Summary
Slice patch clamp tekniken är en effektiv metod för att analysera lärande-inducerade förändringar i inneboende egenskaper och plasticitet av excitatoriska eller hämmande synapser.
Abstract
Slice patch clamp tekniken är ett kraftfullt verktyg för att undersöka lärande-inducerad neural plasticitet i delar av hjärnan. För att analysera motor-lärande inducerad plasticitet, tränade vi råttor med en accelererad rotor rod uppgift. Råttor utfört uppgiften 10 gånger med 30-s intervall för 1 eller 2 dagar. Prestanda var signifikant bättre på utbildningsdagar jämfört med den första rättegången. Vi förberett sedan akut hjärnskada skivor av primära motoriska cortex (M1) hos otränade och tränade råttor. Aktuellt-clamp analys visade dynamiska förändringar i vila membranpotential, spike tröskel, afterhyperpolarization och membran motstånd i layer II/III pyramidal nervceller. Nuvarande injektion inducerad många fler spikar i 2-dagars utbildade råttor än otränade kontroller.
För att analysera kontextuell-lärande inducerad plasticitet, tränade vi råttor med en hämmande undvikande (IA) uppgift. Efter att ha upplevt fot-chock i den mörka sidan av en låda, råttorna lärt sig att undvika det, bor i den upplysta sidan. Vi förberett akut Hippocampus segment från otränad, IA-utbildade, oparade och genomgång råttor. Spänning-clamp analys användes för att spela sekventiellt in miniatyr retande och hämmande postsynaptiska strömmar (mEPSCs och mIPSCs) från samma CA1 neuron. Vi hittade olika genomsnittliga mEPSC och mIPSC amplituder i varje CA1 neuron, vilket tyder på att varje neuron hade olika postsynaptiska styrkor vid dess retande och hämmande synapser. Dessutom hade jämfört med otränade kontroller, IA-tränade råttor högre mEPSC och mIPSC amplituder, med bred mångfald. Dessa resultat föreslog att kontextuella lärande skapar postsynaptiska mångfald i både retande och hämmande synapser på varje CA1 neuron.
AMPA eller GABAA -receptorer tycktes medla de postsynaptiska strömmarna, sedan bad behandling med CNQX eller bicucullin blockerade de mEPSC eller mIPSC händelserna, respektive. Denna teknik kan användas för att studera olika typer av lärande i andra regioner såsom de sensoriska hjärnbarken och amygdala.
Introduction
Den patch clamp teknik, utvecklad av Neher och Sakmann Stuttgart, har använts för elektrofysiologiska experiment1. Det hela-cell patch clamp teknik2 kan användas för att registrera intracellulära ström eller spänning använder gigaohm tätning av cellmembranet. Den nuvarande-clamp tekniken tillåter oss att analysera skillnader i membran egenskaper såsom vilande potential, resistans och kapacitans3. Spänning-clamp tekniken tillåter oss att analysera lärande-inducerad synaptisk plasticitet i både retande och hämmande synapser.
Den primära motoriska cortexen (M1) är en central region som är kritiska för att göra skickliga frivilliga rörelser. Tidigare elektrofysiologiska studier visade utvecklingen av långsiktig potentiering (LTP)-gillar plasticitet i layer II/III retande synapser efter skickliga Finmotorisk träning4. Dessutom visat i vivo imaging studier ytterligare ombyggnaden av M1 Dendritutskotten efter en skicklig nå uppgift5,6. Lärande-inducerad synaptic och inneboende plasticitet har dock inte visats i M1 nervceller.
Vi rapporterade nyligen att en rotor rod aktivitet främjas dynamiska förändringar i glutamaterg och GABAergic synapser och förändrad inneboende plasticitet i M1 layer II/III nervceller7. Här använde vi den bit patch clamp tekniken för att undersöka lärande-inducerad plasticitet. Denna teknik kan också användas för att undersöka andra typer av erfarenhet-beroende plasticitet i andra regioner av hjärnan. Till exempel sinnesintryck i fat cortex kan stärka AMPA receptor-medierad excitatoriska inmatning till lager II/III nervceller8och cued rädsla luftkonditionering stärker de excitatoriska ingångarna på den laterala amygdala nervceller, vilket krävs för frukta minne9. Dessutom skapar kontextuella lärande mångfald när det gäller retande och hämmande synaptisk tillförs Hippocampus CA1 nervceller10,11.
Protocol
alla djurstallar och kirurgiska ingrepp var enligt riktlinjer för djur experiment av Yamaguchi University School of Medicine och godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén av Yamaguchi Universitet.
1. djur
- Använd 4 - 5 vecka-gamla manliga Sprague-Dawley-råttor (postnatal 28-31 dagar gammal).
- Hus råttorna i enskilda plast burar (40 cm × 25 cm × 25 cm) hålls vid en konstant temperatur (23 ° C ± 1 ° C) under en 12-h ljus/mörk cykel. Ge råttorna ad libitum tillgång till vatten och mat.
2. Rotor rod test
- att undersöka motorisk skicklighet lärande, utsätta varje råtta på rotorn rod prov (rod diameter 7 cm; farledsbredd 8.9 cm; fallhöjd 26,7 cm) 1 eller 2 dagar ( figur 1A i Kida et al., 2016 < sup Class = ”xref” > 7). Utföra uppgiften i ett lugnt, temperaturkontrollerade rum (23 ± 1 ° C). Inte stör eller hantera råttor innan test
- Ställ rotorn staven till accelerationsläge, vilket ökar linjärt från 4 varv/min-40 varv/min (8 π/min-80 π/min) i 5 min.
- Pålagt råtta vilar roterande staven. Bekräfta att alla lemmar på stången.
