Summary
En forkortet fraksjoneres protokoll for anriking av vaskemiddel-uløselig protein aggregater fra postmortem hjernen er beskrevet.
Abstract
I denne studien beskriver vi en forkortet enkeltsteg fraksjoneres protokoll for anriking av vaskemiddel-uløselig protein aggregater fra postmortem menneskehjernen. Ioniske vaskemiddel N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) solubilizes effektivt innfødt foldet proteiner i hjernevevet tillater anriking av vaskemiddel-uløselig protein aggregater fra en rekke nevrodegenerative proteinopathies, som Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom og amyotrofisk lateral sklerose, og prionsykdommer. Menneskelig kontroll og AD postmortem hjernen vev var homogenisert og sedimented av ultracentrifugation i nærvær av sarkosyl å berike vaskemiddel-uløselig protein aggregater inkludert patologisk fosforylert tau, kjernen komponenten av neurofibrillary floker i Annonsen. Vestlige blotting vist differensial Løseligheten av aggregert fosforylert-tau og vaskemiddel-løselig protein, tidlig Endosome Antigen 1 (EEA1) i kontroll og AD hjernen. Proteomic analyse avslørte også anriking av β-amyloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K), og apolipoprotein E (APOE) i sarkosyl-uløselig fraksjoner av AD hjernen sammenlignet med de av kontroll, konsekvent med tidligere vev fraksjoneres strategier . Derfor er denne enkle berikelse protokollen ideelt for en rekke eksperimentelle programmer spenner fra vestlige blotting og funksjonelle protein co aggregering analyser masse massespektrometri-baserte Proteomikk.
Introduction
Nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og de nært beslektede prionsykdommer er proteinopathies preget av gradvis oppbygging av vaskemiddel-uløselig protein mengdefunksjoner i hjernen med tilhørende kognitive nedgang. 1 , 2 denne delte patologisk funksjonen antas å spille en sentral rolle i etiologien og Patofysiologien ved disse nevrodegenerative sykdommer. 2 disse aggregater vanligvis består av polymere amyloid fiber, som består av repeterende enheter av misfolded protein viser cross β-strukturen. 1 , 2 , 3 , 4 biokjemisk, amyloid aggregater er svært motstandsdyktig mot kjemiske eller termisk rødsprit og solubilization,3 som gir unike utfordringer til rensing, analyse og studere via tradisjonell biokjemiske teknikker. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 ikke overraskende, vaskemiddel-uløselig protein fraksjon har vært fokus for mye forskning i Patofysiologien ved nevrodegenerative sykdommer som involverer akkumulering av misfolded proteiner. 6 , 12 , 13 , 14
Biokjemiske fraksjoneres teknikker har ofte blitt benyttet for å berike vaskemiddel-uløselig brøken fra postmortem hjernen homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 en av de vanligste metodene innebærer sekvensiell utvinning av vev homogenates med buffere og vaskemidler med økende stringens, etterfulgt av ultracentrifugation å partisjonere løselig og uløselig fraksjoner. En brukte sekvensiell fraksjoneres protokollen6,14 innebærer homogenisering av frosne vevsprøver i vaskemiddel uten lav salt (LS) bufferen og resulterende uløselig pellets trekkes deretter sekvensielt med buffere som inneholder høye saltinnholdet, ikke-ioniske vaskemidler, high sukrose, som ionisk vaskemidler og endelig chaotropes urea. 6 , 14 en åpenbare ulempen av slike en sekvensiell fraksjoneres protokoller er betydelig tid og arbeid engasjement kreves for å fullføre dem. Inkludert homogenisering og ultracentrifugation, en typisk fem-trinns fraksjoneres protokoll kan ta flere timer eller dager å fullføre. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 i tillegg så mange patologisk protein aggregater er uløselig i alle unntatt de tøffeste forhold19,20 de fleste av de genererte fraksjonene er av begrenset verdi. Dermed er mindre strenge fraksjoneres trinnene høye salt konsentrasjoner og ikke-ioniske vaskemidler stor grad overflødig.
