Summary
Her rapporteres en protokol til udvikling af et tredimensionalt (3-D) system fra humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) kaldet serumfri embryoidkrop (SFEB). Denne 3-D model kan bruges som en organotypisk skivekultur til modellering af human kortikale udvikling og til fysiologisk forhør af udvikling af neurale kredsløb.
Abstract
Selv om en række in vitro- sygdomsmodeller er blevet udviklet ved hjælp af hiPSC'er, er en begrænsning, at disse todimensionale (2-D) systemer ikke repræsenterer den underliggende cytoarkitektur og funktionelle kompleksitet hos de ramte individer, der bærer mistænkte sygdomsvarianter. Konventionelle 2-D-modeller forbliver ufuldstændige repræsentationer af in vivo- lignende strukturer og absorberer ikke tilstrækkeligt hjernens kompleksitet. Således er der et voksende behov for flere 3-D hiPSC-baserede modeller, der bedre kan rekapitulere de cellulære interaktioner og funktioner set i et in vivo system.
Her rapporteres en protokol til udvikling af et 3-D system fra udifferentierede hiPSC'er baseret på serumfri embryoidkrop (SFEB). Denne 3-D model afspejler aspekter af en udviklende ventraliseret neocortex og muliggør undersøgelser af funktioner, der er integrerede i levende neurale celler og intakt væv som migration, forbindelse, kommunikation og matteARIGHED. Specifikt demonstrerer vi, at SFEB'erne ved hjælp af vores protokol kan blive forhørt ved hjælp af fysiologisk relevante og højindholdede cellebaserede analyser, såsom calciumbilleddannelse og multi-elektrode array (MEA) optagelser uden kryosektion. I tilfælde af MEA-optagelser demonstrerer vi, at SFEB'er øger både spikesaktivitet og netværkssprængningsaktivitet under langvarig dyrkning. Denne SFEB-protokol giver et robust og skalerbart system til undersøgelse af udvikling af netværksdannelse i en 3-D-model, der fanger aspekter af tidlig kortikal udvikling.
Introduction
Vi har tidligere rapporteret et 3-D-model system, der genereres af patient-afledte humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er), der recapitulerer nogle aspekter af tidlig cortical network development 1 . Denne 3-D-model, et serumfrit embryoidlegeme (SFEB), forbedres ved tidligere simple aggregering hiPSC-modeller 2 , 3 . En voksende arbejdsgruppe afslører, at 3-D-strukturer som vores SFE'er, omtrentlige aspekter af neural udvikling, der almindeligvis observeres in vivo og på et tidligere tidspunkt end observeret i 2-D-dimensionelle (2-D) / monolayer hiPSC-modeller 4 , 5 . Indledende undersøgelser har været fokuseret på den selvorganiserende kompleksitet af 3-D-legemer uden at demonstrere deres fysiologiske kompleksitet 2 .
Protokollen beskrevet her er blevet anvendt på utifferentierede hiPSC'er afledt af fibroblaster og Perifere blodmononukleære celler (PBMC'er). Disse celler opretholdes på y-bestrålede museembryonfødere (MEF'er). Disse hiPSC kolonier rengøres manuelt af spontant differentierede celler, enzymatisk høstet og resuspenderet i medium indeholdende Rho-Kinase inhibitor Y-27632 (ROCKi). Ikke-differentierede hiPSC'er udsættes for dissociation og centrifugering, inden de overføres til V-bundplader med 96-brønd med lav vedhæftning. Efter plating initieres neurale induktion ved anvendelse af dobbelt SMAD-hæmning (SB431542 og LDN193189 sammen med dickkopf 1 (DKK-1)) for at drive en anterior-frontal forebrain neuronal-skæbneafledning 6 . Efter 14 dage overføres SFEB'erne til cellekulturindsatser i en 6-brønds plade. Når de overføres, begynder de runde SFE'er at sprede og tynde, samtidig med at de opretholder lokale netforbindelser, som det ofte observeres i hippocampale organotypiske skivekulturpræparater under anvendelse af lignende cellekulturindsatser 1 ,Ss = "xref"> 7.