- Mäta latensen falla från roterande staven att utvärdera motorprestanda.
- Tillåter varje råtta 10 försök (prövningar) med 30-s intervaller.
- Om råttan faller från roterande staven, Ställ den på stången igen efter ett intervall på 10-20 s.
- Offra råtta med en överdos av pentobarbital (400 mg/kg) 30 min efter den slutliga prövningen. Injicera otränad kontroll råttor med samma dos av anestesi i sina hem burar.
3. Hämmande undvikande test
- att undersöka kontextuella lärande, angående råttor ett hämmande undvikande (IA)-test ( figur 1 d i Mitsushima et al., 2011, 2013 10 , 11) Undvik några episodiska erfarenheter på dagen för experimentet som kontakt med andra, Bur förändringar eller rengöring. Utföra uppgiften i ett lugnt, temperaturkontrollerade rum (23 ± 1 ° C).
Obs: IA utbildning apparaten är en två-kamrar akryl låda (längd 33 cm, bredd 58 cm, höjd 33 cm). Den har en belyst säker sida och en mörk chock sida som avgränsas med en lucka ( figur 1 d). - Placera råtta i den säkra (lit) sidan av rutan belysta. Hantera råttan försiktigt utan stress.
- Vänta en kort tid (10 till 20 s) att vänja råttan att miljön.
- Öppna skjutdörren så att råttan att ange mörka rutan på kommer.
- Mäta latensen (s) innan råttan träder den nya mörka sidan av rutan. Fördröjning av den första rättegången representerar råtta ' s prestanda innan träningen.
- Efter ikraftträdandet den mörka sidan, stänga dörren och tillämpa en kodade elektriska fot chock (2 s, 1.6 mA) via elektriska stålstänger i golvet i rutan. Tillåta walk-through råttor att utforska utbildning apparaten för 1 min utan att bli chockad. Hus oparade råttor i en upplyst chock bur för flera ge dagar och plötsligt chock utan episodiska upplevelser. Hantera försiktigt utan stress i alla grupper.
- Hålla varje råtta i den mörka rutan för 10 s innan den släpps buren.
- På 30 min efter foten chocken, placera igen råtta i den upplysta sidan av rutan. Mäta latensen för att ange mörka sida.
- Återvända råtta till buren.
- På 60 min efter chocken, offra råtta med en överdos av pentobarbital (400 mg/kg). Hantera råttan försiktigt och injicera anestesi intraperitonealt. Otränade kontroll råttor, injicera anestesi i sina hem burar utan den erfarenhet som beskrivs ovan.
4. Dissektion buffert
- upplösa kristallerna av 0,195 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O, 0.188 g KCl, 0,074 g CaCl 2, 1.423 g MgCl 2-6 H 2 O och 12.579 g kolinklorid i ultrarent vatten (900 mL 950 mL) . Se tabell 1.
- Lös kristaller av 2.340 g askorbinsyra, 0.342 g pyrodruvsyra natriumsalt, 2.100 g NaHCO 3 och 4.500 g glukos.
- Lägg till vatten upp till 1000 mL. Spänna av osmolalitet blir mellan 290 mOsm/L och 300 mOsm/L. Justera osmolalitet genom att lägga till ultrarent vatten, om det är över intervallet.
- Bubbla lösningen med 5% CO 2 / 95% O 2 gas blandning vid iskalla temperaturer för 5 min innan användning.
5. Konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF)
- Lös kristaller av 0.186 g kaliumklorid, 6.700 g NaCl, och 0,156 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O i ultrarent vatten (900 mL 950 mL). Se tabell 2.
- Bubbla med gasblandningen för 5 min.
- Lös kristaller av 1.800 g glukos och 2.184 g NaHCO 3 och lägger sedan till 4 mL MgCl 2 och 4 mL CaCl 2 från 1 M lager lösningar.
- Lägg till vatten upp till 1000 mL. Spänna av osmolalitet blir mellan 290 mOsm/L och 295 mOsm/L. Justera osmolalitet genom att lägga till ultrarent vatten, om det är över intervallet.
- Bubbla med den gas före användning blandningen.
6. Intracellulära lösningar
- för ström-clamp recordings (tabell 3), Lös 0.0746 g KCl, 6.089 g K-glukonat, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA och 500 µL MgCl 2 från 1 M stamlösning i 180 mL ultrarena vatten (Justera pH-värdet till 7,2 med KOH).
- Lägga till 0.4408 g Na 2 - ATP, 0.0418 g Na 3 - GTP och 0.510 g Na-phosphocreatine. Tillsätt vatten till 200 mL och justera pH till 7,35 med KOH.
- Justera osmolalitet till cirka 290 mOsm/L genom att lägga till ultrarent vatten.
- Store som 1 mL portioner i frysen (-30 ° C).
- För spänning-clamp recordings (tabell 4), lös 5.244 g CsMeSO 3, 0.672 g CsCl, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA och 500 µL MgCl 2 från 1 M lager lösningar i 180 mL ultrarent vatten. Justera pH-värdet till 7,2 med CsOH. För mEPSP och mIPSP inspelningar, Använd modifierad koncentration av 5.814 g CsMeSO 3 och 0.252 g CsCl för att justera återföring potential av GABA A receptor svar 11.
- Lägga till 0.4408 g Na 2 - ATP, 0.0418 g Na 3 - GTP och 0.510 g Na-phosphocreatine. Tillsätt vatten till 200 mL och justera pH till 7,35 med CsOH.
- Justera osmolalitet till cirka 290 mOsm/L genom att lägga till ultrarent vatten.
- Store som 1 mL portioner i frysen (-30 ° C).
