Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo per l'imaging in vivo della retina di topo con tomografia a coerenza ottica ad alta risoluzione spettrale dominio (SD-OCT). Si concentra sulle cellule retiniche del ganglio (RGC) nella regione peripapillare, con diverse analisi e quantificazione approcci descritti.
Abstract
Cambiamenti strutturali nella retina sono manifestazioni comuni di malattie oftalmiche. Tomografia a coerenza ottica (OCT) consente la loro identificazione in vivo— rapidamente, in modo ripetitivo e ad alta risoluzione. Questo protocollo descrive la formazione immagine OCT nella retina di topo come un potente strumento per studiare i neuropathies ottici (OPN). Il sistema OCT è un'alternativa non invasivi, basati su interferometria a comuni post-mortem analisi istologica. Esso fornisce una valutazione rapida e accurata di spessore retinico, consentendo la possibilità di tenere traccia delle modifiche, come assottigliamento retinico o ispessimento. Vi presentiamo il processo di imaging e l'analisi con l'esempio della riga del mousedelTTAG Opa1. Sono proposti tre tipi di scansioni, con due metodi di quantificazione: pinze standard e fatti in casa. Quest'ultima è la migliore per uso sulla retina peripapillary durante le scansioni radiali; essere più precisi, è preferibile per l'analisi di strutture più sottili. Tutti gli approcci descritti qui sono progettati per le cellule retiniche del ganglio (RGC) ma sono facilmente adattabili ad altre popolazioni cellulari. In conclusione, l'OCT è efficiente in phenotyping modello del mouse e ha il potenziale per essere utilizzato per la valutazione affidabile degli interventi terapeutici.
Introduction
L'OCT è uno strumento diagnostico che facilita l'esame delle strutture retiniche1, tra cui la testa del nervo ottico (ONH). Nel corso degli anni è diventato un indicatore affidabile della progressione di malattia in esseri umani2,3, così come in roditori4,5. Utilizza interferometria per creare immagini a sezione trasversale degli strati retinici ad una risoluzione assiale di 2 µm. Lo strato più interno è il livello fibre nervose retiniche (RNFL), contenente assoni RGC, cui fa seguito lo strato di cellule del ganglio (GCL), contenenti principalmente RGC corpi. Successiva è lo strato plessiforme interno (IPL), dove si incontrano gli assoni delle cellule bipolari, orizzontali ed amacrine dendriti RGC. Questi, insieme alle cellule orizzontali, formano lo strato nucleare interno (INL) e loro sporgenze connettersi con gli assoni dei fotorecettori nello strato plexiform esterno (OPL). Questo è seguito dallo strato nucleare esterno (ONL), con i corpi delle cellule del fotoricettore ed è separato dallo strato dei fotorecettori di membrana limitante esterna (OLM), chiamata anche il segmento segmento interno/esterno (IS / OS) strato. Infine, gli ultimi strati osservabili nella retina di topo sono l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e della coroide (C). Il RNFL da solo normalmente è troppo sottile per essere misurati nei topi; così, analizzando il RNFL/GCL è invece preferibile4,5. Un'altra possibilità è lo strato complesso di GC, che contiene la seconda oltre l'IPL, rendendo più spessa e quindi ancora più facile per misurare il ott scansioni4. Di conseguenza, OCT può fornire informazioni sullo stato patologico della retina, come in OPNs.
In alternativa, lo spessore della retina di topo spesso viene analizzato con l'istologia post-mortem . Tuttavia, questa tecnica volti limitazioni relative alla raccolta di tessuto, fissazione, taglio, colorazione, montaggio, ecc quindi, alcuni difetti, quali i cambiamenti di spessore sottile, non possono essere rilevato. Infine, perché il mouse stesso non può essere testato alle diverse volte punti, il numero di animali per studiare notevolmente aumenta, a differenza per ottobre. Tutto sommato, la non invasività, ad alta risoluzione, con possibilità di ripetizione, monitoraggio in tempo in tempo e la facilità di utilizzo della tecnologia OCT rendono il metodo di scelta negli studi di malattia retinica.