Brugen af en SFEB-baseret 3-D-platform i dette format er tilgængelig for den effektive produktion af kortikale netværk, som kan blive forhørt ved anvendelse af cellebaserede fysiologiske analyser, såsom calciumbilleddannelse eller elektrofysiologiske analyser, såsom enkeltcelleoptagelser eller multielektrodeopstilling (MEA ) 1 . Selv om 3-D-systemer bærer markørerne for tidlig cortical udvikling, har andre undersøgelser vist, at disse 3-D-legemer kan kræve længere inkubationstider for at tillade det iboende langsommere tempo i udvikling af humane væv 8 . Denne SFEB-protokol genererer succesfuldt 3-D SFEB'er fra utifferentierede hiPSC'er, som fanger aspekter af den tidlige udvikling af cortex.
SFEB'ernes potentiale til at modellere netværksabservationer i neurologiske lidelser er en styrke i dette system. HiPSC'erne afledt af patientvæv kan dyrkes til celler i nervesystemet, der er underkastet æselAys relateret til cellebiologi såvel som samtidig genekspression. Humane iPSC'er bruges til at fastslå den genetiske profil for store grupper af individer med varierende neurologiske lidelser med komplekse etiologier som autismespektrumforstyrrelse (ASD), skizofreni 9 , Rett syndrom 10 og Alzheimers sygdom 11 , 12 . Indtil for nylig var iPSC-modeller typisk monolagspreparater, der, selvom de var dygtige til at evaluere molekylære interaktioner, var utilstrækkelige til at dechiffrere de komplekse cellulære interaktioner set in vivo . Dyrmodeller har været standard erstatning for genskabelse af hele orgelplatformen. Disse dyremodeller er plaget af dårlig oversættelse af fund og har begrænset evne til at replikere menneskelige genetiske profiler identificeret ved store genetiske screeningsundersøgelser. Udviklingen af 3-D-systemer fra iPSC'er tilføjer således et nødvendigt lag af kompleksitet hos menneskerSygdomsmodellering 13 , 14 . Det næste trin for 3D hiPSC platforme er at imødekomme de store krav til høj gennemputs screening ved hjælp af cellebaserede analyser 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering af neurale progenitorceller
- Vedligeholdelse af hiPSC'er afledt af fibroblaster og PBMC'er i 6-brøndsplader på et y-bestrålet museembryonføder (MEF) cellelag i humant iPSC-medium suppleret med små molekyler (se materialetabellen).
BEMÆRK: Daglig vedligeholdelse er en ændret version af tidligere rapporterede procedurer 1 , 16 .- Plad 6 x 10 5 MEF'er på hver brønd i en 6-brønds vævskulturkvalitetsplade i 300 μl / brønds anbefalet medium (efter producentens protokol).
- Efter 48 timer udskiftes MEFs medium med 300 μL / brønd hiPSC medium i 1 time, før der tilsættes hiPSC'er.
- Tør hurtigt hiPSC'er i et 37 ° C vandbad og tilføj langsomt 1 ml hiPSC medium. Overfør hiPSC'erne og mediet til et 15 ml konisk rør. Tilsæt medium for at bringe det samlede volumen til 5 ml. Centrifuger i 4 minutter ved 129 xg, aspirer supernatenNt, suspender forsigtigt pelleten i 1 ml hiPSC medium med ROCK inhibitor ved 1: 1000 koncentration.
- Plate cellesuspensionen (typisk podet ved 300.000 celler / brønd) på MEF cellelaget og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed.
- Overvåg iPSC kultur tæt ved hjælp af et lysmikroskop. Efter 48 timer fjerner du kulturer, der har ujævne kanter, er vokset til at blive cystiske eller vises gulbrune under lysmikroskopet for at minimere spontan differentiering.
BEMÆRK: Efter 7 - 10 dage skal hiPSC kolonier danne. Kolonier bør være runde med klart definerede grænser og ensartede celle densiteter og uden løst pakket ikke-ensartede celler. - Vælg manuelt runde hiPSC kolonier for at fjerne kulturen af spontant differentierede celler. Udvid kolonierne ved at placere dem på friske MEF-lag. Udvid 1: 3 hver 7 dage, når kulturer nær konfluens og frys 1 , 16 .
- Efter ekspansion og frysning af celler (til backup), dyrk hiPSC kolonier på plader, indtil de når 50 - 75% sammenløshed.
