Summary
En forkortet fraktionering protokol for berigelse af detergent-uopløselige protein aggregater fra postmortem menneskehjernen er beskrevet.
Abstract
I denne undersøgelse beskriver vi en forkortet trinvis fraktionering protokol for berigelse af detergent-uopløselige protein aggregater fra postmortem menneskehjernen. Den ioniske vaskemiddel N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) solubilizes effektivt indbygget foldede proteiner i hjernevæv tillader berigelse af detergent-uopløselige protein aggregater fra en bred vifte af neurodegenerative proteinopathies, såsom Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom og Amyotrofisk lateral sklerose og prionsygdomme. Menneskelig kontrol og AD postmortem hjernen væv blev homogeniseret og aflejret af ultracentrifugering ved tilstedeværelse af sarkosyl at berige detergent-uopløselige protein aggregater herunder patologiske fosforyleres tau, den kernekomponent af neurofibrillary tangles i Annoncen. Western blotting demonstreret differential opløseligheden af aggregerede fosforyleret-tau og de vaskemiddel-opløseligt protein, tidlig Endosome Antigen 1 (EEA1) i kontrol og AD hjernen. Proteom analyse afslørede også berigelse af β-amyloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K), og apolipoprotein E (APOE) sarkosyl-uopløselige brøkdele af annonce hjerne i forhold til de af kontrol, i overensstemmelse med tidligere væv fraktionering strategier . Således, denne enkle berigelse protokol er ideelle til en lang række eksperimentelle applikationer lige fra Western blotting og funktionelle protein Co sammenlægning assays til massespektrometri-baseret proteomics.
Introduction
Neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers sygdom (AD), Parkinsons sygdom (PD), Huntington's chorea (HD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), og de nært beslægtede prionsygdomme er proteinopathies karakteriseret ved gradvis akkumulering af Detergent-uopløselige protein aggregater i hjernen med ledsager kognitiv tilbagegang. 1 , 2 denne delte patologiske funktion menes at spille en central rolle i ætiologi og Patofysiologi af disse neurodegenerative sygdomme. 2 disse aggregater består typisk af polymert amyloid fibre, der består af gentagne enheder af fejlfoldede protein udstiller på tværs af β-struktur. 1 , 2 , 3 , 4 biokemisk, amyloid aggregater er meget modstandsdygtigt over for kemisk eller termisk denaturering og oploesning,3 som giver unikke udfordringer til deres rensning, analyse og studere via traditionelle biokemiske teknikker. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 ikke overraskende, detergent-uopløselige proteinfraktion har været genstand for megen forskning i Patofysiologi af neurodegenerative sygdomme der involverer ophobning af fejlfoldede proteiner. 6 , 12 , 13 , 14
Biokemiske fraktionering teknikker har ofte været udnyttet til at berige de detergent-uopløselige fraktion fra postmortem hjernen homogeniseret. 6 , 12 , 13 , 14 en af de mest almindelige metoder omfatter den sekventielle udvinding af væv homogeniseret med buffere og rengøringsmidler for at øge stringens, efterfulgt af ultracentrifugering at partitionere de opløselige og uopløselige fraktioner. Et almindeligt anvendte sekventielle fraktionering protokol6,14 indebærer homogenisering af frosne vævsprøver i en buffer, vaskemiddel-gratis lavt saltindhold (LS) og de resulterende uopløselige pellets derefter ekstraheres sekventielt med buffere med højt saltindhold, nonioniske detergenter, high saccharose, som Ioniske detergenter og endelig chaotropes urinstof. 6 , 14 en indlysende godtgørelse af sådanne en sekventiel fraktionering protokoller er betydelig tid og arbejdskraft engagement kræves for at fuldføre dem. Herunder homogenisering og ultracentrifugering, en typisk fem-trins fraktionering protokol kan tage flere timer eller endda dage at fuldføre. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 Derudover så mange patologiske protein aggregater forblive uopløseligt i alle, men de hårdeste betingelser19,20 de fleste af de genererede fraktioner er af begrænset værdi. De mindre strenge fraktionering trin udnytter saltkoncentrationer og nonioniske detergenter er således i vid udstrækning redundante.