7. Skär preparatet
- före att offra, Nedvarvning alla dissektion verktyg med krossad is ( figur 2A). Lägg till ca 500 mL kallt vatten i behållaren krossad is för att öka den kontakta yta. Denna procedur beskrivs tidigare 10 , 11 , 12.
Obs: Verktyg här är: stor sax, iris sax, en spatel, en micro spatel, pincett, pincett, en rostfritt stål 200 mL-bägare, ett blad för hjärnan putsning, en 120 mL hjärt perfusion spruta fylld med dissektion buffert behandlas med gasblandningen, en silikon tub (20 cm) ansluten till en tillplattad 18 gauge nål, ett rostfritt hjärnan dissektion skede (tjocklek = 3 mm, ϕ = 12 cm), och en montering scen för vibratome (ϕ = 5 cm). - Offra råtta 30 min efter avslutad beteendemässiga paradigm av anesthetizing den med en överdos av pentobarbital (400 mg/kg kroppsvikt). Utföra slice preparatet snabbt för att säkerställa att skivor är så friska som möjligt 10 , 11 , 12. Den hjärnan extråtgärd protokoll uppfyller alla veterinära normer för vårt universitet.
- Fylla en 120-mL spruta med iskall dissektion buffert (tabell 1) bubblade med en 5% CO 2 / 95% O 2 gas blandning. Avlägsna eventuella luftbubblor före perfusion.
- Efter utsätta hjärtat, stick in nålen i den bakre delen av vänster kammare.
- Utför transcardial genomblödning av hjärnan manuellt med hjälp av sprutan. Större råttor kräver mer dissektion buffert för perfusion. Dränka hjärnan med iskall dissektion buffert för 5 min. bubbla bufferten kontinuerligt under nedsänkning.
- Trimma den bakre sidan av hjärnan på en vinkel parallellt med dendritiska orientering i målet kortikala regionen med hjälp av ett blad. Eftersom hjärnan är stå på dissektion scenen med skurna slutet botten, avgör den första vinkeln vinkeln på alla efterföljande hjärnan skivor. Detta är kritiskt viktigt ( figur 2B). En felaktig vinkel kan skära igenom målet pyramidal nervceller.
Obs: Verktyg här är: ett blad för hjärnan trimning, ett filterpapper (ϕ = 10 cm), ett rostfritt hjärnan dissektion skede (tjocklek = 3 mm, ϕ = 12 cm), en spatel, ett superlim, en dropper och en montering scen för vibratome (ϕ = 5 cm). - Skär 350 µm tjock koronalt hjärnan skivor med hjälp av en vibratome. Fyll dissektion kammaren med iskall buffert bubblade med en 5% CO 2 / 95% O 2 gas blandning ( figur 2 c). Bubbla bufferten kontinuerligt under hjärnan slice.
- Trim peripheryen av målområdet med iris sax.
- Tvätta trimmade skivor försiktigt i rumstemperatur aCSF bubblade med 5% CO 2 / 95% O 2 (tabell 2).
- Underhåll den trimmade skivor i en gränssnitt kammare tills inspelningen är utfört ( figur 2D och E). Inkubation i 1 h i kammaren förbättrar tillståndet av celler, men fenotyperna ändra om skivor inkuberas i mer än 10 timmar. Stäng locket till kammaren för att omsluta gaserna och små vätskan droppar aCSF.
8. Hela-cell patch clamp
Obs: hela-cell inspelningar kräver en förstärkare och ett lågpassfilter som sätts till en cutoff frekvens 5 kHz. Signalerna är digitaliserade och lagras i en dator. Lagrade data analyseras offline ( figur 3A).
- Skapa glaselektroderna med hjälp av horisontella avdragare. Fyll elektroderna med en lämplig lösning (tabellerna 3 och 4) med en vanlig polyeten 1 mL spruta bifogas ett fint glasrör och 0,22 µm filter.
- Före kontakt med cellen, upprätthålla övertryck och justera pipetten nuvarande noll.
- Efter bildar en gigaohm tätning, applicera undertrycket att brista cellmembranet (hela-cell konfiguration i figur 3F).
9. Aktuellt-clamp analys
- egenskaper hos cellmembranet
- fylla plåstret inspelning pipetter med intracellulära lösningen för ström-clamp inspelningar (tabell 3). Motståndet av pipetten är mellan 4 MΩ och 7 MΩ i aCSF.
- Efter membranet spricker, håll membranet spänningen på -60 mV i V-CLAMP-läge. Växla sedan från " bad " läge att " cell " mode i membran testet använder programvara för att mäta de inneboende cellegenskaperna såsom membran kapacitans, resistans och tidskonstant.
- Aktuella injektion studien
- efter inspelning de inneboende cellegenskaperna, växla läge från V-klämma till spår (jag = 0) /I-CLAMP NORMAL för nuvarande injektion. Observera att flytande junction potential inte bör korrigerade 10.
- Injicera nuvarande i cellen för 300 ms. ändra intensiteten i nuvarande stegvis från − 100 pA till + 550 pA med 50-pA ökar. Räkna antalet spikar (handlingspänningar) framkallas av nuvarande injektionerna.
- Mäter den minsta spänning som behövs för att framkalla en aktionspotential (detta är plasttransistorn).
- Beräkna afterhyperpolarization amplituden som skillnaden mellan spänningen vid spike initiering och lägsta spänning uppnås under afterhyperpolarization 7.
