Presentados aquí son dos técnicas de investigación de interacción de proteínas anticuerpo-basado: la inmunofluorescencia y la inmunoprecipitación. Estas técnicas son convenientes para el estudio de interacciones físicas entre proteínas para el descubrimiento de nuevos componentes de vías de señalización celulares y para la dinámica de la proteína de comprensión.
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Artículo de método
Estudio de las interacciones proteína-proteína en la autofagia investigación
En este artículo
Resumen
Resumen
Las interacciones proteína-proteína son importantes cascadas de señalización celular de comprensión identificación vía nuevos componentes y dinámica de proteínas. La mayoría de las actividades celulares requiere interacciones físicas entre proteínas. Para analizar y mapear estas interacciones, se desarrollaron varias técnicas experimentales como herramientas bioinformáticas. La autofagia es un celular reciclado mecanismo que permite a las células hacer frente a diferentes factores de estrés, incluyendo hipoxia, productos químicos y privación de nutrientes. Para entender mejor la autofagia-eventos relacionados con señalización y descubrir nuevos factores que regulan los complejos proteicos en la autofagia, realizamos pantallas de interacción proteína-proteína. Validación de estos resultados requiere el uso de técnicas de inmunoprecipitación y la inmunofluorescencia. En este sistema, interacciones proteína-proteína relacionada con la autofagia específico que descubrimos fueron probadas en Neuro2A (N2A) y líneas de células HEK293T. Detalles de los procedimientos técnicos utilizados se explican en este artículo experimento visualizado.
Introducción
Macroautophagy (autofagia, aquí) es un mecanismo de estrés celular que se caracteriza por el secuestro de citoplasma grueso, proteínas y organelos en vesículas de doble membrana llamados vesículas autofágicas. A través de la fusión de la capa externa de la membrana doble, vesículas autofágicas y su carga se entregan a los lisosomas y degradación en ella1. Autofagia ocurre en bajos niveles basales en todos los tipos celulares y en todos los organismos, realizando funciones homeostáticas como degradación de las proteínas y organelas (p. ej., mitocondrias) facturación. Bajo condiciones de estrés celular, como el hambre, la autofagia es rá....
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Protocolo
1. inmunofluorescencia
- mantener HEK293T riñón embrionario humano células en medio de la glucosa alta de DMEM, y células de neuroblasto de ratón N2A en DMEM bajo medio de glucosa, 5% CO 2-incubador humedecido a 37 ° C. Complementar los medios de cultivo con suero bovino fetal inactivado por calor de 10% (FBS), antibióticos (50 U/mL de penicilina, estreptomicina 50 de μg/mL) y L-glutamina (2 mM).
- Separar las células utilizando tripsina 0.25%. Primero quitar los medios de cultivo celular y luego lavar las células con solución salina 10 mL estéril tamponada con fosfato (PBS) e incubar con 1 mL de tripsina a 37 ° C por 5 min Inactivate trips....
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Resultados
En la figura 1 un ejemplo de una colocalización muestra resultado obtenido mediante este protocolo. Una figura de nuestro reciente libro presenta8. Aquí, proteína endógena RACK1 fue manchada en verde, mientras que LC3 endógena fue manchado en rojo. Los puntos amarillos que se observan en los cuadros combinados indican sitios de traslapo entre las señales verdes y rojas. Así los puntos amarillos representan la co-localización parcial de estas dos proteínas.
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Discusión
Técnicas de inmunoprecipitación e inmunofluorescencia son cruciales para el estudio de las interacciones proteína-proteína. Aunque estas dos técnicas se utilizan y bien establecido, se deben considerar varios criterios para definir la calidad de los experimentos durante el uso de estas técnicas.
En primer lugar, primarios los anticuerpos que se utilizan en estas pruebas deben ser específicos para las proteínas de interés. Para ello, utilizar shRNA caídas o células de nocaut para probar la espe.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por científicos y tecnológicos investigación Consejo de Turquía (TUBITAK) 1001 107T153 de la beca, la Universidad de Sabanci. SEB y NMK cuentan con una beca de TUBITAK BIDEB 2211 para estudios de doctorado.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tripsina EDTA Solución A | Industrias Biológicas | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (glucosa alta) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (glucosa baja) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocitómetro | Sigma | Z359629-1EA | |
| portaobjetos | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| portaobjetos | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lisine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Industrias Biológicas | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehído (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponina | Sigma | 84510 | |
| LC3 Anticuerpo | Sigma | L7543 | |
| Anti-Conejo IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Anticuerpo | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Ratón IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Cloruro de sodio | Applichem | A9242.5000 | |
| Desoxicolato de sodio | Sigma | 30970 | |
| Dodecil sulfato de sodio (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Ortovanadato de sodio | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Anticuerpo | Sigma | A0856 | |
| Glicerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Aplicamiento | A1108.0250 | |
| Azul de bromofenol | Apliquem | A3640.0005 | |
| Leche desnatada | Apliquem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Azida sódica | Riedel de Haen | 13412 | |
| Rojo de fenol | Sigma | 114537-5G | |
| anti-conejo IgG, HRP conjugado | Jackson Immuno. | ||
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Ácido Coumérico | Sigma | C9008 | |
| Peróxido de Hidrógeno | Merck | K35522500604 | |
| anti ratón IgG, HRP conjugado | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Anticuerpo de actina | Sigma | A5441 | |
| Suero normal de conejo | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamicina | Sigma | R0395 | |
| Proteína A-Agarosa Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| suero fetal bovino | Biowest | S1810-500 | |
| solución de penicilina/estreptomicina | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamina | Industrias Biológicas | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Membrana de nitocelulosa | GE Healthcare | A10083108 | |
| Películas de rayos X | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Inhibidor de la proteasa | Sigma | P8340 |
Referencias
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D.
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Reimpresiones y permisos