Tidligere undersøgelser har vist, at den ioniske vaskemiddel N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) er en fremragende kandidat til en forenklet trinvis vaskemiddel fraktionering protokol. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 som en denaturering vaskemiddel, sarkosyl er strenge nok til at solubilize størstedelen af indbygget foldede proteiner i hjernen uden solubilizing fejlfoldede protein aggregater sammensat af beta-amyloid (Aβ),6,11 fosforyleres tau (pTau),6 TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43),14 alpha-synuclein,12,13 scrapie,23 eller U1 small nuclear ribonucleoproteins (U1 snRNPs) som U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Som sarkosyl er mindre strenge end den allestedsnærværende anioniske detergent sodium dodecyl sulfat (SDS), bevarer det mindre robust oligomere former af fejlfoldede protein aggregater, der ikke kan modstå SDS behandling. 9
Vi beskrev tidligere, en forkortet vaskemiddel-fraktionering-protokol, der opnåede resultater sammenlignes med de mere besværlige sekventielle fraktionering metoder. 5 ved at udelade de mindre strenge fraktionering skridt, vi har kunnet udvikle en letkøbt trinvis fraktionering protokol for berigelse af detergent-uopløselige protein aggregater fra postmortem menneskelige hjerne. 5 denne detaljerede protokollen beskrevet heri er velegnet til en lang række eksperimentelle applikationer lige fra Western blotting og massespektrometri-baseret proteomics funktionelle protein misfoldning og sammenlægning såning-undersøgelser. 5 , 6 , 21
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
etik erklæring: alle hjernens væv blev indhentet fra Emory Alzheimers ' s sygdom Research Center (ADRC) hjerne Bank. Menneskelige postmortem væv er anskaffet under passende institutionelle Review Board (IRB) protokoller.
1. homogenisering og fraktionering
- væv udvalg
Bemærk: frosne postmortem frontale cortex væv fra sunde kontrol (Ctl) og patologisk bekræftede AD tilfælde blev udvalgt fra Emory ADRC hjernen bank (n = 2). Post mortem Neuropatologisk evaluering af amyloid plaque distribution blev udført ifølge konsortium til at etablere et register for Alzheimers ' s sygdom semi-kvantitative scoring kriterier 24, selv om neurofibrillary tangle patologi blev vurderet efter Braak midlertidige system. 16- få frosset postmortem hjernevæv fra sunde kontrol (Ctl) og patologisk bekræftet AD tilfælde. Udnytte beholdere med tøris, pincet og et barberblad, punktafgifter ~ 250 mg dele af grå materie fra hver vævsprøve på tareret engangs veje både, at tage sig til at forhindre, at vævet optøning. Vægt af hver brik til at være homogeniseret.
- Punktafgifter ~ 250 mg af grå materie bruge pincet og ragekniv af visuelt eftersyn for at finde grænsefladen mellem ydre grå materie og indvendige hvide substans. Undgå hvide substans og endnu vigtigere, nogen store blodkar eller blodig regioner, meninges eller arachnoid mater. Holde væv frosset under opskæringsprocessen ved at arbejde hurtigt og ofte markedsføring vejer båden med hjernevæv i polystyren containere med tørre ice.
- Registrerer den nøjagtige vægt af grå stof skåret ud fra hver frosne stykke ved hjælp af en Analysevægt. Beregning af volumen af lavt saltindhold (LS) buffer (se tabel 1) behov for dounce homogenisering (5 mL/g eller 20% w/v).
- Forberede 10 mL LS buffer med 1 x protease og fosfatase hæmmer cocktail og chill på ice.
- Fjerne vejes væv og vejer båden fra tøris og terninger i ca 2 x 2 mm stykker som det smelter. Overførsel til en 2 mL pre kølet dounce homogeniseringsapparat tube på ice.
- Tilsættes 5 mL/g (20% w/v) af iskold lavt saltindhold (LS) buffer med 1 X protease og fosfatase hæmmer cocktail.
- Homogenize hjernevæv på isen med ca 10 slag af stor frihøjde pistil A og 15 strøg af lav frihøjde pistil B.
- Overføre alle homogenatet til en 2 mL polypropylen rør ved hjælp af et glas Pasteur pipette. Label tube med “ TH ” (samlede homogenatet), vævet sag nummer, og homogenatet bind. alikvot 0,8 mL i en mærket 1,5 mL tube. Eventuelle overskydende homogenatet kan være tilsvarende aliquoted og oplagres på-80 ° C.