- Syv dage efter plating, brug mild enzymatisk behandling (5-10 minutter med 300 μL enzymopløsning) og forsigtig triturering (2-4 gange med en 1000 μL pipet) til høst og forberedelse af hiPSC'er til differentiering af neurale precursorceller.
- Centrifuger cellesuspensionen ved 129 xg i 4 minutter, aspirerer supernatanten og resuspenderer pelleten i 5 ml humant iPSC-medium. Overfør cellesuspensionen til en 0,1% gelatinecoated 5 cm cellekulturskål i 1 time ved 37 ° C for at eliminere MEF'er og for at maksimere hiPSC udbyttet. Overfør mediet (med ikke-vedhæftende celler) til en anden 5 cm gelatinecoated skål.
- Overfør de ikke-klæbende celler til et 15 ml centrifugerør ved hjælp af en overførselspipette. Skyl pladerne forsigtigt med 3 ml medium og tilsæt det til 15 ml rør.
- Centrifug celle suspensionen ved 129 xg i 4 min, aspirere superNatant, og forsigtigt resuspendere pelleten i medium. Bestem celleantalet ved hjælp af en automatiseret celle tæller. Plad 9.000 celler / brønd i en 96-brønds lav vedhæftning V-bundplade.
- Centrifuger pladen ved 163 xg i 3 minutter. Inkubér pladen ved 37 ° C, 95% fugtighed og 5% CO2. Brug en pipette, skift 50% medium hver anden dag ved at fjerne halvdelen af mediet og udskifte det med frisk kemisk defineret differentieringsmedium 1 (DM1, Figur 1 , Materialebord) i 14 dage.
2. Induktion af serumfri embryoidlegeme (SFEB) ( figur 2 )
- Placer 40 μm cellekulturindsatser i 6-brøndsplader og tilsæt 1 ml DM1-medium mindst 1 time før tilsætning af aggregater.
- På dag 14 overfører aggregaterne med 20 μl medium ved anvendelse af en 200 μl bred mundspids på 40 μm cellekulturindsatser og ændrer mediet til DM2.
7 , 17 , 18 .- Overfør 4-6 aggregater til en cellekulturindsats og tillade tilstrækkelig plads mellem aggregaterne. Fjern så meget overskydende opløsning som muligt ved brug af en fin pipettespids ( fx 200 μL tip).
BEMÆRK: Det er acceptabelt at forstyrre SFEB kort, da de vil bevæge sig på cellekulturindsatsen, da opløsningen fjernes fra omkring SFEB'erne. - Vedligeholde kulturerne i 1 ml DM2 ved 37 ° C, 95% fugtighed og 5% CO2. Brug en pipette, skift 75%Medium hver anden dag ved at fjerne tre fjerdedele af mediet og erstatte med tre fjerdedele frisk medium. Fjern for eksempel 750 μl medium og tilsæt 750 μl frisk medium.
- Overfør 4-6 aggregater til en cellekulturindsats og tillade tilstrækkelig plads mellem aggregaterne. Fjern så meget overskydende opløsning som muligt ved brug af en fin pipettespids ( fx 200 μL tip).
- Efter 14 dages kultur, skift til DM3 medium med 75% medium ændring hver anden dag og i yderligere 16 dage.
- For at opretholde SFEB'erne på cellekulturindsatser efter 30 dage, skift mediet hver anden dag i 60, 90 og 120 dage.
BEMÆRK: SFEB'erne vil vokse til ca. 1000 μm i diameter og er typisk 100-150 μm tykke 1 .
3. Bestemmelse af SFEB-sammensætning
- Løsn SFEB'erne fra indsatsen ved forsigtigt pipetteringsmedium ved hjælp af en 200 μl bred mund pipette tip. For at overføre SFEB'erne skal du bruge en bred mund pipette tip til forsigtigt sugning af kropene i pipettespidsen. Efter påfyldning af SFEB i pipettespidsen overføres man forsigtigt til 12-brøndsplader og vaskes med 300 μl fosfatbufret saltopløsning(PBS) pr. Brønd.
BEMÆRK: SFEB'er suspenderes i opløsning i 12-brøndspladerne. Dette er vigtigt for at muliggøre fuld penetration af fixativet, blokeringsopløsningen og antistoffer. Hvis der bruges flere SFEB'er til farvning, kan der tilsættes op til 10 SFEB'er pr. Brønd på en 12-brønds plade. Dette vil spare løsninger og antistoffer. - Fix SFEB'er med 300 μL pr. Brønd 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur i 30-45 min. Vask faste SFEB'er to gange med 300 μL PBS, 3-5 min hver vask.