Tidligere studier har vist at ioniske vaskemiddel N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) er en utmerket kandidat for en forenklet enkeltsteg vaskemiddel fraksjoneres-protokoll. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 som et denaturing vaskemiddel, sarkosyl er strenge nok til solubilize majoriteten av innfødt foldet proteiner i hjernen uten solubilizing misfolded protein aggregater består av beta-amyloid (Aβ),6,11 fosforylert tau (pTau),6 TAR DNA-bindende protein 43 (TDP-43),14 alfa-synuclein,12,13 Skrapesyke,23 eller U1 liten kjernefysiske ribonucleoproteins (U1 snRNPs) som U1 - 70 K. 5 , 21 , 22 Sarkosyl er mindre strenge enn det allestedsnærværende anionic vaskemiddel natrium dodecyl sulfat (SDS), beholder det mindre robust oligomeric former av misfolded protein aggregater som ikke tåler SDS behandling. 9
Tidligere beskrev vi en forkortet vaskemiddel-fraksjoneres-protokoll som oppnådde resultater sammenlignes med de mer arbeidskrevende metodikkene som følge fraksjoneres. 5 ved å utelate mindre strenge fraksjoneres trinnene, kunne vi utvikle en lettvinte enkeltsteg fraksjoneres protokoll for anriking av vaskemiddel-uløselig protein aggregater fra postmortem menneskelige hjerne. 5 denne detaljerte protokollen beskrevet her er godt egnet for en rekke eksperimentelle programmer fra vestlige blotting og masse massespektrometri-baserte Proteomikk funksjonelle protein misfolding og aggregering seeding søk. 5 , 6 , 21
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
etikk uttalelse: alle hjernen vev Hentet fra Emory Alzheimers ' s sykdom Research Center (ADRC) hjernen Bank. Menneskelig postmortem vev anskaffet under riktig institusjonelle Review Board (IRB) protokoller.
1. homogenisering og fraksjoneres
- vev utvalg
Merk: frosset postmortem frontal cortex vev fra sunn kontroll (Ctl) og patologisk bekreftede AD tilfeller ble valgt ut fra Emory ADRC hjernen bank (n = 2). Obduksjon neuropathological evaluering av amyloid plakk distribusjon ble utført etter konsortiet å etablere et register for Alzheimers ' s sykdom semi kvantitative scoring kriterier 24, selv om neurofibrillary floke patologi var vurderes etter Lily juli oppsetning systemet. 16- motta frosset postmortem hjernevevet fra sunn kontroll (Ctl) og patologisk bekreftet AD tilfeller. Utnytte beholdere med tørris, tang og et barberblad, avgiftsdirektoratet ~ 250 mg deler av grå materie fra hver Vevsprøve på tared engangs veie båter, ta vare for å hindre at vevet tining. Ta vekten av hver brikke å være homogenisert.
- Avgiftsdirektoratet ~ 250 mg av grå materie ved hjelp av tang og knivskarpe ved visuelt finne grensesnittet mellom ytre grå saken og indre hvit substans. Unngå hvit substans og enda viktigere, noen store blodkar eller blodig regioner, meninges eller araknoide mater. Holde vevet frosset under prosessen med skjæring av arbeider raskt og ofte plassere veiing båt med hjernevev i polystyren beholdere med tørr ice.
- Registrere nøyaktig vekten av grå materie forbrukeravgift av hver frosne bruker en analytical balanse. Beregne volumet av lav salt (LS) buffer (se tabell 1) kreves for dounce homogenisering (5 mL/g eller 20% w/v).
- Forberede 10 mL LS buffer med 1 x protease og fosfatase hemmer cocktail og chill på ice.
- Fjerne vektet vev og veiing båt fra tørris og terninger i omtrent 2 x 2 mm deler som det thaws. Overføring til en 2 mL pre kjølt dounce homogenizer rør på ice.
- Legge til 5 mL/g (20% w/v) av iskalde lav salt (LS) buffer med 1 X protease og fosfatase hemmer cocktail.
- Homogenize hjernevev på is med ca 10 slag av høy klaring pistil A og 15 strøk med lav klaring pistil B.
- Overføre alle homogenate til en 2 mL polypropylen rør med et glass Pasteur pipette. Etiketten røret med “ TH ” (Total Homogenate), vevet tilfelle nummer og homogenate volum. Aliquot 0,8 mL i en merket 1,5 mL tube. Eventuelle overskytende homogenate kan tilsvarende aliquoted og lagret på-80 ° C.