- Til hver 0,8 mL alikvot, tilføje 100 µL af 5 M NaCl og 10% (w/v) sarkosyl for koncentrationer over 0,5 M og 1% w/v, henholdsvis. Bland rør godt ved inversion og inkuberes i isbad i 15 min. etiket rør med " TH-S " (Total homogenatet-Sarkosyl) til at angive, at homogenater i sarkosyl-buffer (tabel 1).
- Sonikeres hver tube for tre 5 s pulser på 30% amplitude på is (maksimal intensitet = 40%) ved hjælp af en microtip sonde.
- bestemme protein koncentrationer af homogenater ved hjælp af bicinchoninic syre (BCA) assay 25 metoden.
Bemærk: Den gennemsnitlige proteinkoncentration af TH-S homogenater forberedt på 5 mL LS pr. gram væv er 15-20 mg/mL. Homogenater kan være fraktioneret straks eller opbevares ved-80 ° C indtil brug. - Fortyndes TH-S homogenater til 10 mg/mL ved hjælp af iskold sark buffer (tabel 1) med 1 x protease og fosfatase hæmmere.
- Overføre 5 mg protein (0,5 mL) af hver TH-S homogenatet til 500 µL polycarbonat ultracentrifuge rør og par-balance med sark-buffer. Indlæse rør i en pre kølet rotor og ultracentrifuge ved 180.000 x g i 30 min. ved 4 ° C. overførsel sarkosyl-opløselige supernatanter (S1) 1,5 mL rør og opbevares ved-80 ° C.
Bemærk: (Valgfri vask) tilføje 200 µL af sark-buffer til ultracentrifuge-rør indeholdende de detergent-uopløselige fraktioner (P1) og løsne pellets (P1) fra bunden af de ultracentrifuge rør ved hjælp af en 200 µL pipette tip. - Kort puls-spin den inverterede rør til 2-3 s (≤ 2.500 x g) på en microcentrifuge til at overføre pellets (P1) og buffer til 1,5 mL rør nedenfor. Resuspend uopløselige pellets (P1) i sark-buffer af pipettering op og ned for at sikre pelleten afbrydes.
- Par-balance, og der centrifugeres ved 180.000 x g for en ekstra 30 min. ved 4 ° C.
- Valgfri vask supernatanten (S2), og der inkuberes sarkosyl-uopløselige pellets (P2) i 50-75 µL af urinstof buffer (tabel 1) med 1 x PIC (protease og fosfatase hæmmer cocktail) i 30 min. ved stuetemperatur til at solubilize de pellet.
Bemærk: Varm urinstof buffer til stuetemperatur før brugen for at undgå SDS nedbør. For vaskemiddel-følsomme anvendelser, udelader SDS fra urinstof buffer og overveje at vaske den uopløselige pellet (P2) i lav salt buffer før resuspending i urea buffer. - Overføre de resuspenderede pellets (P2) til 0,5 mL rør og bruge kort (1 s) microtip sonikering på 20% amplitude (maksimal intensitet = 40%) til fuldt solubilize pellets.
- Afgøre protein koncentrationer af sarkosyl-opløselige (S1) og - uopløselige (P2) fraktioner ved hjælp af BCA assay metode. Brug disse fraktioner straks eller opbevares ved-80 ° C indtil brug.
2. Immunoblotting
- Western blotting
Bemærk: Western blotting blev udført efter tidligere rapporteret procedurer med mindre ændringer. 5 , 10- forberede 40 µg prøver af total homogenater (TH-S), sark-opløselige (S1) og sark-uopløselige (P2) fraktioner i 1 X Laemmli SDS-page prøvebuffer med 5 mM TCEP pH 7. Inkuber prøver ved 95 ° C i 5 min.
- Belastning prøver på en færdigstøbte 10-well 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE gel. Electrophorese på 80 V for den første centimeter (10 min) og 120 V for den resterende del (60 min), eller indtil tracking farvestof når bunden af gelen.
- Bruger en frisk barberblad og gel kniv til split-åben færdigstøbte gel kassette. Forsigtigt skære væk kamme og selve bunden af gel med en frisk barberblad.
- Resuspend uopløselige pellets (P1) i 200 µl sark-buffer med 1 x PIC af pipettering op og ned.