Forsigtig: Brug passende personlige værnemidler ved håndtering af paraformaldehyd.
BEMÆRK: Probe for immunoreaktivitet til markører til bestemmelse af modenhed, celletype mv. Til markering af neuroner i dette studie blev kylling-Tuj1 anvendt ved 1: 500, for yderligere markører henvises til tabel 2 og referencer 1 , 16 . - Permeabilisere og blokere med 0,1% Triton-X100 i PBS og 10% normalt æselserum (blokeringsopløsning; 300 μm; L pr. Brønd) i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern blokeringsopløsningen og behandle SFEB'er med 300 μL primære antistoffer i blokerende opløsning. Inkubér ved 4 ° C natten over. Vask SFEB'er tre gange (3-5 minutter pr. Vask) i 300 μl PBS indeholdende 0,1% Triton-X.
- Forbered sekundære antistoffer 1: 1000 i blokeringsopløsning. Inkubér SFEB'er i 1 time ved stuetemperatur med sekundære antistoffer. Vask SFEB'er med 300 μL PBS, 3 gange i 3-5 minutter hver.
BEMÆRK: På dette stadium kan SFEB'er forberedes til billeddannelse. - Til billede, pipetter SFEB'er på et glasskinne med en pipette med bredboring. Fjern overskydende opløsning omkring SFEB ved forsigtig sugning.
BEMÆRK: Til lignende farvningsforhold kan flere SFEB'er anbringes på samme glasskinne. - Tilsæt en dråbe monteringsmedium på SFEB'erne, læg en glasdæksel, og tryk forsigtigt for at sikre, at der ikke er luftbobler. Lad monteringsmediet hærde og fortsætte til billeddannelse og kvantificering (trin 3.8).
- Udfør cellekvantificering ved at tage flere interessante regioner (ROI) over SFEB og bruge en z-stack kombineret med et maksimalt projektionsbillede gennem hvert ROI på et standard konfokalmikroskop som beskrevet i referencerne 1 , 16 .
BEMÆRK: Hele SFEB'er kan kvantificeres ved hjælp af billedbaseret fliser (se referencer 1 , 16 for detaljer). Da SFEB'erne er tynde til ca. 100 μm, er der minimal spredning af lys i vævet, og der er således ikke behov for 2-foton mikroskopi. Tidligere anvendelser af denne protokol med fibroblast-afledte iPSC'er producerede et SFEB-skæbne-kort, der afslørede kompleks og forskellig struktur med subpopulationer af interneuroner med transkriptionelle identiteter, der lignede CGE og anterior forebrain phates 1 , 16.
4. Optagelse af neuronal aktivitet i SFEB'er ved hjælp af MEA'er
- Klargør 12-brønds MEA plader som producentens anvisninger.
- Vask MEA pladerne 3 gange i 5 minutter med sterilt H2O under aseptiske betingelser at rengøre. Vask i 5 minutter med 75% ethanol og derefter med 100% ethanol for at sterilisere pladen.
- Bage pladen inverteret i en ovn i 4-5 timer ved 50 ° C for at fuldføre steriliseringsprocessen.
- Tilsæt 500 μL 0,2% polyethyleniminopløsning (PEI) til hver brønd og inkuber 1 time ved stuetemperatur. Aspirer PEI og vask brøndene 4x med sterilt destilleret H2O Lufttør i hætten natten over.
- Forbered en 20 μl / ml opløsning af laminin i L15 medium og tilsæt 10 μL laminin til midten af hver brønd.
BEMÆRK: Belæg ikke de omgivende reference- og jordingselektroder. - Tilføj sterilt dH2O til de omkringliggende reservoirer for at forhindre medium eller laminin fordampning.Inkubér pladen i 1 time ved 37 ° C.
- Tilsæt SFEB'er (se afsnit 1 og 2) på lamininbelagte MEA-plader ved forsigtigt at suge dem ind i en bred mund pipettespids og overføre dem. Tilsæt 200 pi DM2 medium til hver brønd og inkuberes natten over ved 37 ° C, 95% fugtighed og 5% CO2.
