인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축

요약

인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 분류 프로토콜 설명 되어 있습니다.

초록

이 연구에서 우리는 인간의 사후 뇌에서 세제 불용 성 단백질의 농축에 대 한 약식된 단일 단계 분류 프로토콜을 설명합니다. 이오니아 세제 N-라우릴-sarcosine (sarkosyl)는 효과적으로 뇌 조직 신경 proteinopathies의 넓은 범위에서 세제 불용 성 단백질의 농축을 같이 허용에 기본적으로 접힌된 단백질 solubilizes Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 및 루 경화 증, 그리고 프리온 질병 인간의 제어 및 광고 사후 뇌 조직 되었고 무 균 sedimented ultracentrifugation sarkosyl 세제 불용 성 단백질 집계 pathologic phosphorylated 타우, neurofibrillary의 핵심 구성 요소를 포함 하 여 풍부 하 게 존재 하 여 광고에 tangles입니다. 서 부 럽 집계 phosphorylated 타우와 세제 수용 성 단백질, 제어 및 광고 두뇌에서 초기 Endosome 항 원 1 (EEA1)의 차동 가용성을 설명 했다. Proteomic 분석은 또한 β의 농축을 밝혀-아 밀 로이드 (Aβ), 타우, snRNP70 (U1-70 K), 그리고 apolipoprotein E (APOE) 제어, 이전 조직 분류 전략 일치의 그들에 비교 하는 광고 두뇌의 sarkosyl-불용 성 분수에 . 따라서,이 간단한 농축 프로토콜에 이르기까지 서 부 럽 고 기능 단백질에서 공동 집계 분석 실험 단백질 질량 분석 기반 실험 응용 프로그램의 광범위 한 이상적입니다.

서론

Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 루 경화 증 (ALS), 밀접 하 게 관련된 프리온 질환 등 신경 퇴행 성 질환은 proteinopathies의 점진적인 축적에 의해 특징 세제 불용 성 단백질 집계 동반 인지 뇌에서 떨어진다. ^{1 , 2} 이 공유 병 적인 기능 이상 이러한 신경 퇴행 성 질환의 병 인에 중심 역할을 담당할 생각 이다. ² 이러한 집계 일반적으로 β크로스 misfolded 단백질 전시의 단위를 반복으로 구성 된 고분자 녹말 체 섬유의 구성-구조. ^{1 , 2 , 3 , 4} 화학적, 녹말 체 집계는 화학 또는 열 변성을 가용 화, 그들의 정화, 분석에 독특한 도전을 선물 한다³ 높은 저항 하 고 전통적인 생 화 확 적인 기술을 통해 공부. ^{2 ,<....}

프로토콜

윤리 성명: 모든 뇌 조직에 모리 츠에서 가져온 ' s 질환 연구 센터 (ADRC) 두뇌 은행. 인간의 사후 조직 적절 한 제도적 검토 위원회 (IRB) 프로토콜에서 인수 했다.

1. 균질 및 분류

1. 조직 선택
   참고: 사후 담당 조직에서 건강 한 제어 (Ctl) 및 병 적 고정 광고 사례를 확인된은 모리에서 선정 되었다 ADRC 두뇌 은행 (n = 2). 녹말 체 패 배포의 사후 neuropathological 평가 츠에 대 한 레지스트리를 설정 하는 컨소시엄에 따르면 수행 했다 ' s 질병 반 정량적 기준 ²⁴, 비록 득점 neurofibrillary 얽힌 병리학 Braak 준비 시스템에 따라 평가 했다. ¹⁶
   1. 얻기 냉동 사후 뇌 조직에서 건강 한 제어 (Ctl) 및 병 적 확인 광고의 경우. 드라이 아이스, 집게 및 면도날의 컨테이너를 활용 하 여, 소비 세 ~ 250mg 부분 tared 일회용에 각 조직 샘플에서 회색 물질의 무게 배, 조직 해빙 하지 않도록 돌보는. 무 균 수를 각 작품의 무게를 기록.
   2. 소비 세 ~ 250mg....

결과

축약된 한 단계 sarkosyl-분별 프로토콜 제어 및 광고 사후 뇌 (그림 1)에서 세제 불용 성 단백질 집계를 풍부 하 게 사용 되었다. TH-S, S1, S2, P2 분수에서 단백질 SDS-PAGE, Coomassie 파란 통 버퍼 Coomassie 화려한 블루 G-250 얼룩 버퍼와 부드러운 얼룩 뒤에 15 분에 대 한 고정 해결 했다. 때문에 s 2 분수에 단백질의 탐지 수준 물의 resuspension 단계는 선택 사항 (1.1.14 참조). 서쪽 오 점 분석 (그림 2A 와 B) 광고 두뇌 pathologic 높은 분자 무게 phosphorylated 타우 집계 했다 sarkosyl-불용 성, 그리고 아주 작은 pTau에 남아 있었다 명확 하 게 설명 합니다 .......

토론

여기 소개 하 고 다양 한 misfolding 분석 기능 단백질 질량 분석 기반 proteomics 분석에서까지 실험적인 응용 프로그램에 적용 하는 약식된 단일 단계 세제 분별 프로토콜 토론 그리고 서 부 럽입니다. ^{5 , 6 , 7 , 10} 이 방법론은 아마도 가장 효과적인 치 매 등 신경 proteinopathies 공부 하는 데 사용 하는 경우, 루 게 릭 병, 헌팅턴 병, 프리온 질병 및 다양 한 tauopathies. 원래 5 단계 순차 분류 프로토콜에 비해,이 단일 단계 절차 하루에 완료 될 수 있다 고 매우 비슷한 결과 제공. ^{5 , 6 ,}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일, EDTA 무함유 (100X)	Thermo Fisher	78441	프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일
Sonic Dismembrator System (ultrasonicator)	Fisher Scientific	FB505110	마이크로팁 초음파처리기
Optimax TLX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	361545	냉장 초원심분리기
TLA120.1 로터	Beckman Coulter	362224	초원심분리기 로터
500 ul (8 x 34 mm) 폴리카보네이트 튜브, 두꺼운 벽	Beckman Coulter	343776	TLA120.1 로터용 초원심분리기
튜브 4X SDS 시료 완충액	집에서 만든	N/A	SDS-PAGE
TCEP 용액, 중성 pH	Thermo Fisher	77720	환원제
(TBS) 차단 완충액	Thermo Fisher	37542	차단 버퍼
(TBS) 차단 버퍼 + 0.05% Tween 20	Thermo Fisher	37543	차단 버퍼 및 항체 희석제
4-12% Bolt Bis-Tris Plus 겔, 10웰	Thermo Fisher	NW04120BOX	프리캐스트 SDS-PAGE 겔
MES SDS 러닝 버퍼(20X)	Thermo Fisher	B0002	SDS-PAGE 러닝 버퍼
N-라우로일사르코신 나트륨 염(사르코실)	Sigma Aldrich	L5777-50G	세제
Anti-Tau-2 (pan tau) 항체	Chemicon	MAB375	항체
Anti-phospho-threonine 231 Tau 항체	Millipore	MAB5450	항체
Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau 항체 (AT8)	Thermo Fisher	MN1020	항체
Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) 항체	abcam	ab2900	항체와 관련상품
Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary 항체	Thermo Fisher	A21058	항체
Alexa Fluor 790 당나귀 anti-rabbit IgG (H+L) 2차 항체	Thermo Fisher	A11374	항체
iBlot2 Dry Blotting System	Thermo Fisher	IB21001	gel transfer
iBlot2 Transfer Stacks, 니트로셀룰로오스, 미니	Thermo Fisher	IB23002	겔 전사