10. Spänning-clamp analys
- The AMPA/NMDA baserat
Obs: The AMPA/NMDA-förhållandet är ett konventionellt sätt att utvärdera postsynaptiska plasticitet glutamatergic retande synapser 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Observera dock att samtidig ökar i båda komponenterna inte kan ändras baserat på 13.- Perfuse inspelning kammaren med fysiologisk lösning bubblade med gasblandningen och hålla temperaturen vid 22 ° C till 25 ° C. Lägg 0,1 mM picrotoxin till lösning att blockera GABA A - medierad reaktion och lägga till 4 µM 2- chloroadenosine att stabilisera evoked neurala svar 14.
- Fylla plåstret inspelning pipetter med den intracellulära lösningen för spänning-clamp recordings (tabell 4). Kontrollera motståndet av aCSF inspelning pipetten. Motståndet är mellan 4 MΩ och 7 MΩ.
- För inspelning i layer II/III pyramidal nervceller i M1, placera en bipolär volfram stimulerande elektrod 200 µm till 300 µm i sidled till cellerna skall registreras under pial ytan i regionen forelimb representation (2 mm i sidled till den mittlinjen) 15 , 16 , 17.
- För inspelning i en CA1 pyramidala neuron, placera den stimulerande elektrod 200 µm till 300 µm laterala (Schaffer säkerheter fiber) eller mediala (temporoammonic vägen) till de celler som kommer att registreras ( figur 3B).
- Öka stimulansen intensiteten upp till synaptic svaret > 10 pA.
- Beräkna förhållandet AMPA/NMDA förhållandet mellan toppströmmen mätt på − 60 mV till nuvarande mätt vid + 40 mV 150 msec efter stimulans debuten. Observera att 50 till 100 spår bör vara i genomsnitt för att beräkna kvoten.
- Miniatyr postsynaptiska nuvarande recordings
Obs: miniatyr excitatoriska postsynaptiska strömmar (mEPSCs) är tänkt att motsvara till de svar som framkallas av presynaptiska frisläppandet av en enda vesikler av glutamat 18 . Däremot är miniatyr hämmande postsynaptiska strömmar (mIPSCs) tänkt att motsvara till de svar som framkallas av presynaptiska frisläppandet av en enda vesikler GABA 18. Ökningar av amplituderna av mEPSCs och mIPSCs speglar postsynaptiska transmission, medan ökar vid frekvens återspegla ökningen av antalet funktionella synapser eller presynaptiska release sannolikheten 11 .- Fylla patch inspelning pipetten med modifierade intracellulära lösning (tabell 4) justera återföring potential GABA A-receptormedierad nuvarande till -60 mV.
- Lägg till 0,5 µM tetrodotoxin till badet att blockera spontana handlingspänningar.
- Håll spänningen vid -60 mV till rEcord de mEPSC händelserna för 5 min.
- Ändra anläggningen potentiella 0 mV till rekord mIPSC händelser för 5 min. Eftersom M1 nervceller visar något högre återföring potential för AMPA receptor-medierad strömmar, mIPSCs av M1 nervceller är inspelade på + 15 mV med 0,1 mM APV.
- Vänta några minuter för aktuellt att stabilisera.
- Spela in mIPSC händelserna för 5 min.
- Identifiera miniatyr händelserna med hjälp av programvaran och använda händelser ovan 10 pA för analys. Räkna antalet mEPSCs eller mIPSCs händelser för 5 min att bestämma frekvensen. Genomsnittlig amplituderna av händelser att få betyder amplituden.
- Bekräfta huruvida bad behandling med 10 µM CNQX eller 10 µM bicucullin methiodide blockerar de mEPSCs och mIPSCs händelserna, respektive.
- Paired-pulse analys
Obs: presynaptiska plasticitet kan analyseras med hjälp av ihopkopplade-pulse analys. En ökning av de parade-pulsen föreslår en minskning av presynaptiska glutamat eller GABA släppa sannolikhet 7 , 10 , 11.- Att analysera retande synapser, Lägg 0,1 mM picrotoxin och registrera svar på -60 mV. Även om vi lagt 4 µM 2-chloroadenosine till badet, vi behöver hålla i åtanke att läkemedlet påverkar den presynaptiska release sannolikhe 14.
- Att analysera hämmande synapser, Lägg 0,1 mM APV och 4 µM 2-chloroadenosine till badet och spela in reaktionen vid 0 mV. I M1 nervceller, spela in svar på + 15 mV.
- Tillämpa Parade pulser med ett mellan stimulus intervall på 100 ms eller 200 ms.
- Spela in 50-100 sekventiell spår på varje anläggning potentiella och genomsnittliga värdena.
- Beräkna Parade puls kvoten som förhållandet mellan den andra toppen den första toppen av postsynaptiska nuvarande.
Representative Results
Som vi beskrev nyligen7, inducerad rotor rod utbildning (figur 1A) dynamiska förändringar i inneboende plasticitet i M1 layer II/III pyramidal nervceller. Mäta latensen tills råttorna falla från roterande staven tillåter oss att uppskatta skickliga lärande prestanda för råtta. Längre latens indikerar bättre motorprestanda. Dag 1 av utbildning förbättrats råttorna sin rotor stav tills rättegången avslutats. På dag 2, råttorna uppnås nästan asymptotiska nivåer i genomsnitt session noter (figur 1B). Jämfört med svarstiden vid första rättegången, post-hoc analys visade signifikanta förbättringar vid de sista uttagningarna på utbildningsdagar (figur 1 c).