- Tilføje yderligere 200 pi medium efter 24 timer og lad det komme sig i 30 minutter ved 37 ° C, 95% fugtighed, 5% CO2 før aflæsning af pladen.
- Placer MEA-pladen i pladelæser (forvarmet til 37 ° C) for at registrere neuronaktivitet. Optag aktivitet i 10 minutter med den tilhørende MEA recording software. Se reference 19 for detaljer.
- Generere rå data-kontinuerlige strømme og raster-plot af neuronaktivitet ved hjælp af statistisk analyse-software 19 .
BEMÆRK: MEA optagelser tages 7 dage efter SFEB plating. Til denne undersøgelse blev der taget optagelser i 10 minutter for at detektere netværksbrudsaktivitet, conTinuous spor og raster plots. SFEB'er kan opretholdes på lang sigt på MEA-plader og kan optages over længere tid ved brug af miljøstyrede forhold ( figur 6 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SFEB'er dyrket ved hjælp af vores teknik gav væv med morfologiske egenskaber, der ligner en tidligt udviklende cortical subventricular zone fyldt med omfattende Tuj1-positive neuroner såvel som neurale progenitorer ( Figur 3A ). Talrige udviklende kortikale rosetter blev observeret i de ydre lag og indre lag af SFEB ( figur 3B ). Den ydre kant af SFEB ligner en udviklingskortisk plade indeholdende postmitotiske neuroner. Dette understøttes af ekspressionen af Brn2, en markør for neurale progenitorer i de mest ventraliserede ydre kortikale lag. Reelin-positive celler, der kan være Cajal-Retzius-celler eller deres stamceller, som udtrykkes i de ydre lag af den udviklende cortex, observeres også i SFEB'er ( figur 3C ). SFEB'er dyrket ved hjælp af denne protokol-udtryksmarkører i overensstemmelse med en blandet kaudal (CGE) og medial ganglioNic eminence (MGE) oprindelse. Celler, der udtrykker CGE-markør Couptf2 og andre celler, der udtrykker MGE-markør Nkx2.1, kan observeres i kulturerne ( Figur 3D ). Dette kan til dels skyldes brugen af DKK-1 i protokollen, hvilket har vist sig at øge mediale skæbne 20 .
SFEB'er fremstillet ved anvendelse af denne protokol giver både calretinin- og calbindin-positive interneuroner ( figur 4A ) såvel som VGLUT positive excitatoriske neuroner og Tbr1-positive glutamatergiske neurale progenitorer ( figur 4B ). I gennemsnit har vi observeret, at 61% af de samlede celler i SFEB'er er VGLUT positive og 43% er Tbr1-positive ( Figur 4C ). Dette er i overensstemmelse med andre rapporter ved hjælp af lignende protokoller 21 . Derudover kan SFEB'er være genstand for fysiologiske analyser såsom levendecellecalciumbilleddannelse ved anvendelseMarkører som Fluo-4, for at observere neurale netværksfunktioner i et mere fysiologisk relevant miljø ( figur 5 ). SFEB'er kan underkastes MEA-optagelser i lange perioder og vise udvikling af kortikale netværksniveauer ( Figur 6 ).
Figur 1: Skematisk omklare de tidlige trin i forberedelsen af SFEB'er. Efter at iPSC'er er blevet høstet ved hjælp af en enzymatisk dissociation, pletteres de i 96-brønds plader og centrifugeres ved 163 xg i 3 minutter for at inducere hurtig aggregering. Efter 14 dage in vitro (DIV) kan celleaggregater overføres fra 96-brøndsplader via brøndboringspipetter til 6-brønds plader med cellekulturindsats. Venligst klik her til viEn større version af denne figur.