- Hver 0,8 mL aliquot, legge 100 µL hver 5 M NaCl og 10% (w/v) sarkosyl til konsentrasjoner av 0,5 M og 1% w/v, henholdsvis. Bland rør godt inversjon og Inkuber på is 15 min. etiketten rør med " TH-S " (totalt Homogenate-Sarkosyl) til å angi at homogenates er i sarkosyl-buffer (tabell 1).
- Sonicate hver rør for tre 5 s pulser på 30% amplituden på is (maksimum styrke = 40%) bruker en microtip sonde.
- bestemme protein konsentrasjonen av homogenates med bicinchoninic syre (BCA) analysen 25 metoden.
Merk: Gjennomsnittlig protein konsentrasjonen av TH-S homogenates forberedt på 5 mL LS per gram vev er 15-20 mg/mL. Homogenates kan fraksjonert umiddelbart eller lagret ved-80 ° C før bruk. - Fortynne TH-S homogenates til 10 mg/mL iskald sark buffer (tabell 1) med 1 x protease og fosfatase hemmere.
- Overføre 5 mg protein (0,5 mL) av hver TH-S homogenate 500 µL polykarbonat ultracentrifuge rør og par-balanse med sark-buffer. Legg rør i en pre kjølt rotoren og ultracentrifuge 180.000 x g i 30 min på 4 ° C. overføring sarkosyl-løselig supernatants (S1) til 1,5 mL rør og lagre på-80 ° C.
Merk: (Valgfritt vask) legge 200 µL sark-bufferen til ultracentrifuge rør som inneholder vaskemiddel-uløselig fraksjoner (P1) og fjerne pellets (P1) fra bunnen av ultracentrifuge rør med en 200 µL pipette tips. - Kort puls-rotere den inverterte rør for 2-3 s (≤ 2500 x g) på en microcentrifuge overføre pellets (P1) og buffer til 1,5 mL rør nedenfor. Resuspend uløselig pellets (P1) i sark-bufferen ved pipettering opp og ned for å sikre pellet avbrytes.
- Par-balanse og sentrifuge 180.000 x g for en ytterligere 30 min på 4 ° C.
- Forkaste valgfrie vask nedbryting (S2) og ruge sarkosyl-uløselig pellets (P2) i 50-75 µL urea bufferen (tabell 1) med 1 x bilde (protease og fosfatase hemmer cocktail) for 30 min ved romtemperatur å solubilize den pellet.
Merk: Varm urea buffer til romtemperatur før bruk for å unngå SDS nedbør. For vaskemiddel-sensitive applikasjoner, utelater SDS fra urea-bufferen og vurdere vaske det uløselig pellet (P2) i lav salt buffer før resuspending urea buffer. - Overføre resuspended pellets (P2) til 0,5 mL rør og bruke kort (1 s) microtip sonication på 20% amplituden (maksimum styrke = 40%) til fullt solubilize pellets.
- Bestem protein konsentrasjonen av sarkosyl-løselig (S1) og - uløselig (P2) fraksjoner ved hjelp av BCA analysen metoden. Bruke disse fraksjoner umiddelbart eller lagrer ved-80 ° C før bruk.
2. Immunoblotting
- Western blotting
Merk: vestlige blotting ble utført i henhold til tidligere rapportert prosedyrer med små modifikasjoner. 5 , 10- forberede 40 µg prøver av total homogenates (TH-S), sark-løselig (S1) og sark-uløselig (P2) brøker i 1 X Laemmli SDS side eksempel buffer med 5 mM TCEP pH 7. Inkuber eksempler på 95 ° C i 5 min.
- Last eksempler på en precast 10-og 4-12% Bis-Tris SDS siden gel. Electrophorese på 80 V for den første centimeter (10 min) og 120 V for resten (60 minutter) eller til sporing fargestoff når bunnen av gel.
- Bruker en fersk barberblad og gel kniv til split-åpen sandsekk gel kassetten. Forsiktig klippe bort kammer og bunnen av gel med en frisk barberblad.
- Resuspend uløselig pellets (P1) 200 µl sark-buffer med 1 x bilde av pipettering opp og ned.
- Overføring til en 0,2 µm nitrocellulose membran med en tørr overføringsmetode på en blotting maskin (se tabellen materialer).