- Overførsel til en 0,2 µm nitrocellulose membran ved hjælp af en tør overførselsmetode på en blotting maskine (se tabellen materialer).
- Blokere membran i blokerende buffer (BB) uden Tween 20 til 30 min, efterfulgt med BB med 0,05% Tween 20 (BB/T) i 30 min. Efter blokering, skyl membran i TBS/T (0,1% Tween 20) i 5 min. til at fjerne overskydende blokerende buffer.
- Forbered 1:1,000 fortyndinger af primære antistoffer pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 og EEA1 i BB/T (0,05% Tween 20).
- Ruger membraner i primære antistof løsning natten over ved 4 ° C med cirkulær agitation. Skyl membranen i TBS/T til 3 x 15 min.
- Sonde membran med en 1:20,000 fortynding af fluorescently mærket nær-infrarøde sekundær antistof i BB/T til 60 min. ved stuetemperatur i mørket på shaker. Skyl membran for 3 x 10 min. i TBS/T og 2 x 5 min i TBS.
- Skan membranen ved hjælp af en infrarød imaging system på de passende excitation bølgelængde (f.eks. 700 nm (rødt kanal) for infrarød farvestof 680 ged anti-mus IgG (H + L) sekundær og 800 nm (grøn kanal) for infrarød farvestof 790 æsel anti-kanin IgG (H + L ) sekundær).
- Bruge imaging-software til at kvantificere signal intensiteter og udføre densitometri målinger pr fabrikanten ' s instruktioner, at sikre auto-baggrund indstilling angives til gennemsnitlig hele baggrunden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forkortet trinvis sarkosyl-fraktionering protokol blev brugt til at berige detergent-uopløselige protein aggregater fra kontrol og AD postmortem hjernen (figur 1). Proteiner fra TH-S, S1, S2 og P2 fraktioner var løst af SDS-PAGE, fastsat til 15 min i Coomassie blå Fikseringsvæske buffer efterfulgt af blid farvning med Coomassie strålende blå G-250 farvning buffer. Resuspension trin er valgfrit, da der var målbart niveau af protein i S2 fraktion (Se 1.1.14). Western blot analyse (figur 2A og B) klart viser, at i annonce hjerne, patologiske høj molekylvægt fosforyleres tau aggregater var sarkosyl-uopløseligt, og meget lidt pTau forblev i den Sarkosyl-opløselige fraktioner. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 derimod størstedelen af pTau i kontrol hjernen opdelt i sarkosyl-opløselige brøken. 5 , 6 , 10 derimod EEA1 primært partitioner til S1-fraktionen i både kontrol og AD hjernen (figur 2 c). Her, fungerer EEA1 som en almindelig markør for mest oprindelige, ikke-patologiske proteiner, der er i sagens natur sarkosyl-opløselige5. Navnlig, er der lidt mindre signal for EEA1 i den vandopløselige fraktion (S1) i forhold til TH-S brøkdel, hvilket viser, at en mindre pulje af EEA1 sandsynlige sarkosyl-uopløseligt, endnu under detektionsgrænsen ved vestlige skamplet med denne særlige antistof. Det er lige så muligt, at den lille nedgang i signalstyrken af EEA1 i den vandopløselige fraktion (S1) er på grund af ikke-specifik binding af EEA1 til ultracentrifuge rør kunne også forklare den lille afvigelse fra forventede resultater.
At benchmarke effekten af forkortet trinvis fraktionering protokollen (figur 3A) mod den mere traditionelle Multi-trins sekventiel fraktionering metode (figur 3B), de relative niveauer af sarkosyl-uopløselige amyloid forløber protein (APP), tau (MAPT), lille nukleare ribonucleoprotein U1 - 70K (snRNP70) og apolipoprotein E (APOE) blev sammenlignet af label-fri massespektrometri (MS) baseret proteomics på tværs af poolede kontrol (Ctl), mild kognitiv svækkelse (MCI) og AD sager fra tidligere undersøgelser7,18 (figur 3). Målinger af detergent-uopløselige APP effektivt repræsenterer den Aβ peptid, som alle fuldt tryptic APP peptider kvantificeret knyttet til regionen Aβ i fuld længde 695 rester APP protein7. Med begge metoder trended sarkosyl-uopløselige niveauer af alle fire patologiske proteiner opad i MCI og AD tilfælde i forhold til kontrol, i overensstemmelse med den stærke korrelation af kognitiv tilbagegang og patologiske byrde. Samlet set berigelse af disse proteiner i detergent-uopløselige fraktioner (P2) var bemærkelsesværdigt konsekvent bruge både enkelt trin18 og Multi-trins fraktionering protokoller7.