Modelli murini vengono utilizzati per identificare i difetti del gene e per delucidare i meccanismi molecolari alla base di retinopatie6. OPN è una forma di retinopatia con notevoli danni al nervo ottico (ON), che si compone di circa 1,2 milioni gli assoni RGC. OPN può essere focalizzata su ON o può essere secondaria ad altre patologie, congeniti o non7, che conduce a perdita del campo visivo e più tardi, cecità. Tratti caratteristici di OPN sono RGC la perdita e il danno, che può essere osservata in OCT umano come RNFL e GCL assottigliamento2,3. Nel frattempo, la patofisiologia di OPN è ancora poco conosciuta, e quindi la necessità di testare le retine del mouse rimane.
Questo manoscritto descrive l'imaging e la quantificazione di spessore di strato retinico, utilizzando l'esempio di Opa1delTTAG mouse linea8,9, un modello di atrofia ottica dominante (DOA)10. Per valutare la patofisiologia RGC, scansioni radiali, rettangolare e anulare sono stati quantificati. Questo è stato fatto con pinze originali fornite dal software OCT o con una macro fatti in casa, sviluppato per un programma di elaborazione di immagini open source. Le pinze di serie sono difficili da manipolare e spesso più spessa di RNFL/GCL, mentre le pinze fatte in casa sono facili da usare, riproducibili e più precisa. La macro esegue una misurazione per un livello rilevato automaticamente, in 5 punti e in posizioni fisse, su entrambi i lati di ONH nella regione peripapillare. L'obiettivo del protocollo presentato è di descrivere acquisizione scansione OCT per specificare il posizionamento della retina, con un focus su RGCs.
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Protocol
il protocollo sperimentale è stato approvato dall'Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm; Montpellier, Francia), è coerente con le direttive europee e l'istruzione di ARVO è conforme per l'uso di animali nella ricerca oftalmica. È stato effettuato nell'ambito dell'accordo del Languedoc Roussillon Comity etico nella sperimentazione animale (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).
1. installazione dell'apparecchiatura e la preparazione pre-formazione immagine
Nota: qui, l'OCT è stata eseguita su retine del mouse utilizzando il sistema di imaging oftalmica dominio spettrale (SD) ( Figura 1A). L'apparato di SD-OCT è costituito da una base e un animale Monte imaging (AIM) con una fase di allineamento del roditore (RAS) ( Figura 1B). La base include il computer, il motore di OCT, la sonda di SD-OCT e la lente specifica del mouse. La sonda è montata l'obiettivo, che comprende il Z-traduttore. La RAS è utilizzato per mouse posizionamento grazie al tavolo con il X - e Y-traduttore, la cassetta può essere ruotata e ruotata e la barra di morso rimovibile con la band di naso. Il software fornito dal produttore consente l'acquisizione e l'analisi dei file di personalizzazione, anche se quest'ultimo può essere fatto anche con un programma di elaborazione di immagini open source.
- Saldamente posizionate la sonda nello scopo.
- Collegare l'obiettivo specifico del mouse alla sonda.
- Regolare le impostazioni del braccio di riferimento per l'obiettivo specifico (qui, potenza a 086 e posizione al 964).
- Assicurandosi che la specifica del mouse lente sono sufficientemente distante dalla cassetta, collegare la barra di morso con il nastro a naso sulla cassetta.
Nota: La distanza tra la lente e la cassetta può essere regolata con la vite di Z-traduttore, situata nella parte posteriore l'obiettivo. La capezzina è un elastico disponibile in commercio, e la sua tensione deve essere regolata in base alle dimensioni del mouse. - Accendere l'alimentatore (angolo inferiore destro del carrello) e quindi il computer.
- Per lanciare il programma di imaging, fare doppio clic sul collegamento appropriato sullo schermo.
Nota: Questo dipende dal tipo di lente; qui, Mouse Retina. - Creare un nuovo studio clinico e aggiungere i protocolli desiderati. In caso contrario, utilizzare l'esistente studio clinico e/o protocolli.
- Aggiungere un nuovo studio scegliendo la " Studio NameŔ " IDŔ " trattamento braccio specifiche " (qui, " Uncategorized "); e predefiniti " scansione protocolli ", se esistono.
- Scegli un " esaminatore " alla " studio clinico " sezione.
Nota: per un nuovo " esaminatore ", vai a " Setup esaminatori & medici " per definire it. - Aggiungi un nuovo paziente nel paziente/esame sezione cliccando su Aggiungi paziente; entrando il " ID ", " nome ", " cognome ", " sesso ", e " data di nascita " (facoltativo).