- Blokkere membranen i blokkering buffer (BB) uten mellom 20 til 30 min, etterfulgt med BB 0,05% mellom 20 (BB/T) for 30 min. Etter blokkering, skyll membranen i SS/T (0,1% mellom 20) i 5 min å fjerne overflødig blokkerer buffer.
- Forberede 1:1,000 fortynninger av primære antistoffer pT231, Tau-2 (pan tau), AT8 og EEA1 i BB/T (0,05% mellom 20).
- Ruge membraner i primære antistoff løsning overnatting på 4 ° C med sirkulær agitasjon. Skyll membranen i SS/T i 3 x 15 min.
- Sonde membranen med en 1:20,000 fortynning av fluorescently-merket nær-IR sekundære antistoffer i BB/T for 60 min ved romtemperatur i mørket på shaker. Skyll membranen i 3 x 10 min SS/T og 2 x 5 minutter i TBS.
- Scan membranen bruke en infrarød imaging system på riktig eksitasjon bølgelengde (f.eks 700 nm (røde kanalen) for infrarød fargestoff 680 geit anti-musen IgG (H + L) sekundær og 800 nm (grønne kanalen) for infrarød fargestoff 790 esel anti-kaninen IgG (H + L ) sekundær).
- Bruke programvaren til å kvantifisere signal intensiteter densitometry målinger som produsenten ' s instruksjoner, sikrer auto-bakgrunn innstillingen er satt til gjennomsnittlig hele bakgrunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forkortet enkeltsteg sarkosyl-fraksjoneres protokollen ble brukt til å berike vaskemiddel-uløselig protein aggregater av kontroll og AD postmortem hjernen (figur 1). Proteiner fra TH-S, S1, S2 og P2 fraksjoner ble løst av SDS-side, fast i 15 min i Coomassie blå etappe, den stabiliserende buffer etterfulgt av mild flekker med Coomassie briljant blå G-250 flekker buffer. Rørets er valgfritt siden det var umulig å oppdage nivåene av protein i S2 fraksjonen (se 1.1.14). Western blot analyse (figur 2A og B) tydelig viser at i AD hjernen, patologisk høy molekylvekt fosforylert tau aggregater var sarkosyl-uløselig, og lite pTau forble i den sarkosyl-løselig fraksjoner. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 derimot flertallet av pTau i kontrollen hjernen avskillt i sarkosyl-løselig brøken. 5 , 6 , 10 derimot EEA1 primært partisjoner i S1 brøken både kontrollen og AD hjernen (figur 2C). Her fungerer EEA1 som en generell markør for mest opprinnelige, ikke-patologisk proteiner som er iboende sarkosyl-løselig5. Spesielt, er det litt mindre signal for EEA1 i løselig fraksjonen (S1) forhold til TH-S brøk, som angir at et mindre basseng med EEA1 er sannsynligvis sarkosyl-uløselig, men under grensen for påvisning ved western blot med denne bestemte antistoff. Det er like mulig at bedre signalstyrke av EEA1 i løselig fraksjonen (S1) er uspesifisert binding av EEA1 til ultracentrifuge rør kan også forklare liten avviket fra forventet resultat.
Å benchmark effekten av forkortet enkeltsteg fraksjoneres protokollen (figur 3A) mot de mer tradisjonelle flertrinns sekvensiell fraksjoneres metodikken (figur 3B), relativ nivåer av sarkosyl-uoppløselig amyloid forløper protein (APP), tau (MAPT), liten kjernefysiske ribonucleoprotein U1 - 70K (snRNP70) og apolipoprotein E (APOE) ble sammenlignet av etiketten-fri massespektrometri (MS) basert Proteomikk over gruppert kontroll (Ctl), mild kognitiv svekkelse (MCI) og tilfeller tidligere studier7,18 (Figur 3). Målinger av vaskemiddel-uløselig APP representerer effektivt Aβ peptid, som alle fullt tryptic APP peptider kvantifisert tilordnet Aβ regionen av full lengde 695 rester APP protein7. Med både metoder trend sarkosyl-uløselig nivåene av alle fire patologisk proteiner oppover i MCI og Annonsen tilfeller i forhold til kontroller, forenlig med den sterke sammenhengen av kognitiv svikt og patologisk byrden. Samlet berikelse av disse proteinene i vaskemiddel-uløselig fraksjoner (P2) var bemerkelsesverdig konsekvent hjelp av enkeltsteg18 og flere trinn fraksjoneres protokoller7.