Figur 4A visar ett exempel på nuvarande-clamp analys där de neuronala egenskaperna ändras efter motorisk skicklighet lärande. Injektioner av 400 pA och 500 pA strömmar för att inducera handlingspänningar i gruppen otränade och i 1-dagars utbildade råttor, respektive. Däremot var injektion av endast en 150 pA nuvarande tillräcklig för att framkalla handlingspänningar i 2-dagars utbildade råttor. Förhållandet mellan nuvarande intensiteten och antalet handlingspänningar visas i figur 4B. Så lite som 50 pA nuvarande var tillräcklig för att framkalla spikar i 2-dagars utbildade råttor; Däremot svarade 1 dag tränade råttor med färre handlingspänningar än otränade råttor till 350 pA och högre strömmar. Dessutom figur 4 c visar att 1 dag tränade råttor visade lägre vilande potential, högre spike tröskelvärdet, och djupare afterhyperpolarization, medan 2-dagars utbildade råttor visade högre vilande potential (figur 4 c) och membran motstånd ( Figur 4 d).
Som vi beskrivit tidigare11, inducerade IA utbildning (figur 1 d) postsynaptiska plasticitet i retande och hämmande synapser av hippocampus CA1 nervceller. Genom att mäta latensen i ljuslåda, kan vi uppskatta kontextuella lärande prestanda för råtta. Figur 1E visar resultaten av IA uppgiften. Efter det parkopplade elstöt, råttorna lär sig att undvika den mörka sidan av rutan och bo i den upplysta sidan, som brukar de inte föredrar. Tendensen att undvika mörka sida visar därför förvärvet av kontextuella minnen.
Figur 5 visar ett exempel på spänning-clamp analys i vilken miniatyr postsynaptiska strömmar har dramatiskt förändrats efter kontextuella lärande. Att undersöka lärande-inducerad plasticitet, spontana AMPA-medierad mEPSCs och GABAA-medierad mIPSCs spelades sekventiellt i närvaro av 0,5 µM tetrodotoxin (figur 5A och B). Som framgår på tvådimensionella tomter (figur 5 c), hade varje CA1 neuron olika genomsnittliga amplituder för mEPSCs och mIPSCs. Även om amplituderna var låg och visade en smala distribueringsintervallet i otränade, oparade, och genomgång råttor, de var olika i IA-tränade råttor (tabell 5). ANOVA följt av post-hoc analys visade en betydande ökning av de genomsnittliga amplituderna för mEPSC och mIPSC IA-tränade råttor (figur 5E), vilket tyder på lärande-inducerad postsynaptiska plasticitet i CA1 nervceller.
Dessutom visades varje CA1 neuron olika mEPSC och mIPSC frekvenser (figur 5 d). Även om frekvenserna var låg och visade en smala distribueringsintervallet i otränade, oparade, och genomgång råttor, de var olika i IA-tränade råttor (tabell 6). ANOVA följt av post-hoc analys visade en signifikant ökning i frekvensen av händelserna mEPSC och mIPSC IA-tränade råttor (figur 5F). Det finns två möjliga tolkningar av dessa resultat. Först är att kontextuella lärande ökade antalet funktionella synapser av nervceller. Den andra är att kontextuella lärande ökade presynaptiska release sannolikheten för glutamat och GABA.
För att ytterligare undersöka presynaptiska plasticitet, genomförde vi också parat-pulse stimuli, som tidigare rapporterats10,11.
Figur 1 : Lärande prestanda efter utbildning.
A: experimentell design visar rotor rod utbildning och koronalt hjärnan slice. B: genomsnittlig fördröjning att falla från accelererande rotor rod fat. C: genomsnittlig fördröjning att falla bort av staven på först och de sista prövningarna på utbildning dag 1 och 27. P< 0,01 vs. första rättegången. D: Schema för den hämmande undvikande (IA) uppgift och koronala hjärnan slice. E: genomsnittlig fördröjning att ange rutan mörka före och efter IA utbildning11. P< 0,01 vs. före IA träning. Siffrorna av avsnitten koronalt anger avståndet anterior bregma i mm. Antalet djur som visas längst ned i barerna. Felstaplar visar SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Skiva förfaranden.
A: fotografier visar beredning av akut hjärnskada skivor. Dissektion verktygen var kyls i krossad is före användning. B: Brain dissektion och trimning. Observera att vinkeln på trimning på bakre sida måste orienteras parallellt med dendritiska orientering. C: skivning hjärnan i vibratome avdelning. Hjärnan är badar i dissektion buffert och bubblade kontinuerligt med en 5% CO2/95% O2 gasblandning. D: en gränssnitt kammare gjort två plast matbehållare och en silikon tub. Kammaren fylldes med artificiell CSF och bubblade kontinuerligt med gasblandningen. E: hjärnan skivor placerades på våta filterpapper i kammaren.Bar = 5 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Förfaranden för Patch-clamp.
A: patch-clamp systemet används för att registrera elektriska signaler från en nervcell. Platsen för det stimulerande och inspelning elektroder i layer II/III nervceller visas i råtta motoriska cortex. B: för att analysera Schaffer synapserna av en CA1 pyramidala neuron, en stimulerande elektrod placerades på den stratum radiatum. För att analysera temporoammonic synapser, placerades en stimulerande elektrod på de stratum moleculare. Representant spår av evoked AMPA och NMDA receptor-medierad excitatoriska postsynaptiska strömmar i samma CA1 neuron visas. C: en slice ankare användes för att stabilisera segmentet i inspelning kammaren. D: kartan representation i motor cortex, baserat på publicerade artiklar15,16,17. ML = mittlinjen. E: IR-DIC micrographs M1 layer II/III nervceller innan (övre) och under inspelningen (lägre). Bar = 10 µm. F: förändringar i pipetten nuvarande före touch (överst) och membran bristning (botten). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Representativa resultat av ström-clamp analys7 .