Der er dog mindre forskelle mellem de to metoder, der kan vise sig fordelagtigt eller skadelige afhængigt af den nøjagtige karakter og mål for et enkelt eksperiment. Sammenlignende proteom data opsummeres i figur 3 kan oplyse hvilken protokol til at bruge, afhængigt af specifik eksperimentel parametre og applikationer. Som man kunne forvente, er der en generel afvejning mellem prøve berigelse og renhed, med forenklede fraktionering protokollen giver mere beriget prøver med mindre protein tab end multi-step metode.
For eksempel udviser kontrol uopløselige fraktioner udarbejdet ved hjælp af den forenklede protokol (figur 3A) lidt højere baggrundsværdier for sygdom-relevante proteiner end dem parat via multi-step tilgang. Omvendt, trinvis fraktionering teknik kan være fordelagtige for lav-overflod proteiner som den samlede prøve tab reduceres betydeligt. For eksempel, er den relative berigelse af sarkosyl-uopløselige APOE i MCI tilfælde væsentligt højere i de uopløselige fraktioner udarbejdet via forkortet protokollen (fig. 3A).
Selv om begge tilgange er mere end tilstrækkelige til at konstatere en betydelig stigning i sygdommen-relevante eller patologiske fejlfoldede protein aggregater, den mere talrige og omfattende fraktionering og vask trin af multi-step tilgang kan generere en renere og mere specifikke proteom signatur. Ikke desto mindre kontrollere vores data at metoden trinvis fraktionering er i overensstemmelse med publicerede resultater at patologiske aggregater som tau neurofibrillary tangles (NFTs), Aβ-plaques og scrapie prioner (PrSc) er uopløselige i sarkosyl, mens deres indbygget foldede modparter forbliver vandopløseligt. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
Ved beregning af de relative mængder af protein at partitionere i de detergent-uopløselige fraktioner af kontrol (n = 3) og AD (n = 3) hjerne (tabel 2), kun ~ 10% af det samlede proteinindhold pool er sarkosyl-uopløselige. Når 5 mg total protein af hjernen homogenatet (TH-S) er fraktioneret, 10,4% og 11,3% af proteomet partitioner i detergent-uopløselige brøkdel i kontrol og AD tilfælde, henholdsvis. Selv om det samlede beløb af sarkosyl-uopløselige protein beriget i annonce hjerne er lidt højere end kontrol, ingen betydelige forskelle blev observeret på tværs af de to grupper (p = 0.703). Dette angiver, at protein misfoldning og sammenlægning er ikke udbredt i annonce hjernen, men temmelig begrænsede til en smal og bestemt undersæt af proteiner som tau, Aβ og U1 snRNPs. 7 , 21 , 22
Figur 1: Sarkosyl fraktionering ordningen. (A) A postmortem menneskelige hjerne blev homogeniseret i lav salt buffer, hvorefter sarkosyl og NaCl blev føjet til endelige koncentrationer af 1% w/v og 0,5 M, henholdsvis og inkuberes i 15 min på is. Efter ultralydbehandling, var homogeniseret fraktioneret af ultracentrifugering ved 180.000 x g i 30 min. giver sarkosyl-opløselige supernatanten (S1) og sarkosyl-uopløselige pellet (P1). P1 pellet var (valgfrit) vasket med sark-buffer og re-aflejret af ultracentrifugering råd til den endelige sarkosyl-uopløselige pellet (P2). Dette P2 fraktion var oploeses i urea buffer i 30 min. ved stuetemperatur, efterfulgt af 3 x 5 s sonikering med en ren microtip sonde. (B) proteiner (20 µg) fra TH-S, S1, S2 (10 µL) og P2 fraktioner var løst af SDS-PAGE, fastsat til 15 min i Coomassie blå Fikseringsvæske buffer efterfulgt af blid farvning med Coomassie strålende blå G-250 farvning buffer natten over ved stuetemperatur. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: berigelse af fosforyleret tau i det vaskemiddel uopløselige brøkdel af annonce hjernen. (A og B) Protein (40 μg) af samlet (TH-S), opløselige (S1) og uopløselige (P2) fraktioner var renset med et antistof mod tau fosforyleret på Threonin 231 (pT231) eller AT8 (pSer202, pThr205) at demonstrere berigelse af patologiske phospho-tau arter i de uopløselige brøkdel (P2) af annonce hjernen. I AD hjernen, høj molekylvægt aggregerede tau udelukkende partitioner i detergent-uopløselige (P2) brøkdel. (C) EEA1 fungerede som et opløseligt protein markør og relative lastning kontrol for alt (TH-S) og opløselige (S1) brøkdele af kontrol og AD hjernen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: proteom analyse af patologiske AD proteiner ved hjælp af et enkelt trin eller flere trin fraktionering protokol. Relative niveauer af de repræsentative sarkosyl-uopløselige proteiner APP (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) og APOE på tværs af forskellige sygdomme blandt samlet kontrol, MCI og AD tilfælde ved hjælp af enten enkelt trin (A) eller flere trin (B) sarkosyl fraktionering tilgang. For begge datasæt, blev protein niveau anslået af peptid spektrale kampe (PSMs) af disse identificerede proteiner og normaliserede for at indstille maksimalt til 100. PSMs fra kontrol, MCI og AD tilfælde (n = 5 hver) blev brugt til single-sæt datasæt. Multi-step tilgang, PSMs fra to Repliker puljer af kontrol, MCI og AD tilfælde (n = 5 hver) blev analyseret. Fejllinjer angiver værdierne for gennemsnit ± S.E.M. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 10% w/v sarkosyl løsning: 10 g N-lauryl-sarcosine natriumsalt pr. 100 ml af Hedeselskabet2O (rør på RT natten) |
| Lav Salt (LS) buffer: 50 mM HEPES pH 7,0, 250 mM saccharose, 1 mM EDTA |
| Sarkosyl (sark) buffer: LS buffer + 1% (w/v) sarkosyl + 0,5 M NaCl |
| Urinstof buffer (opbevares ved -20 ° C): 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 8 M urinstof, 2% SDS |
| 4 X SDS loading bufferen: 200 mM Tris-HCl pH 6,8, 40% glycerol, 8% sodium dodecyl suflate (SDS), 0,4% bromophenol blå (BPB) og 20 mM TCEP pH 7,0 i ddH2O |
| Coomassie Fikseringsvæske buffer: 40% Methanol, 10% eddikesyre i ddH2O |
| Coomassie strålende blå G-250 farvning buffer: 25% Methanol, 5% eddikesyre, 0,1% coomassie blå G-250 i ddH2O |
| Coomassie destain buffer: 25% methanol, 5% eddikesyre i ddH2O |
| 1 X Tris bufferet saltvand (TBS): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl i ddH2O |
| 1 X Tris bufferet saltvand med Tween 20 (TBS/T): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 i ddH2O |
| 1 X blokerende buffer (BB): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 1% proprietære protein (Se materialer liste), 750 mM Methylchloroisothiazolinone i ddH2O |
| 1 X blokerende buffer med 0,05% Tween 20 (BB/T): 50 mM Tris-HCl pH 7,45, 150 mM NaCl, 1% proprietære protein (Se materialer liste), 0,05% Tween 20, 750 mM Methylchloroisothiazolinone i ddH2O |
Tabel 1: Buffere liste.