Nota: Eseguire questa operazione solo prima di testare ogni mouse, se più conveniente. Assicurarsi che l'ID è non più di 10 caratteri. Per il mouse, l'errore di rifrazione per entrambi gli occhi è 0 e la lunghezza assiale è 23.0. - Fare clic su " aggiungere esame " e selezionare il " protocollo " aggiungendo " Preset scansioni " dall'elenco, a partire con l'occhio che si misurerà in primo luogo (qui, l'occhio di destra), o personalizzando le scansioni.
- Per personalizzare una scansione, utilizzare una scansione esistente come un modello e modificarlo oppure crearla da zero attraverso il " aggiungere la scansione personalizzata " opzione. Dopo aver aggiunto tutte le scansioni all'elenco, definire un nuovo protocollo utilizzando il " invio " nuovo protocollo nome " opzione (OS: oculus sinister, sinistro occhio; OD: oculus dexter, giusto contorno occhi).
Nota: Qui, il protocollo coinvolge tre scansioni: (i) una scansione radiale, con un diametro di 1,4 mm, offset orizzontale e verticale 0 mm, 1.000 righe di A-scansioni/B-scan, 100 B-scansioni/volume, 1 telaio/B-scan, 80 linee di inattivi A-scansioni/B-scan e 1 volume; (ii) una scansione rettangolare, con una lunghezza di 1,4 mm e larghezza, angolo 0°, 0-mm offset orizzontale e verticale, 1.000 righe di A-scansioni/B-scan, 100 B-Scan, 1 telaio/B-scan, 80 linee di inattivi A-scansioni/B-scan e 1 volume; e (iii) un anulare scansione, con un diametro di massimo minimo e 0,6 mm 0,4 mm, 0-mm offset orizzontale e verticale, 1.000 righe di A-scansioni/B-scan, 3 B-scansioni/volume, 48 fotogrammi/B-scan, 80 linee di inattivi A-scansioni/B-scan e 1 volume.
2. Preparazione del mouse
- immobilizzazione e dilatazione degli occhi
- almeno 15 minuti prima dell'acquisizione dei dati, instillare gocce di occhio di fenilefrina 10% negli occhi del mouse, rimuovere l'eccesso e instillare gocce per gli occhi tropicamide 0,5%.
Nota: La prima dilatazione può essere fatto in una sola volta per tutti i topi che saranno testati nella sessione. Assicurarsi che i liquidi siano a temperatura ambiente. - Subito dopo l'induzione anestesia generale (punto 2.2), amministrare 0,4% oxybuprocaine collirio di cloridrato, mantenendoli in luogo per 3 s per anestetizzare e immobilizzare gli occhi. In seguito, pulire le gocce e ripetere l'instillazione di tropicamide fenilefrina e 0,5% di 10% per accertare che gli occhi sono ben dilatati.
Nota: Assicurarsi che i liquidi siano a temperatura ambiente e che il mouse non inghiottire il oxybuprocaine.
- almeno 15 minuti prima dell'acquisizione dei dati, instillare gocce di occhio di fenilefrina 10% negli occhi del mouse, rimuovere l'eccesso e instillare gocce per gli occhi tropicamide 0,5%.
- Anestesia generale
- preparare una soluzione di anestetica di ketamina (20 mg/mL) e xilazina (1,17 mg/mL) in soluzione salina. Conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane.
- Circa 5 min prima del test, intraperitonealmente iniettare 5-10 µ l di soluzione anestetica per 1 g di massa del corpo, a seconda dell'età e la dimensione del mouse.
Nota: Giovani e/o sottili topi necessità meno anestetico, prendere meno tempo per anestetizzare, ma anche risvegliare più velocemente. Qui, 8 µ l/g (160 mg/kg di ketamina, 9,33 mg/kg di xilazina). - Facoltativamente, lubrificare gli occhi con il collirio viscoso o un gel oftalmico per evitare secchezza cornea.
3. Posizionamento del mouse
- lubrificare gli occhi con viscoso a base di glicol occhio scende a fornire idratazione corneale.
Nota: Se gli occhi sembrano asciutti durante l'esame, ri-applicare il collirio. - Avvolgere il mouse in un foglio di garza chirurgica per tenerlo caldo.