A: representativa spår av handlingspänningar registreras efter induktion med nuvarande injektioner. B: relationer mellan den genomsnittliga aktuella ingången (pA) vs. potentiell handling utdata (antal spikar) i hjärnan skivor från otränad (öppen bar), 1-dagars utbildade (grå staplar) och 2-dagars utbildade råttor (fyllda staplar). C: vilande potential, tröskel och afterhyperpolarization av layer II/III nervceller. D: membran motstånd och serie motstånd av nervceller. Vi använde 9-10 råttor i varje grupp. Antalet celler som visas i varje stapel. Felstaplar visar SEM. *P< 0,05, **P< 0,01 vs. otränade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Representativa resultat av spänning-clamp analys11 .
Representativa spår av miniatyr retande och hämmande postsynaptiska strömmar (mEPSCs och mIPSCs) i otränade (A) och hämmande undvikande (IA)-tränade råttor (B). mEPSCs-60 mV och mIPSCs vid 0 mV mättes sekventiellt i samma CA1 pyramidala neuron i närvaro av tetrodotoxin (0,5 µM). Lodrätt streck = 20 pA, räck = 200 msec. C: tvådimensionell tomter av medelvärdet mig (jag) PSC amplituder i otränade, IA-utbildade, oparade, och genomgång råttor. D: tvådimensionell tomter i mig (jag) PSC frekvenser i 4 grupper. Observera att varje CA1 neuron uppvisade olika menar jag (jag) PSC amplituder och frekvenser. IA utbildning inte bara stärkt de genomsnittliga amplituderna (E) men också ökade frekvensen av mig (jag) PSC händelser (F). Vi använde 4-6 råttor i varje grupp. Antalet celler som visas längst ned i barerna. Rött plustecken (C, D) och barer med vertikala linjer (E, F) visar den genomsnittliga ± SEM. **P< 0,01 vs. otränade råttor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Dissektion buffert (totalt 1L) | ||
| NaH2PO4 • 2 H2O | 0,195 g | 1,25 mmol/L |
| KCl | 0.188 g | 2,5 mmol/L |
| CaCl2 | 0,074 g | 0,5 mmol/L |
| MgCl2 • 6 H2O | 1.423 g | 7,0 mmol/L |
| Kolinklorid | 12.579 g | 90 mmol/L |
| Askorbinsyra | 2.340 g | 11.6 mmol/L |
| Pyrodruvsyra | 0.342 g | 3,1 mmol/L |
| NaHCO3 | 2.100 g | 25 mmol/L |
| Glukos | 4.500 g | 25 mmol/L |
Tabell 1: Ett recept för dissektion buffert
| Artificiell CSF (totalt 1L) | ||
| KCl | 0.186 g | 2,5 mmol/L |
| NaCl | 6.700 g | 114,6 mmol/L |
| NaH2PO4 •2H2O | 0,156 g | 1 mmol/L |
| Glukos | 1.800 g | 10 mmol/L |
| NaHCO3 | 2.184 g | 26 mmol/L |
| 1M MgCl2 | 4 mL | 4 mmol/L |
| 1M CaCl2 | 4 mL | 4 mmol/L |
Tabell 2: Ett recept för konstgjorda cerebrospinalvätska (CSF)
| Intracellulära lösning för nuvarande klämman (totalt 200 mL) | ||
| KCl | 0.0746 g | 5 mmol/L |
| K-glukonat | 6.089 g | 130 mmol/L |
| HEPES | 0.476 g | 10 mmol/L |
| EGTA | 0.0456 g | 0,6 mmol/L |
| 1M MgCl2 | 500 ΜL | 2,5 mmol/L |
| Na2 ATP | 0.4408 g | 4 mmol/L |
| Na3 GTP | 0.0418 g | 0,4 mmol/L |
| Na phosphocreatine | 0.510 g | 10 mmol/L |
Tabell 3: Ett recept på en intracellulär lösning för nuvarande klämma inspelning
| Intracellulära lösning för spänningen klämman (totalt 200 mL) | ||||
| CsMeSO3 | 5 | |||
Tabell 4: Ett recept på en intracellulär lösning för spänningen klämman inspelning
| Parametrar | otränade | IA utbildade | oparade | gå igenom | |
| mEPSC amplitud | Varians | 5.8 | 32,1 | 4.7 | 5,9 |
| Standardavvikelse | 2.4 | 5.7 | 2.2 | 2.4 | |
| Variationskoefficient | 0.189 | 0.326 | 0.177 | 0,190 | |
| mIPSC amplitud | Varians | 17,1 | 56,7 | 31,8 | 20,7 |
| Standardavvikelse | 4.1 | 7.5 | 5.6 | 4.5 | |
| Variationskoefficient | 0.279 | 0,387 | 0.367 | 0,286 |
Tabell 5: Mångfalden av miniatyr retande och hämmande postsynaptiska nuvarande (mEPSC och mIPSC) amplituder i hämmande undvikande (IA)-tränade råttor
| Parametrar | otränade | IA utbildade | oparade | gå igenom | |
| mEPSC frekvens | Varians | 278 | 2195 | 188 | 195 |
| Standardavvikelse | 17 | 47 | 14 | 14 | |
| Variationskoefficient | 0.902 | 1.198 | 0.893 | 0.874 | |
| mIPSC frekvens | Varians | 3282 | 27212 | 1385 | 5135 |
| Standardavvikelse | 57 | 165 | 37 | 72 | |
| Variationskoefficient | 1,195 | 1,006 | 0.955 | 0,836 |
Tabell 6: Mångfalden av miniatyr retande och hämmande postsynaptiska nuvarande (mEPSC och mIPSC) frekvenser i hämmande undvikande (IA)-tränade råttor
Discussion
Den största begränsningen av slice patch clamp teknik är inspelningen i slice beredning, som inte kanske återspeglar vad som händer i vivo. Även i vivo ström-clamp analys är mer tillförlitlig, det tekniskt svårt för att få tillräckliga uppgifter från medvetna djur. Eftersom varje pyramidal neuron har olika cellulära egenskaper, behövs ett tillräckligt antal celler att korrekt analysera skillnader i nervceller efter träning. Dessutom kräver spänning-clamp analysen kontinuerlig läkemedelsbehandling med CNQX, APV eller bicucullin att avgöra vilken typ av postsynaptiska svaren. För att analysera de miniatyr svar induceras av en enda vesikler glutamat eller GABA, behövs kontinuerlig behandling med tetrodotoxin att blockera spontana handlingspänningar. Även om den nyligen utvecklade flera photon bildteknik är kraftfull för att analysera morfologiska förändringar vid retande synapser19, behövs en kombinerad patch clamp teknik att analysera funktionen av synapser i vivo. Det är för närvarande ganska svårt att analysera morfologiska förändringar vid hämmande synapser, eftersom mest hämmande synapser inte utgör spines. Vid denna tid vore slice patch klämman den lämpligaste tekniken för att analysera Cellegenskaper eller funktioner av excitatoriska/hämmande synapser i utbildad djur.
