 . Los hallazgos de estos estudios pueden ayudar a reducir las posibilidades de un falso negativo en las pruebas químicas, pero también pueden proporcionar información nueva o adicional que se puede utilizar para las decisiones regulatorias y de evaluación de riesgos.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses conflictivos que declarar en relación con la investigación, autoría y / o publicación de este artículo.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Pam Ovwigho, Tenette Jones y Natasha Clayton, NIEHS, por su experiencia técnica y apoyo con este proyecto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-100 | mounting media for coverslipping whole mounts and H&E sections |
| Leica automated processor | Leica Biosystems | Model # ST5020 | |
| HM 355S Automatic Microtome | Thermo Fisher Scientific | 905200 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | EM-400 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | electrostatically charged |
| Fisher Finest 24x60x1 | Thermo Fisher Scientific | 12-548-5P | coverslips |
| Varistain Gemini ES Automatic slide stainer | Thermo Fisher Scientific | A78000014 | |
| Sta-On | Leica Biosystems | 3803107 | liquid adhesive; used in water bath at sectioning |
| Modified Harris Hematoxylin 72711 | Richard-Allan Scientific (Part of Thermo Scientific) | 72711 | |
| Eosin | Leica Biosystems | 3801600 | |
| Lithium Carbonate | SkyTech Laboratories | LCQ500 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38-500 | needed in Carnoy's fixative |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4440-04 | needed in Carnoy's fixative |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505001050000 | needed in Carnoy's fixative and washing slides |
| 95% Ethanol | The Warner Graham Company | 6505011137320190 | |
| Carmine Alum | Sigma-Aldrich | C1022-25G | |
| Aluminum potassium sulfate dodecahydrate, Sigma Ultra | Sigma-Aldrich | A7210-500G | |
| Automation wash buffer, 20X | Biocare Medical | TWB945 |
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