Figur 2: Tidslinje for mellemstore ændringer og faser under SFEB Vækst og Udvidelse. Efter at SFEB'erne er blevet overført til indsatser, går de under to mellemstore ændringer på 14 og 28 dage in vitro (DIV). De høstes typisk til forsøg på DIV 30, 60 og 90. Øvre indsatser viser forskellige faser i denne proces. Skalestænger = 1.000 μm (langt til venstre); 1000 μm (DIV 20); 600 μm (DIV 30); 300 μm (single SFEB). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Generel morfologisk karakteristikTics af SFEB'er vokset ved hjælp af denne protokol. ( A ) Typisk ydre kant af en SFEB, der udtrykker stamcellerne nestin (grøn), den postmittotiske neurale markør Tuj1 (rød) og den nukleare plet (blå). ( B ) SFEB'er viser karakteristiske kortikale rosetter i både de ydre lag (venstre billede) og inderlagene (højre). De udtrykker både stamceller og modne neuronmarkører. ( C ) En repræsentativ ydre kant af en SFEB, der udtrykker den ydre lag / kortikale plade markør Brn2 (grøn) og den udviklende CGE markør Couptf2 (rød). ( D ) SFEB'er fremstillet ved anvendelse af denne protokol repræsenterer ventraliserede neokortiske strukturer som set ved Pax6 (rød) farvning og ekspresmarkører i overensstemmelse med nogle MGE-oprindelser såsom Nxk2.1 (rød). Skalestang = 40 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Billeder af store neuronale celletyper i SFEB'er. ( A ) Nogle neuroner i SFEB'er udtrykker markører i overensstemmelse med kortikale interneuroner, såsom calbindin (grøn, venstre billede) og calretinin (grøn, højre billede). ( B ) SFEB'er viser VGLUT-1 positive glutamatergiske neuroner (rødt, venstre billede) og glutamatergiske stamceller, der udtrykker Tbr1 (rødt, højre billede). Skalestang = 40 μm. ( C ) Typiske udbytter af excitatoriske neuroner, der udtrykker enten VGLUT-1 eller Tbr1 (fejlstang = SEM). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Live-cellekalciumoptagelser. </ Strong> (Venstre billede) Repræsentativ ydre kant SFEB behandlet med Fluo-4, en neuronal calciumindikator. Celler er markeret til måling af spontane calciumtransienter (assorterede farvebokse). (Højre billede) Udvalgte celler, der demonstrerer spontane calciumtransienter markeret med røde kasser (øvre spor) eller grønne kasser (lavere spor). Skalestang = 40 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Multi-elektrode Array-optagelser af SFEB'er. (Top) Repræsentativt billede af SFEB fastgjort til en MEA plade (Scale bar = 100 μm). (Mellem og bund) SFE'er kan optages på MEA over lange perioder og vise modning. (Mellem og nederst; venstre) Et bredt bristekort af 3 SFEB'er udpladet på 3 brønde af en 12-brønd MEA-plade, mørkere farver repræsenterer højere samlet spikeaktivitet, der stiger mellem dag 30 og dag 90. (Mellem og bund; indsatser) Kumulativt aktivitetsoversigt viser en stigning i spidsdensiteten og spidsområdet inden for kortikale netværk i SFEB'er mellem Dag 30 og dag 90. (Mellem og nederst, højre) Råspor (øverste) og helbrønd-raster-plotter (nederste) viser en stigning i antallet af pigge og antallet af udbrud over tid; Indikativ for stærkere netværksdannelse i SFEB'er. Klik her for at se en større version af denne figur.
| antistof | Fortynding | Arter |
| nestin | 0,111111111 | Mus |
| Brn-2 | 0,388888.889 | Kanin |
| VGLUT1 | 0,111111111 | Kanin |
| Pax6 | 0,25 | Kanin |
| Calretinin | 0,180555556 | Kanin |
| calbindin | 0,319444444 | Kanin |
| CoupTFII | 0,180555556 | Mus |
| Nkx 2.1 | 0,180555556 | Kanin |
| Tuj1 | 0,388888889 | Kylling |
| Reelin | 0,388888889 | Mus |
| Tbr-1 | 0,180555556 | Kylling |
| NFH | 0,25 | Mus |
Tabel 1: Antistoffer anvendt i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her tilvejebringer betingelserne for differentiering af en hiPSC-kilde til en 3-D-struktur, som rekapitulerer et tidligt udviklingsstadium af den frontale cortex. Denne procedure giver strukturer, der kan udspørges for elektrofysiologi, samtidig med at den er tilgængelig for mikroskopi. SFEBs endelige morfologi ligner den af organotype hjerneskivekulturer og giver høj kvalitet detaljeret konfokal billeddannelse. Denne protokol kan med succes generere SFEB'er fra både fibroblast og perifert blodmononukleære celleafledte hiPSC'er. SFEB'er fremstillet af perifert blodmononukleærcelleafledte hiPSC'er udviser lignende morfologiske egenskaber som dem, der er dannet af fibroblast-afledte hiPSC'er.