Använda aktuell-clamp analys (figur 4), rapporterade vi nyligen motoriskt lärande-inducerad inneboende plasticitet i layer II/III nervceller. Specifikt, 1 dag tränade råttor visade en signifikant minskning i vilopuls membranpotential och en ökning av spike tröskeln. 2-dagars utbildade råttorna uppvisade en betydande ökning i vila membranpotentialen som ledde till ökad retbarhet. Dessa resultat tyder på att det var dynamiska förändringar i inneboende plasticitet av M1 layer II/III nervceller i utbildad råttor. Ytterligare spänning-clamp analysen visade en ökning av förhållandet Parade-pulse i 1 dag tränade råttor, vilket tyder på att det fanns en övergående minskning av presynaptiska GABA release sannolikhet7. Det är därför möjligt att avhämning från GABA på lager II/III synapser kan utlösa resulterande lärande-inducerad plasticitet i M1. Till stöd för detta kräver slice beredning av M1 bad behandling med en GABAA -receptorblockerare inducera LTP20.
Analys av miniatyr postsynaptiska potentialer är ett kraftfullt sätt att upptäcka synaptisk plasticitet i IA-tränade djur. Sekventiell inspelning av mEPSCs och mIPSCs i en enda CA1 neuron tillåter analys av varje enskild neuron excitatoriska/hämmande synaptisk styrka. Sedan en enda mig (jag) PSC svar tillskrivs en enda vesikler glutamat eller GABA, en ökning i mig (jag) PSC amplitud antyder postsynaptiska förstärkning. Hjälp mig (jag) PSC analys, hittade vi individuella skillnader i styrka av excitatoriska/hämmande tillförs varje CA1 neuron (figur 5 c). IA utbildning främjas tydligt mångfald i synaptisk styrka, men detta observerats inte i andra grupper (tabell 5).
Lärande-inducerad synaptic mångfald kan analyseras matematiskt. Genom att beräkna utseende sannolikheten för varje punkt, kan data från varje neuron konverteras till self-entropi (bitars) använder information teorin av Claude E. Shannon21. En punkt med hög utseende sannolikheten (runt den genomsnittliga nivån) visar låg self-entropy, medan en punkt med mycket sällsynta sannolikheten (en avvikit punkt) visar hög self-entropi. Jämfört med otränade råttor, self-entropi per neuron var klart ökat i IA-tränade råttor men inte i oparade eller genomgång råttor22. Denna analys tyder på att det var en ökning av intra-CA1 information efter det kontextuella lärandet.
Slice patch clamp tekniken kan också användas för cued rädsla luftkonditionering studier i laterala amygdala9 och sensorisk upplevelse studier i fat cortex8. Dessutom kan denna teknik användas med olika andra tekniker för vidare utredning. Exempelvis virus-medierad grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta gen leverans teknik kan kombineras med patch clamp teknik för att analysera specifika molekyler funktion. Focal Mikroskop av en retrograd tracer kan dessutom användas för att visualisera specifika nervceller projektet till ett visst område. Sedan, med hjälp av ström-clamp teknik, cell-specifika egenskaper kan analyseras i den visualiserade nervceller23. Ytterligare, kombinera två-photon laserskanning mikroskopi med två-photon laser uncaging av glutamat har använts att demonstrera ryggraden-specifika tillväxt och EPSC svaret i musen kortikala layer II/III pyramidal nervceller19. Således, slice patch clamp tekniken förbättras genom att kombinera det med romanen kemikalier, gen leverans och foto manipulation tekniker.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter. Vi bekräftar att vi har läst tidskriftens ståndpunkt i frågor som rör etiska publikation, och vi bekräftar att detta betänkande är förenliga med dessa riktlinjer. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, insamling av data eller analys, beslut att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr tass-Min-Thein-Oo, Dr Han-Nicke-Zin och Mrs H. Tsurutani för deras tekniskt bistånd. Projektet stöddes av Grants-in-Aid för unga forskare (Håkanson och Y.S.), vetenskapliga forskning B (D.M.), vetenskapliga forskning C (D.M.) och vetenskaplig forskning i innovativa områden (D.M.), från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap, och Tekniken för Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod Treadmills | Med Associates Inc. | ENV577 | |
| inhibitory avoidance box | Shinano Seisakusho | ||
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | ||
| Blade | Nisshin EM Co., Ltd | LC05Z | |
| Cardiac perfusion syringe | JMS Co., Ltd | JS-S00S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT-1200 | |
| Horizontal puller | Sutter Instrument | Model P97 | |
| Microfilm 34 gauge | World Precision Instruments, Inc | MF34G-5 | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Axopatch–1D amplifier | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440 AD board | Axon Instruments | ||
| pCLAMP 10 software | Axon Instruments | ||
| Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| CCD camera | Olympus | U-CMAD3 | |
| Camera controller | Hamamatsu Photonics K.K. | C2741 | |
