Nous présentons des protocoles pour l'application de notre indicateur de calcium codé génétiquement (GECI) CatchER + pour la surveillance des transitoires rapides de calcium dans le réticulum endoplasmique / sarcoplasmique (ER / SR) des cellules HEK293 et C2C12 du muscle squelettique en utilisant une microscopie à fluorescence en temps réel. Un protocole pour la mesure et l'étalonnage in situ K d est également discuté.
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Article de méthode
Surveillance de la libération de calcium ER / SR avec le Ca ciblé
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les transitoires de calcium intracellulaire (Ca 2+ ) évoqués par des stimuli extracellulaires initient une multitude de processus biologiques dans les organismes vivants. Au centre de la libération de calcium intracellulaire sont les principaux organelles de stockage de calcium intracellulaire, le réticulum endoplasmique (ER) et le réticulum sarcoplasmique (SR) plus spécialisé dans les cellules musculaires. La libération dynamique du calcium à partir de ces organites est médiée par le récepteur du ryanodine (RyR) et le récepteur d'inositol 1,4,5-triphosphate (IP 3 R) avec un remplissage à travers la pompe ATC de calcium ATPase réticulum sarco / endoplasmique (SERCA). Un capteur de calcium génétiquement codé (GECI) appelé CatchER a été créé pour surveiller la libération rapide de calcium de l'ER / SR. Ici, les protocoles détaillés pour la transfection et l'expression du GECI CatchER + amélioré ER / SR ciblé dans les cellules HEK293 et C2C12 et son application dans la surveillance des transitoires de calcium à médiation par pompe IP 3 R, RyR et SERCAS dans les cellules HEK293 utilisant une microscopie à fluorescence est décrite. L'agoniste du récepteur ou l'inhibiteur de choix est dispersé dans la solution de la chambre et les changements d'intensité sont enregistrés en temps réel. Avec cette méthode, on observe une diminution du calcium ER avec une activation de RyR avec 4-chloro-m-crésol (4 cmc), l'activation indirecte d'IP 3 R avec de l'adénosine triphosphate (ATP) et l'inhibition de la pompe SERCA avec cyclopazonium Acide (CPA). Nous discutons également des protocoles pour déterminer le K D in situ et quantifier basal [Ca 2+ ] dans des cellules C2C12. En résumé, ces protocoles, utilisés conjointement avec CatchER + , peuvent provoquer une libération de calcium médiée par les récepteurs à partir de l'ER avec une application future dans l'étude des pathologies liées au calcium ER / SR.
Introduction
Les attributs spatio-temporels des transitoires intracellulaires de calcium (Ca 2+ ) activent diverses fonctions biologiques 1 . Ces événements de signalisation de Ca 2+ sont déclenchés de manière extracellulaire par différents stimuli et contrôlés intracellulairement par l'organelle de stockage principale de Ca 2+ et par de nombreuses pompes Ca 2+ , des canaux et des protéines de liaison Ca 2+ . Les transitoires de Ca 2+ peuvent être modifiés de manière significative à la suite de défauts de modulation du signal, entraînant différentes maladies 2 . E....
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Protocole
1. Préparation de la diapositive
- Placez des lames de microscope en verre de 22 mm x 40 mm dans des boîtes de culture cellulaire de 6 cm, 1 glissière par plat.
- Exposez chaque côté de chaque glissière ainsi que le plat de 6 cm à la lumière ultraviolette (UV) pendant 15 à 20 minutes pour la stériliser dans un capot stérile.
- Couvrir la vaisselle avec des toboggans à l'intérieur avec un parafilm et conserver à 4 ° C jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'emploi.
2. Préparation des supports, des tampons, des solutions et des réactifs
- Préparer 1 L de solution équilibrée de sel de Hank (HBSS....
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Résultats
Cette section illustrera les résultats obtenus en utilisant les méthodes décrites précédemment en utilisant le GECI CatchER + optimisé ER / SR pour surveiller les changements dans ER / SR Ca 2+ à travers différentes voies médiées par les récepteurs.
La figure 1 illustre la vidange ER à travers le RyR stimulé avec 200 μM de 4 cmc. 4 cmc est un agoniste du RyR. L'addition d.......
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Discussion
L'imagerie monocellulaire vivante de sondes fluorescentes, comme CatchER + , est une technique efficace pour analyser des processus complexes de signalisation ER / SR Ca 2+ dans chaque cellule en réponse à des agonistes ou antagonistes de récepteurs. Cette technique est également utile pour l'imagerie en utilisant simultanément plusieurs longueurs d'ondes, telles que nécessaire pour Fura-2 ou pour l'image de CatchER + et Rhod-2 pour surveiller à la fois les variations ER .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Ce travail a été financé par NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant, et une subvention supplémentaire NIH à FR, bourse BB à CM, bourse CDT à RG.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 4-Chloro-3-méthylphénol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR miroir dichroïque | Chroma Technology Corp. | ||
| Adénosine 5&-triphosphate disodique hydrate | de sel Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Chlorure de calcium dihydraté | EMD Millipore | 102382 | |
| Boîtes de culture traitées pour culture tissulaire Corning (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Boîtes de culture traitées pour culture tissulaire Corning (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Acide cyclopiazonique (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Lubrifiant pour valves & Produit d’étanchéité | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) Acide tétraacétique (EGTA) | ACROS Organics | 409911000 ; | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Lunettes de protection 22x40 mm | Fisher Scientific | ; 12-544B | |
| Hanks Sels équilibrés (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, acide libre, biologie moléculaire grade | EMD Millipore | 391340 | |
| Huile à immersion sans autofluorescence | Leica | 11513859 | |
| ionomycine, acide libre | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Leica DM6100B microscope inversé avec une caméra EM-CCD refroidie | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Réactif de transfection | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Réactif de transfection | ThermoFisher | L3000015 | |
| Low Profile Open Diamond Bath Chambre | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| Chlorure de magnésium hexahydraté | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Chlorure de potassium | EMD Millipore | PX1405 | |
| Phosphate de potassium, Phosphate de potassium dibasique | EMD Millipore | PX1570 | |
| Phosphate de potassium monobasique | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Logiciel d’analyse d’images PCI SimplePCI | Hamamatsu | N/A | |
| Bicarbonate de sodium | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Chlorure de sodium | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µ ; m filter | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Polychrome V Lampe au xénon | Till Photonics | N/A | |
| Trypsine (2,5 %), pas de rouge de phénol (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
Références
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish....
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Réimpressions et autorisations