- Usando uno stoppino di spugna o di cotone, applicare un sottile strato di un gel oftalmico con 0,3% ipromellosa su ogni occhio, per ridurre al minimo la rifrazione della luce, evitare opacità e sicuro idratazione corneale. Mentre così facendo, spostare le ciglia e baffi da parte.
- Posizionare il mouse nella cassetta, con la testa in avanti dritto e puntamento.
- Delicatamente aprire il morsetto di barra di morso e posizionare la barra in bocca; utilizzare la banda di naso per fissare la posizione.
Nota: Assicurarsi che la barra di morso è al centro della cassetta. - Posto un cotone rotolare sotto la destra (sinistra), se l'occhio destro (sinistro) è in fase di test.
- , Mantenendo la punta che mira a clip sulla lente specifica del mouse, portarlo verso l'occhio ruotando in senso antiorario la vite di Z-traduttore.
- Di rotanti ed oscillanti la cassetta e ruotando la barra di morso e le viti X-translator, pre-impostare la posizione del mouse; l'obiettivo è di avere il look di occhio destro direttamente nell'obiettivo e quindi di allineare gli assi ottici degli occhi e la lente.
Nota: Se il mouse è troppo alta o troppo bassa, la vite di Y-traduttore dovrebbe essere utilizzata in primo luogo. - Scegliere la prima scansione nella " esame ", fare clic su " iniziare puntando " e apportare le modifiche ulteriormente manuale per imaging retinico.
- Con la vite di Z-traduttore, spostare la retina verticalmente sul pannello di sinistra ( Figura 2, l'allineamento orizzontale B-scan) e orizzontalmente sulla rPannello di volo ( Figura 2, l'allineamento verticale B-scan).
- Ruotare la cassetta per portare il ONH al centro del pannello di destro spostando il ONH su o giù. Utilizzare la vite a morso per raddrizzare la retina sul pannello di destra. Girevole la cassetta per posizionare il ONH al centro del pannello sinistro.
- Utilizzare la vite di X-traduttore a livello della retina sul pannello di sinistra. Tenendo a mente la funzione principale di ogni modulatore, regolare ulteriormente la posizione della retina per centralizzare il ONH.
Nota: Utilizzare la vite di Y-traduttore per spostare il ONH su e giù sul pannello di destra, se necessario. La posizione può essere raffinata in qualsiasi momento tra le scansioni.
4. SD-OCT Imaging del ONH e della Retina
- una volta che il contenuto con le regolazioni, fare clic su " istantanea di avviare " per iniziare la scansione di SD-OCT.
- Se un imaging 3D non è necessario, deselezionare l'opzione OCU.
- Salvare la scansione e la relazione.
- Procedi con le scansioni prossime.
- Per realizzare l'immagine il secondo occhio, dopo la lente di retrazione, girare la cassetta conseguenza e ripetere passaggi 3.6-4.3.
5. Completamento di acquisizione
- quando l'acquisizione è completa, rimuovere il mouse dal cassetto, applicare gel oftalmico con ipromellosa 0,3% per ciascun occhio e posizionare il mouse su una piastra riscaldante a wake up.
- Dopo l'ultima acquisizione, chiudere il software e spegnere il computer e la macchina di OCT (pulsante di alimentazione di alimentazione).
- Pulire la cassetta con un disinfettante.
6. Analisi
- per la misura di spessore di strato retinico, utilizzare il software di segmentazione automatizzata fornito dal produttore.
- Fare clic sul " paziente ", scegliere il desiderato " esame " da allora elenco e fare clic sul " Review esame " opzione.
- Caricare i dati desiderati OCT sul software OCT facendo clic destro sull'icona della cartella nella scansione desiderata.
- Destra cliccare su B-scan; configurare le pinze consentendo fino a 10 misura pinze; e inserire i loro nomi, angoli e colori.
- Scegliendo la pinza desiderata facendo un clic destro sull'esplorazione di B; posto di conseguenza sulla retina per misura.
Nota: Per le scansioni centrate sul ONH, impostare 5 pinze su ogni lato di essa, equidistanti tra loro. Per l'analisi di peripapillary, assicurarsi che la pinza non sia troppo lontano dall'ONH. Per la scansione radiale, analizzare 10 immagini a scansione che sono stati scelti dal software OCT. I numeri possono essere trovati nella " report " cartella. - Salvare i risultati per l'analisi in un programma di software di foglio di calcolo facendo clic destro su B-scan e facendo clic " salvare risultati ".