Denne proces, som andre 3-D-systemer, anvender småmolekylære ekstracellulære signaler til styring af beslutningene om cellefæstet. Dette kombineres med de iboende egenskaber ved celle-til-celle kontakt, som skaber et mere realistisk miljø for netArbejdsdannelse og neuronfunktion. Andre rapporter har vist, at den passende kombination af de småcellulære ekstracellulære signaler er tilstrækkelig til sådanne cellefate beslutninger såsom midbrain dopaminerge 8 , 22 og kortikale interneuroner 8 , 16 , 23 . Imidlertid udviser 3-D-systemer en accelereret modningstid sammenlignet med 2-D ækvivalenter 5 . Når der er givet tilstrækkelig tid, har 3-D kulturer vist øget modenhed. Sådanne kvaliteter gør stærke argumenter for brugen af 3-D platforme som SFEB. Den ekstra fordel ved levende mikroskopi af høj kvalitet, sammen med fleksibiliteten i kildematerialet, giver overbevisende argumenter for denne protokol.
Derudover deler SFEB'er, der fremstilles ved hjælp af denne protokol, en række ligheder med andre rapporterede undersøgelser 13 , 24 . Med hensyn til reference 24 forudser denne protokol og den fysiologiske validering af neuronerne den. For eksempel bruger de undersøgelser, der er rapporteret i referencerne 13 , 24 , lignende versioner af dobbelt SMAD-inhibering til at udlede kortikale lignende neuroner og opnår en tilsvarende andel af glutamatergiske neuroner og progenitorer (~ 50%). Derudover har Mariani, J. et al. (Reference 13 ) rapporterer lignende Pax6- og Nestin-farvning som denne protokol på 25-30 dags-point. Kvalitativt ligner farvningsmønstre for Brn2 såvel som ekspression af GFAP-positive astrocytter som beskrevet i reference 24 . Denne protokol har dog en række fordele i forhold til de to almindeligt anvendte organoidmetoder. For det første, Mariani, J. et al. 13 rapporterer udviklingen af Dlx positive interneuroner på dag 50 og conStyrkes kun ved immunfremkaldende metoder. Ved anvendelse af denne protokol produceres Dlx-positive interneuroner på dag 30. Disse interneuroner blev bekræftet som funktionelle ved single-cellelektrophysiologi og enkeltcellet farmakologisk anvendelse af GABA 16 . Derudover hævder forfatterne af 13 funktionel forbindelse af neuroner, men det blev kun bestemt ved anvendelse af farvning. SFEB'er fremstillet ved hjælp af denne protokol er blevet udsat for netværks-elektrode-stimulering og calciumbilleddannelse for at vise, at udvikling af kortikale netværk er forbundet og funktionelt. Pasca et al. 24 sektionen aggregaterne ved hjælp af en kryostat for at opnå optagelser fra organoidlignende strukturer. SFEB'er, der er lavet ved hjælp af denne protokol, behøver ikke sektioner og kan optages direkte, mens de er i indsætningerne 1 . Neuroner optaget fra ikke-sektionerede SFEB'er har vist sig at have aktionspotentialer og hæmmende postsynaptiske potentialer efter sortinG 1 , 16 .
SFEB'er kan fremstilles under anvendelse af både fibroblaster og PBMC'er som udgangsmateriale. Det er også muligt at anvende andre vævstyper, der resulterer i hiPSCs (f.eks. Tandpulp, forhuden, urin) 25 , 26 , 27 , selvom nogle af de små molekyler måske skal ændres for at opnå lignende resultater. For denne protokol er anvendelsen af DKK-1 vigtig ved at køre SFEB mod en ventraliseret skæbne 28 . Denne ventralisering er delvist ansvarlig for differentieringen af interneuroner med CGE-lignende oprindelse 16 . DKK-1 er et dyrt lille molekyle, og dermed kan høje koncentrationer af sonisk hedgehog bruges til at supplere DKK-1 i denne protokol. Koncentrationerne for Wnt-hæmning via DKK-1 skal imidlertid bestemmes empirisk af slutbrugeren. Derudover XAV939, en anden Wnt inhibitoR, kan bruges til at hjælpe med at differentiere sig mod en ventraliseret skæbne, selvom brugen af denne inhibitor vil give væv, der deler transkriptionelle identiteter med MGE 23 .