| Stimulator | Nihon Kohden | SEN-3301 | |
| Isolator | Nihon Kohden | SS-104J | |
| Motorized manipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Micromanipulator | Narishige | NMN-21 | |
| Peristaltic Pump | Gilson, Inc | MINIPULS® 3 | |
| Glass capillary | Narishige | GD-1.5 | |
| Ag/AgCl electrode | World Precision Instruments, Inc | EP4 | |
| Slice Anchor | Warner instruments | 64-0252 | |
| Stimulus electrode | Unique Medical Co., Ltd | KU201-025B | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection buffer/ artificial CSF |
|||
| NaH2PO4 • 2H2O | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries | 163-03545 | |
| CaCl2 | Wako Pure Chemical Industries | 039-00475 | |
| MgCl2 • 6H2O | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich Co. | C7527 | |
| Ascorbic acid | Wako Pure Chemical Industries | 190-01255 | |
| Pyruvic acid Na | Wako Pure Chemical Industries | 199-03062 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich Co. | 28-1850-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich Co. | 07-0680-5 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich Co. | G4500 | |
| HEPES | Wako Pure Chemical Industries | 346-01373 | |
| EGTA | Wako Pure Chemical Industries | 348-01311 | |
| Na2 ATP | Nacalai Tesque | 01072-24 | |
| Na3 GTP | Sigma-Aldrich Co. | G-8877 | |
| Na phosphocreatine | Sigma-Aldrich Co. | P-7936 | |
| CsMeSO3 | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
| CsCl | Wako Pure Chemical Industries | 033-01953 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs in aCSF | |||
| 2-Chloroadenosine | Sigma-Aldrich Co. | C5134 | |
| Picrotoxin | Sigma-Aldrich Co. | P-1675 | |
| Tetrodotoxin | Wako Pure Chemical Industries | 207-15901 | |
| CNQX | Sigma-Aldrich Co. | C239 | |
| APV | Sigma-Aldrich Co. | A5282 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290 (5491), 533-536 (2000).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
- Kida, H., et al. Motor Training Promotes Both Synaptic and Intrinsic Plasticity of Layer II/III. Pyramidal Neurons in the Primary Motor Cortex. Cereb Cortex. 26 (8), 3494-3507 (2016).
- Takahashi, T., Svoboda, K., Malinow, R. Experience strengthening transmission by driving AMPA receptors into synapses. Science. 299 (5612), 1585-1588 (2003).
- Rumpel, S., LeDoux, J., Zador, A., Malinow, R. Postsynaptic receptor trafficking underlying a form of associative learning. Science. 308 (5718), 83-88 (2005).
- Mitsushima, D., Ishihara, K., Sano, A., Kessels, H. W., Takahashi, T. Contextual learning requires synaptic AMPA receptor delivery in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12503-12508 (2011).
- Mitsushima, D., Sano, A., Takahashi, T. A cholinergic trigger drives learning-induced plasticity at hippocampal synapses. Nat Commun. 4, 2760 (2013).
- Kida, H., Mitsushima, D. Patch Clamp Technique in Brain Slices: Recording of Neuronal Activity in the Rat Primary Motor Cortex. Yamaguchi Medical Journal. 63, (2014).
- Watt, A. J., van Rossum, M. C., MacLeod, K. M., Nelson, S. B., Turrigiano, G. G. Activity coregulates quantal AMPA and NMDA currents at neocortical synapses. Neuron. 26 (3), 659-670 (2000).
- Baidan, L. V., Zholos, A. V., Wood, J. D. Modulation of calcium currents by G-proteins and adenosine receptors in myenteric neurones cultured from adult guinea-pig small intestine. Br J Pharmacol. 116 (2), 1882-1886 (1995).
- Tandon, S., Kambi, N., Jain, N. Overlapping representations of the neck and whiskers in the rat motor cortex revealed by mapping at different anaesthetic depths. Eur J Neurosci. 27 (1), 228-237 (2008).
- Adachi, K., Murray, G. M., Lee, J. C., Sessle, B. J. Noxious lingual stimulation influences the excitability of the face primary motor cerebral cortex (face MI) in the rat. J Neurophysiol. 100 (3), 1234-1244 (2008).
- Tennant, K. A., et al. The organization of the forelimb representation of the C57BL/6 mouse motor cortex as defined by intracortical microstimulation and cytoarchitecture. Cereb Cortex. 21 (4), 865-876 (2011).
- Pinheiro, P. S., Mulle, C. Presynaptic glutamate receptors: physiological functions and mechanisms of action. Nat Rev Neurosci. 9 (6), 423-436 (2008).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474 (7349), 100-104 (2011).
- Hess, G., Donoghue, J. P. Long-term potentiation of horizontal connections provides a mechanism to reorganize cortical motor maps. J Neurophysiol. 71 (6), 2543-2547 (1994).
- Shannon, C. E. A mathematical theory of communication. Bell Sys Tech J. 27, (1948).
- Ono, K. M., D, Learning creates diversity of excitatory and inhibitory synapses in the hippocampal CA1: a possible amount of information at a single synapse. J Physiol Sci. 67, (2017).
- Wang, L., Conner, J. M., Rickert, J., Tuszynski, M. H. Structural plasticity within highly specific neuronal populations identifies a unique parcellation of motor learning in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2545-2550 (2011).