Nota: I risultati si trovano nella stessa cartella come la scansione dati.
- In alternativa, utilizzare la macro di pinza fatti in casa, " MRI Retina strumento ", sviluppato per un programma di elaborazione di immagini open source (Vedi la tabella materiali).
- Assicurarsi che il " MRI Retina strumento " e il " strumento di sezione poligono modificare " macro sono attive. Caricare l'immagine. Clicca sul pulsante per avviare la misurazione m.
Nota: La macro crea automaticamente uno 0.2 mm lunga Cassetta su entrambi i lati del ONH di misura. Ogni cassetta contiene 5 punti di misurazione di tale funzione come pinze. Loro posizione laterale è immutabile ed è personalizzato per la peripapilla nelle scansioni radiali. La posizione orizzontale delle cassette è predefinita per misurare lo spessore RNFL/GCL, ma è facilmente modificabile per misurare il livello complesso GC invece. Se la qualità di scansione è scarsa, la posizione orizzontale deve essere adeguato o l'immagine deve essere esclusa dall'analisi. - Per la regolazione orizzontale, fare clic sul pulsante e. Nella nuova apertura " ROI Manager " finestra, scegliere la prima cassetta.
- Clicca sul poligono blu pulsante e regolare la posizione della cassetta prima cliccando sui bordi del livello misurato nella foto.
- Ripetere per la seconda cassetta di prima scelta nel " Manager di ROI " finestra e facendo clic sull'immagine appropriata. Fare clic sul pulsante r per misurare di nuovo. Visualizzare i risultati nella " misure " finestra.
Nota: I risultati possono essere copiati a un programma di software di foglio di calcolo in qualsiasi momento. Essi contengono i seguenti valori per il cassetto destro (r), cassetto sinistro (l) e totale: Intden - densità integrata all'interno della cassetta; : Superficie della misurazione, in mm 2; Len: lunghezza della pinza entro la cassetta, in mm; Significa: dire intensità del segnale all'interno della cassetta; e Std: errore standard della media intensità del segnale. - Procedere con la prossima immagine.
- Ulteriormente analizzare i dati in un programma di software di foglio di calcolo.
Nota: Per trovare lo spessore medio dello strato, prendere la Len di dieci valori.
- Assicurarsi che il " MRI Retina strumento " e il " strumento di sezione poligono modificare " macro sono attive. Caricare l'immagine. Clicca sul pulsante per avviare la misurazione m.
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Representative Results
La tecnologia SD-OCT consente immaginando retinica, analisi di spessore che sono paragonabile alla istologia, ma sono più veloce e più dettagliata (Figura 3). Come presentato con wildtype topi C57Bl/6, anche se la qualità di un'acquisizione di SD-OCT (Figura 3A, destra) non è così buona come quella di un'immagine di una sezione trasversale della retina (Figura 3A, sinistra), Visualizza più strati (ad es., OLM). Inoltre, ci vogliono solo circa 40 min, compresa la preparazione del mouse, invece di giorni o settimane per l'analisi istologica. Infine, non richiede l'elaborazione e la macchiatura, quali ematossilina, eosina e zafferano, che può danneggiare il tessuto e causare la raccolta di dati errati. Comprendono gli strati retinici facilmente misurabili in OCT RNFL/GCL, IPL, INL, OPL, ONL, IS / OS, RPE e C (Figura 3B), permettendo quindi un complesso studio dell'intera retina. Come tale, cambiamenti strutturali retinici riflettono lo sviluppo della malattia. Nel caso di OPNs, questo vale per RGCs e la via e così il RNFL/GCL e IPL.