| Stikprøve | Mængde prøve (µL) | Koncentrationen (µg/µL) | Total Protein (µg) | Gennemsnitlige samlede proteinindhold (µg) og S.E.M. | % TH-S (5 mg) |
| CTL 1 | 70 | 9.89 | 692.3 | ||
| CTL 2 | 70 | 7,38 | 516.6 | 518.7 (±99.63) | 10,4% |
| CTL 3 | 70 | 4.96 | 347.2 | ||
| AD 1 | 70 | 9.77 | 683.9 | ||
| AD 2 | 70 | 6,67 | 466.9 | 567.0 (±63.20) | 11,3% |
| AD 3 | 70 | 7.86 | 550.2 |
Tabel 2: Protein beløb i sarkosyl-uopløselige fraktioner (P2). Gennemsnitlig procentdel af protein der partitioner i sarkosyl-uopløselige brøkdel af kontrol (n= 3) og AD (n= 3) hjerne var 10,4% og 11,3%, henholdsvis. Der var ingen statistisk signifikant forskel i mængden af sarkosyl-uopløselige proteiner fra kontrol og AD hjernen, som det fremgår af de af student's t-test (p = 0.703) og standard fejl af middelværdien (S.E.M.) værdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri vi præsentere og diskutere en forkortet trinvis vaskemiddel-fraktionering protokol, der er gældende for en lang række eksperimentelle applikationer lige fra massespektrometri-baseret proteomics analyser til funktionelle protein misfoldning assays og western blotting. 5 , 6 , 7 , 10 denne metode er måske mest effektiv når bruges til at studere neurodegenerative proteinopathies som Alzheimers, ALS, Huntington's chorea, prionsygdomme og de forskellige tauopathies. I forhold til oprindelige fem-trins sekventiel fraktionering protokol, denne trinvis procedure kan gennemføres på en enkelt dag og giver meget lignende resultater. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
Et vigtigt aspekt af denne protokol er brugen af sarkosyl som fraktionering vaskemiddel. I modsætning til andre rengøringsmidler som Triton X-100 eller sodium dodecyl sulfat (SDS) synes sarkosyl at være velegnet til denne opgave; med hensyn til stringens og solubilizing styrke, er det stærk nok til at solubilize fleste af indbygget foldede proteiner samtidig bevare vaskemiddel-kan, struktur og funktion af sygdom-relevante protein aggregeringer, der er i sagens natur følsomme over for SDS. 5 , 9 desuden, i modsætning til SDS, sarkosyl forbliver opløselige ved lave temperaturer og i høje salt betingelser.
Et andet centralt element i denne protokol er ophvirvling af de første sarkosyl-uopløselige (P1) pellets efter først runde af ultracentrifugering. Trinnet vask giver mulighed for de indledende pellets (P1) skal grundigt udvindes og vasket af enhver resterende cross-forurenende opløselig eller samlede homogenatet proteiner, giver en ren og veldefinerede detergent-uopløselige proteinfraktion. Uden valgfrit pellet (P1) ophvirvling og vask skridt, resterende opløselige proteiner kan være gennemført-over i detergent-uopløselige brøkdel, eventuelt confounding efterfølgende resultater og eksperimenter (dvs. immunoblotting eller proteomics analyser).
Den uopløselige og høj molekylvægt karakter af patologiske fejlfoldede protein aggregater (dvs. tau, phospho-tau og Aβ arter) nuværende unikke udfordringer mod deres isolation og analyse via traditionelle biokemiske teknikker. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 i modsætning til opløselige proteiner, uopløseligt aggregater såsom amyloids (Aβ) og hyperphosphorylated tau neurofibrillary tangles (NFTs) kan ikke være let renset fra postmortem væv ved hjælp af traditionelle metoder såsom immunoprecipitation eller hurtig protein væskekromatografi (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 således, forkortet sarkosyl-fraktionering-protokollen er en af de eneste teknikker, der giver mulighed for facile berigelse og isolation af detergent-uopløselige protein aggregater fra postmortem hjernen inden for en relativt kort tidsramme. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
Mens yderligere trin kan anvendes til at isolere en ren, homogen prøve af aggregerede protein, sarkosyl fraktionering protokol giver mulighed for facile berigelse af detergent-uopløselige protein aggregater med forholdsvis lidt tid engagement. 5 , 6 støtte til denne hypotese, proteom undersøgelser af sarkosyl-uopløselige proteomet bekræfter, at det store flertal af kendte patologiske sammenlægning-tilbøjelige proteiner Partitionere i sarkosyl-uopløselige brøkdel-i både traditionelle multi-step 6 , 11 , 21 samt vores roman trinvis fraktionering tilgang. 5 , 7 , 9 , 10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke Drs. Jim Lah og Allan Levey, Emory Department of Neurology, for nyttige kommentarer og forslag. Dette arbejde var delvis finansieret af den accelererende medicin partnerskab grant (U01AG046161-02), Emory Alzheimer's Disease Research Center (P50AG025688) og en National Institute on Aging yder (R01AG053960-01) til N.T.S. Denne forskning blev også delvist understøttet af neuropatologiske kernen i Emory neurovidenskab NINDS Core faciliteter grant, P30NS055077.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