Det er imidlertid små forskjeller mellom de to metodikkene som kan være fordelaktig eller skadelige avhengig av nøyaktig og målene for et enkelt eksperiment. Sammenlignende proteomic dataene oppsummert i Figur 3 kan informere hvilken protokoll avhengig av spesifikke eksperimentelle parametere og programmer. Som man kunne forvente, er det en generell avveining mellom eksempel berikelse og renhet, med forenklet fraksjoneres protokollen affording mer beriket prøver med mindre protein tap enn flere trinn metode.
For eksempel utstilling kontroll uløselig fraksjoner tilberedt med forenklet protokollen (figur 3A) litt høyere bakgrunn nivåer av sykdom-relevante proteiner enn de forberedt via flere trinn tilnærming. Derimot kan enkeltsteg fraksjoneres teknikken være fordelaktig for lav-overflod proteiner som samlet prøven tap er betydelig redusert. For eksempel er relativ anriking av sarkosyl-uløselig APOE i MCI tilfeller betydelig høyere i uløselig fraksjoner forberedt via forkortet protokollen (Figur 3A).
Selv om begge tilnærminger er mer enn tilstrekkelig til å observere en betydelig økning i sykdom relevante eller patologisk misfolded protein aggregat, de mer tallrike og omfattende fraksjoneres og vask skritt av flere trinn tilnærming kan generere en renere og mer spesifikt proteomic signatur. Likevel, vår kontrollere at enkeltsteg fraksjoneres metoden er konsekvent med publiserte resultatene at patologisk aggregater som tau neurofibrillary ledninger (NFTs), Aβ plaketter og Skrapesyke prioner (PrSc) er uløselig i sarkosyl, mens deres innfødt foldet kolleger fortsatt løselig. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
Ved å beregne de relative mengdene protein som partisjonen i vaskemiddel-uløselig fraksjoner av kontroll (n = 3) og (n = 3) hjernen (tabell 2), bare ~ 10% av den totale protein er sarkosyl-uoppløselig. Når 5 mg totale protein av hjernen homogenate (TH-S) er fraksjonert, 10,4% og 11,3% av proteom partisjoner i vaskemiddel-uløselig brøken i kontroll og AD tilfeller, henholdsvis. Selv om den totale mengden sarkosyl-uløselig protein beriket i AD hjernen er litt høyere enn kontroll, ikke er signifikante forskjeller ble observert over de to gruppene (p = 0.703). Dette indikerer at protein misfolding og aggregering er ikke utbredt i AD hjernen, men heller begrenset til en smal og spesifikke delsett av proteiner som tau, U1 og Aβ snRNPs. 7 , 21 , 22
Figur 1: Sarkosyl fraksjoneres ordningen. (A) A postmortem menneskelige hjerne var homogenisert i lav salt buffer, som sarkosyl og NaCl ble lagt til siste konsentrasjoner av 1% w/v og 0,5 M, henholdsvis og ruges i 15 min på is. Etter sonication, var homogenates fraksjonert av ultracentrifugation 180.000 x g i 30 min affording sarkosyl-løselig nedbryting (S1) og sarkosyl-uløselig pellet (P1). P1 pellet var (valgfritt) vasket med sark-buffer og re-sedimented av ultracentrifugation råd til den endelige sarkosyl-uløselig pellet (P2). Denne P2 fraksjonen var solubilized i urea buffer for 30 min ved romtemperatur, etterfulgt av 3 x 5 s sonication med en ren microtip sonde. (B) proteiner (20 µg) fra TH-S, S1, S2 (10 µL) og P2 fraksjoner ble løst av SDS-side, fast i 15 min i Coomassie blå etappe, den stabiliserende buffer etterfulgt av mild flekker med Coomassie briljant blå G-250 flekker buffer over natten i romtemperatur. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: anriking av fosforylert tau i vaskemiddel uløselig brøkdel av AD hjernen. (En og B) Protein (40 μg) av totalen (TH-S), løselig (S1) og uløselig (P2) fraksjoner ble strøket med et antistoff mot tau fosforylert på threonin 231 (pT231) eller AT8 (pSer202, pThr205) å demonstrere anriking av patologisk phospho-tau arter i den uløselig brøkdel (P2) av Annonsen hjernen. I Annonsen hjernen, høy molekylvekt samlet tau utelukkende partisjoner i vaskemiddel-uløselig (P2) brøken. (C) EEA1 var en løselig protein markør og relativ lasting kontroll for totalt (TH-S) og løselig (S1) fraksjoner av kontroll og AD hjernen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Proteomic analyse av patologisk AD proteiner ved hjelp av en protokoll som ett enkelt trinn eller flere trinn fraksjoneres. Relativ nivåer av representative sarkosyl-uløselig proteiner APP (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70K) og APOE på tvers av ulike sykdommer blant samlet kontroll, MCI og Annonsen tilfeller hjelp av enkelt trinn (en) eller flere trinn (B) sarkosyl fraksjoneres tilnærming. For begge datasett, ble protein nivå anslått av peptid spectral kamper (PSMs) av disse identifisert proteiner, og normalisert for å angi maksimalt 100. PSMs fra kontroll, MCI og AD tilfeller (n = 5 hver) ble brukt for single-sett datasettet. For flere trinn tilnærming, PSMs fra to Repliker bassenger av kontroll, MCI og AD (n = 5 hver) ble analysert. Feilfelt indikerer verdiene for gjennomsnittlig ± S.E.M. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 10% w/v sarkosyl løsning: 10 g N-lauryl-sarcosine natrium salt per 100 ml ddH2O (rør på RT over natten) |
| Lav Salt (LS) buffer: 50 mM HEPES pH 7.0, 250 mM sukrose, 1 mM EDTA |
| Sarkosyl (sark) buffer: LS buffer + 1% (w/v) sarkosyl + 0,5 M NaCl |
| Urea buffer (butikken på 20 ° C): 50 mM Tris-HCl pH 8.5, 8 M urea, 2% SDS |
| 4 X SDS lasting buffer: 200 mM Tris-HCl pH 6.8, 40% glyserol, 8% natrium dodecyl suflate (SDS), 0,4% bromophenol blå (BPBEN) og 20 mM TCEP pH 7.0 i ddH2O |
| Coomassie etappe, den stabiliserende buffer: 40% metanol, 10% eddiksyre i ddH2O |
| Coomassie briljant blå G-250 flekker buffer: 25% metanol, 5% eddiksyre, 0,1% coomassie blå G-250 i ddH2O |
| Coomassie destain buffer: 25% metanol, 5% eddiksyre i ddH2O |
| 1 X Tris bufret saltvann (SS): 50 mM Tris-HCl pH 7.45, 150 mM NaCl i ddH2O |
| 1 X Tris bufret saline med mellom 20 (SS/T): 50 mM Tris-HCl pH 7.45, 150 mM NaCl, 0,1% mellom 20 i ddH2O |
| 1 X blokkerer buffer (BB): 50 mM Tris-HCl pH 7.45, 150 mM NaCl, 1% proprietære protein (se materialer liste), 750 mM Methylchloroisothiazolinone i ddH2O |
| 1 X blokkerer buffer med 0,05% mellom 20 (BB/T): 50 mM Tris-HCl pH 7.45, 150 mM NaCl, 1% proprietære protein (se materialer), 0,05% mellom 20, 750 mM Methylchloroisothiazolinone i ddH2O |
Tabell 1: Buffere liste.