Ved udviklingen af 3D hiPSC-kultursystemer som de SFEB'er, der er beskrevet i denne protokol, er det vigtigt at huske på, at disse strukturer giver en moderat mængde heterogenitet fra kultur til kultur. Dette skyldes delvis den stokastiske karakter af neuronal differentiering fra iPSC'er og på grund af cellecellekontaktinitiering i SFEB, hvilket resulterer i spontan egen selvorganisering 29 , 30 . Derfor er det vigtigt at fortolke anvendeligheden af denne teknik i forbindelse med heterogenitet. Måder at minimere virkningen af heterogenitet i dette system inkluderer at skabe et stort antal SFEB'er, så de repræsenterer naturlig variation i systemet, der strammer sig til koncentrationen afReagenser og antallet af celler podet i begyndelsen af hver produktionsperiode. Det er kritisk at starte med rene iPSC kolonier og at anvende minimal triturering under det enzymatiske dissociationstrin under iPSC dissociation for at øge celle levedygtighed. Cell levedygtighed efter trituration er en vigtig faktor i at opnå høj kvalitet, konsistente SFEB'er. Som et alternativt fejlfindingstrin kan levedygtigheden kontrolleres efter dissociationen og før centrifugeringstrinnene ved hjælp af trypanblåt, om nødvendigt. Viabilitet og spontan differentiering kan også påvirkes, hvis ROCKi ikke anvendes korrekt under de tidlige dissociation og differentieringsstrin. Brugen af ROCKi og dens trinvise fald under 50% feeds i løbet af de første 7-10 dage er afgørende for konsistente SFEB'er af høj kvalitet.
Derudover er det ofte nyttigt som et valideringstrin for at kontrollere resultaterne i 3D SFEB'er med de observerede i de samme cellelinjer, der er oprettet ved hjælp af et monolagspræparat. UnderstaNding hvordan de to systemer kryds-sammenligner inden for hver eksperimentel kohorte er yderst nyttig til at forstå kompleksiteten af en given sygdomsmodel. Endelig kan SFEB'er anvendes til at sortere og rense cellepopulationer ved anvendelse af fluorescerende aktiveret celle sortering til yderligere undersøgelse i et mere homogent 2D monolagssystem 16 .
Ikke desto mindre er SFEB'er, der oprettes ved hjælp af denne protokol, nyttige til at studere små udviklende kortikale kredsløb. Fremtidige anvendelser af denne teknik involverer multiplekselektrofysiologiske optagelser med højindholdstilgange. Faktisk fremstilles cellekammerindsatser til brug i 96-brønds pladeformat. Disse indsatser kan bruges med SFEB-protokollen beskrevet her i stedet for 6-brøndsindsatserne. For at kunne vise skalerbarhed ved hjælp af denne metode skal SFEB'er oprettes ved hjælp af flere linjer og kloner inden for en given kohort og skal screenes på tværs af et sæt robuste cellebaserede analyser for at lede efter konsistens wiTynde kulturer. For eksempel kan neuronale tal, morfologi og lagudvikling kan analyseres ved anvendelse af et 96-brøndsformat. Ideelt set bør cellebaserede assays kombineres med et elektrofysiologisk analysestof med høj indhold såsom MEA, som også kan skaleres til 96-brønds plader.
Denne SFEB platform har et løfte om at dechiffrere rollen som tidlig cortical netværk udvikling i neurologiske lidelser, især i tilfælde hvor der er en mulig interaktion mellem genetik og tidlig neurale udvikling. Vi har vist, at det kan behandles som en skivekultur som vist i rotte- og musestudier. Nyttige fremtidige undersøgelser, der anvender dette system, bør fokusere på udviklingsmæssig komparativ anatomi og fysiologi mellem in vivo strukturer af musen og SFEB. Disse komparative data ville være meget kraftige i udviklingen af et virkelig translationssystem for narkotikaforskning og grundforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Elizabeth Benevides for korrekturlæsning af artiklen. Vi takker dr. John Hussman og Gene Blatt for deres nyttige diskussioner og kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