DOA è uno della più comuni OPNs ed è caratterizzata da degenerazione RGC e la perdita delle RNFL11. Dovuto le mutazioni nel gene OPA1 12, conduce a cecità e ipovisione. Utilizzando il modello murino di Opa1delTTAG , che trasporta la mutazione umana c.2708delTTAG ricorrenti, è stato scoperto che Opa1 haplo-insufficienza ostacola la visione in un sesso-dipendente8,9. Questo è stato determinato sulla base di misurazioni di OCT di spessore retinico, che ha mostrato un progressivo ispessimento dello strato complesso GC (Figura 4A) e peripapillare RNFL (Figura 4B, 4C) in Opa1+ /- femmine. In questi esperimenti, i calcoli sono stati fatti con le pinze di serie per le scansioni rettangolare e con un programma per le scansioni anulare di elaborazione delle immagini open source. Per le scansioni radiali, che spesso sono di bassa qualità e produrre che un minimo di 10 immagini al retina per analisi, una macro fatta in casa è stato sviluppato. Un confronto tra le pinze standard e fatti in casa (Figura 4) ha mostrato un significativamente più basso spessore del RNFL/GCL e strati complessi GC misurate con quest'ultimo. Questo è perché le pinze di serie sono molto più spessi e più difficili da collocare sul confine dello strato. Pertanto, è meglio evitare di usare le pinze di serie per strati sottili, soprattutto sulle esplorazioni radiale.
Per riassumere, il SD-OCT consente phenotyping visual del mouse che può essere ripetuta fra parecchi punti di tempo. Tuttavia, il tipo di scansione OCT e metodo di misurazione deve essere adattate alla malattia oggetto dell'inchiesta e così lo strato retinico in questione. Tuttavia, OCT fornisce informazioni sufficienti per identificare i difetti nella struttura della retina. Tuttavia, questo deve essere ulteriormente analizzato con un altro metodo per fornire una completa comprensione dei meccanismi di fondo.
Figura 1: sistema di Imaging oftalmica SD-OCT. (A) Panoramica della base e parti di scopo-RAS del dispositivo SD-OCT. (B) Panoramica dei componenti scopo-RAS. A: il calcolatore, b: alimentazione, braccio di riferimento motore c: OCT, sonda d: SD-OCT, lente specifica del mouse di e:, f: Z-traduttore, g: AIM-RAS tavolo, h: Y-traduttore, I: cassetta (rotatore), j: morso bar, K – capezzina, l: vassoio girevole, m: X-translator e n: puntando il suggerimento. Questo figute è visualizzata come nella Figura 2, con non-modulatori della posizione retinica segnati in rosa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: posizionamento della Retina. Orizzontale (a sinistra) e verticale (a destra) vista l'allineamento di B-scan. Le frecce corrispondono ai movimenti indotti dai modulatori color-coded. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: strati retinici. (A) Wildtype mouse istologia retina dopo ematossilina, eosina e zafferano colorazione (sinistra) e SD-OCT (a destra); barra della scala: 50 µm. (B) misurazioni dello spessore retinico per 3 mesi wildtype topi; n = 14, media ± SEM, barra della scala: 50 µm. GC: cellula del ganglio, RNFL/GCL: strato delle cellule di fibre nervose retiniche strato/ganglio, IPL: strato plessiforme interno, INL: strato nucleare interno, OPL: strato plexiform esterno, ONL: strato nucleare esterno, IS / OS: fotorecettore segmenti interno/esterno segmenti, RPE: epitelio retinico del pigmento e c: coroide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: misure di esemplare SD-OCT. Spessore di strato complesso (A), GC nelle scansioni rettangolare centrato su ONH, misurata con le pinze di serie; Opa1delTTAG linea di topo, n = 4, media ± SEM, * * p < 0,01 valutata con test t di Student. (B) Peripapillary RNFL in spessore di SD-Oct (C) Peripapillary RNFL nelle scansioni anulare, determinato come il calcolo di area RNFL per ogni campo; Opa1delTTAG topi femmina, n = 5-11, media ± SEM, * p < 0.05 valutata con test t di Student. Spessore di strato complesso (D) RNFL/GCL e GC nelle scansioni radiali, misurata con le pinze standard o fatti in casa per 3 o 10 scansioni, rispettivamente; topi selvatici, n = 8, media ± SEM, * * p < 0,01, * * * p < 0.001 valutata con test t di Student. RNFL/GCL - strato delle cellule di fibre nervose retiniche strato/ganglio, GC: cellula del ganglio. Figure A-C adattato da Sarzi et al. 9. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il sistema di OCT, un non-invasiva in vivo imaging metodo, fornisce scansioni simil-cross-sezione della retina ad alta risoluzione. Così, il suo principale vantaggio è il suo potenziale per un'analisi dettagliata, con la meravigliosa opportunità di recepire i protocolli ordinariamente applicati agli esseri umani di modelli murini.