| Eksempel | Volum utvalg (µL) | Konsentrasjon (µg/µL) | Totalt Protein (µg) | Gjennomsnittlig totale Protein (µg) og S.E.M. | % TH-S (5 mg) |
| CTL 1 | 70 | 9.89 | 692.3 | ||
| CTL 2 | 70 | 7.38 | 516.6 | 518.7 (±99.63) | 10,4% |
| CTL 3 | 70 | 4.96 | 347.2 | ||
| AD 1 | 70 | 9,77 | 683.9 | ||
| AD 2 | 70 | 6,67 | 466.9 | 567.0 (±63.20) | 11,3% |
| AD 3 | 70 | 7.86 | 550.2 |
Tabell 2: Protein beløpet i sarkosyl-uløselig brøker (P2). Gjennomsnittlig andel av protein som partisjoner i sarkosyl-uløselig brøkdel av kontroll (n= 3) og (n= 3) hjernen var 10,4% og 11,3%, henholdsvis. Det var ingen statistisk signifikant forskjell mengden av sarkosyl-uløselig proteiner av kontroll og AD hjernen, noe som gjenspeiles av den av student t-test (p = 0.703) og standard feil av gjennomsnittet (S.E.M.) verdier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her vi introdusere og diskutere en forkortet enkeltsteg vaskemiddel-fraksjoneres protokoll som gjelder for en rekke eksperimentelle anvendelser fra masse massespektrometri-baserte Proteomikk analyse funksjonelle protein misfolding analyser og vestlige blotting. 5 , 6 , 7 , 10 denne metodikken er kanskje mest effektive når de brukes til å studere nevrodegenerative proteinopathies som Alzheimers, ALS, Huntingtons sykdom, prionsykdommer og de ulike tauopathies. I forhold til opprinnelige fem-trinns sekvensiell fraksjoneres-protokollen, denne enkeltsteg prosedyren kan gjennomføres på en enkelt dag og gir svært like resultater. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
En viktig del av denne protokollen er bruk av sarkosyl som fraksjoneres vaskemiddel. Motsetning til andre vaskemidler som Triton X-100 eller natrium dodecyl sulfate (SDS) synes sarkosyl å være godt egnet til denne aktiviteten. stringens og solubilizing styrke, er det sterk nok til å solubilize fleste innfødt foldet proteiner samtidig bevare vaskemiddel-insolubility, struktur og funksjon av sykdom-relevante protein aggregater som er iboende følsom for SDS. 5 , 9 i tillegg ulikt SDS, sarkosyl fortsatt løselig ved lave temperaturer og høye salt forhold.
En annen viktig funksjon i denne protokollen er rørets av første sarkosyl-uløselig (P1) pellets etter første av ultracentrifugation. Denne wash trinn kan første pellets (P1) grundig pakket ut og vasket av eventuelle gjenværende kryss-forurensende løselig eller totalt homogenate proteiner, affording en ren og godt definert vaskemiddel-uløselig protein fraksjon. Uten valgfrie pellet (P1) rørets og vask trinnet gjenværende løselig proteiner kan bli gjennomført over i vaskemiddel-uløselig brøk, muligens confounding etterfølgende resultater og eksperimenter (dvs. immunoblotting eller Proteomikk analyse).
Uløselig og høy molekylvekt natur patologisk misfolded protein aggregater (i.e. tau, phospho-tau og Aβ arter) finnes unike utfordringer mot deres isolering og analyse via tradisjonell biokjemiske teknikker. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 i motsetning til løselig proteiner, uløselig samler som amyloids (Aβ) og hyperphosphorylated tau neurofibrillary ledninger (NFTs) kan ikke være lett renset fra postmortem vev av tradisjonelle metoder som immunoprecipitation eller rask protein flytende kromatografi (FPLC). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 derfor, forkortet sarkosyl-fraksjoneres protokollen er en av de eneste teknikkene som tillater for lettvinte berikelse og isolering av vaskemiddel-uløselig protein aggregater fra postmortem hjernen i en relativt kort tidsramme. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
Mens flere trinn kan brukes til å isolere en ren, homogen prøve aggregert protein, gir sarkosyl fraksjoneres protokollen lettvinte anriking av vaskemiddel-uløselig protein aggregat med relativt liten tid forpliktelse. 5 , 6 til støtte for denne hypotesen, proteomic studier av sarkosyl-uløselig proteom bekrefter at det store flertallet av kjente patologisk aggregering utsatt proteiner partisjonere i sarkosyl-uoppløselig brøk-i både tradisjonelle multi-trinn 6 , 11 , 21 så vel som vår romanen enkeltsteg fraksjoneres tilnærming. 5 , 7 , 9 , 10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Jim Lah og Allan Levey, Emory Institutt for nevrologi, for nyttige kommentarer og forslag. Dette arbeidet var delvis finansiert av det akselererende medisin partnerskap grant (U01AG046161-02), Emory Alzheimers sykdom Research Center (P50AG025688) og en National Institute on Aging gi (R01AG053960-01) til N.T.S. Denne forskningen ble også støttet delvis av Neuropathology kjernen av Emory nevrovitenskap NINDS Core fasiliteter tilskuddet, P30NS055077.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