Nell'esempio di Opa1delTTAG topi mutanti, SD-OCT risultati hanno mostrato un aumento di spessore di strato complesso RNFL e GC, che ha consentito per un'ulteriore esplorazione del DOA patofisiologia9. Non sarebbe stato possibile unicamente con l'analisi istologica. In confronto, l'istologia non fornisce la possibilità di visualizzare l'intera retina, a differenza delle scansioni OCT anulare o radiale. Inoltre, è più che richiede tempo e costoso, considerando l'aumento del numero di animali negli studi con parecchi punti di tempo. Infatti, SD-OCT ha spianato la strada per incriminare un nuovo tipo di cellula retinica in DOA, la cellula di Müller9. Questo è stato fatto nonostante il fatto che la cella singola risoluzione né identificazioni di cella specifica sono possibili con il sistema. Al contrario, l'analisi dello stato-messa a fuoco spessore-messa a fuoco e/o generale della regione peripapillare è ampiamente sufficiente per rilevare il deterioramento cellulare. Ulteriori indagini con l'istologia possono quindi svolgersi con una chiara idea di cosa cercare. Pertanto, lo stesso metodo può anche applicarsi alla valutazione degli interventi terapeutici per prevenire o frenare la degenerazione retinica.
Per migliorare ulteriormente l'utilità dell'OCT, pinze fatte in casa sono stati sviluppati e avevano una precisione molto maggiore rispetto a quelle standard. Anche se lo standard è più spesso di RNFL/GCL, alcune squadre usarlo comunque, ma per più grandi strati13. Qui, ci siamo concentrati l'analisi comparativa su RGCs in 10 scansioni radiali al retina, tutti nella regione peripapillare. Il RNFL da solo non era misurabile nelle scansioni radiali in entrambi i casi. Questo strato era troppo sottile e vago; di conseguenza, il RNFL/GCL e lo strato complesso GC sono stati misurati invece. Allo stesso tempo, siamo riusciti a misurare il RNFL utilizzando scansioni anulare, che si è rivelato vantaggioso per fenotipizzazione del mouse. Tuttavia, l'affidabilità può essere controversa. In tutti questi approcci, il passaggio fondamentale è stata per centrare le scansioni sull'ONH e di visualizzare la retina senza ombre e opacità. Il primo può essere facilmente regolato mediante la procedura del protocollo in termini di posizionamento della retina. Quest'ultimo dipende la trasmittanza della cornea e il cristallino. Ad esempio, se il gel oftalmico è diffuso in modo non uniforme, la scansione è sfocata e/o la retina appare piegata. Per risolvere questo problema, sarebbe sufficiente correttamente ri-applicare il gel. Se il cristallino è opaco, la scansione è scura o incompleta. La soluzione qui sarebbe di ripetere la scansione un altro giorno, se restituisce la trasparenza del cristallino. Un'altra possibile ragione per una scansione di cattiva qualità è la presenza di ostacoli, come baffi o ciglia. Questi possono essere facilmente rimossi mettendo da parte e applicando un po' di gel oftalmico per tenerli in luogo. Altri approcci analitici che differiscono in termini di tipo di attrezzature, tipo di scansione, angolo e altri parametri esistono pure e hanno un numero variabile di immagini analizzate. Questo deve essere considerato se la qualità di risultato non è ancora soddisfacente. Per esempio, Liu et al. preso scansioni radiali a diversi angoli13, rispetto ai nostri scansioni radiali a uno solo, leggermente più spessi strati di reporting. Tuttavia, l'acquisizione di OCT e approcci analitici proposti in questo manoscritto sono adatte per analisi RGCs nella retina di topo peripapillary.
In conclusione, l'OCT è una tecnologia con un grande potenziale. Consente il rilevamento dei cambiamenti sottili nella struttura retinica — tra cui il RGCs, specialmente in merito alla OPNs — e si rivela indispensabile alla scienza di visione. Di conseguenza, il protocollo presentato è pratico per OPN del mouse modello che phenotyping, anche per quanto riguarda la valutazione di nuove terapie.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da Inserm, Université Montpellier, Francia di Retina, Union National des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), associazione sindrome de Wolfram, la Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France e il laboratorio di eccellenza Programma di EpiGenMed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | - | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | - | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | - | - | Elastic band |
| Gauze pads 3" x 3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | - | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | - | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0.9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | - | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | - | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
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