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Neuroscience

एक छोटी मात्रा रीसाइक्लिंग में बनाए रखा तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस में Synaptic प्लास्टिक रिकॉर्डिंग-, छिड़काव-, और डुबकी-प्रकार चैंबर प्रणाली

Published: January 1, 2018 doi: 10.3791/55936
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1The Institutes of Brain Science, the State Key Laboratory of Medical Neurobiology, the Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University

Summary

इस प्रोटोकॉल पुनर्नवीनीकरण बफर और जलमग्न तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस में गतिविधि पर निर्भर synaptic प्लास्टिक की methodological पहलुओं की एक छोटी मात्रा में ऑक्सीजन स्तर के स्थिरीकरण का वर्णन करता है ।

Abstract

हालांकि मस्तिष्क स्लाइस पर प्रयोगों १९५१ के बाद से उपयोग में किया गया है, समस्याओं रहते हैं कि क्षेत्र की क्षमता या intracellular रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करते समय synaptic संचरण मॉडुलन का एक स्थिर और सफल विश्लेषण को प्राप्त करने की संभावना को कम. इस पांडुलिपि का वर्णन methodological पहलुओं कि तीव्र मस्तिष्क स्लाइस के रखरखाव के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों में सुधार लाने में सहायक हो सकता है और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डुबकी चैंबर में क्षेत्र उत्तेजक postsynaptic क्षमता रिकॉर्डिंग के लिए एक बहिर्वाह-carbogenation इकाई के साथ । बहिर्वाह-carbogenation के प्रयोगों में ऑक्सीजन के स्तर को स्थिर करने में मदद करता है कि एक छोटे से बफर जलाशय के रीसाइक्लिंग पर निर्भर करने के लिए दवा प्रयोगों की लागत क्षमता में वृद्धि । इसके अलावा, पांडुलिपि प्रतिनिधि प्रयोग है कि विभिंन carbogenation मोड और गतिविधि पर उत्तेजना मानदंड के प्रभाव की जांच प्रस्तुत synaptic संचरण की synaptic प्लास्टिक पर निर्भर है ।

Introduction

१९५१ में, पहली रिपोर्ट तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा प्रयोगों के1आयोजित किए गए थे । १९७१ में, piriform प्रांतस्था2,3 और खोज है कि हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस septotemporal4, में से एक के हिप्पोकैंपस अक्ष के साथ जुड़े रहे है से इन विट्रो रिकॉर्डिंग में सफल होने के बाद इन विट्रो में सबसे पहले हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन गतिविधि की रिकॉर्डिंग5हासिल किया गया था. neurophysiological की समानता या neurostructural मानकों के तहत न्यूरॉन्स की vivo में और इन विट्रो स्थितियों में अभी भी कुछ बहस6के विषय हैं, लेकिन १९७५ में, Schwartzkroin7 संकेत दिया कि बेसल न्यूरॉन्स के गुण विट्रो में बनाए रखा जाता है और कि उच्च आवृत्ति उत्तेजना (यानी, हिप्पोकैम्पस गठन में afferents के tetanization) synaptic क्षमता8के एक लंबे समय से स्थायी सुविधा लाती है. Electrophysiological इन विट्रो में ंयूरॉन गतिविधि की रिकॉर्डिंग बहुत गतिविधि के सेलुलर तंत्र के अध्ययन-निर्भर synaptic प्लास्टिक9,10है, जो आनंद द्वारा १९७३ में खोज की गई थी का विस्तार एट अल. vivo में खरगोश के साथ प्रयोगों में 11 .

न्यूरॉन गतिविधि या मस्तिष्क स्लाइस में संकेत रास्ते का अध्ययन, और विशेष रूप से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस में, अब एक मानक उपकरण है. हालांकि, हैरत की बात है, इन विट्रो प्रयोगों में अभी तक मानकीकृत किया जा करने के लिए है, के रूप में कई दृष्टिकोण है कि अभी भी तैयारी और तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस के रखरखाव के लिए मौजूद द्वारा सबूत । रीड एट अल । (१९८८) 12 स्लाइस कक्षों के विभिन्न प्रकारों और स्नान माध्यम, पीएच, तापमान, और ऑक्सीजन के स्तर के विकल्पों में तीव्र मस्तिष्क स्लाइस के रखरखाव के लिए methodological चुनौतियों की समीक्षा की । इन पैरामीटर्स अभी भी में इन विट्रो स्लाइस रिकॉर्डिंग setups के कस्टम तत्वों के कारण रिकॉर्डिंग चैंबर में नियंत्रण के लिए मुश्किल हैं । प्रकाशनों पाया जा सकता है कि methodological चुनौतियों में से कुछ पर काबू पाने में मदद कर सकते है और इस तरह के एक मध्य 3 डी microperfusion प्रणाली13, बढ़ाया लामिना प्रवाह और ऑक्सीजन के साथ एक चैंबर के रूप में डुबकी टुकड़ा कक्षों के नए प्रकार का वर्णन आपूर्ति14, कंप्यूटरीकृत तापमान नियंत्रण के साथ एक प्रणाली15, और एक बहु-चैंबर रिकॉर्डिंग प्रणाली16। चूंकि इन कक्षों का निर्माण करना आसान नहीं है, इसलिए अधिकांश वैज्ञानिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्लाइस कक्षों पर निर्भर हैं । इन मंडलों एक खुर्दबीन सिस्टम पर रखा जा सकता है, इस प्रकार इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और प्रतिदीप्ति इमेजिंग17,18,19के संयोजन के लिए अनुमति दी । के बाद से इन कक्षों मस्तिष्क कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF), बफर समाधान की एक उच्च प्रवाह दर में डूबे स्लाइस रखने की जरूरत है, दवा आवेदन का खर्च बढ़ रही है । यह अंत करने के लिए, हम बहिर्वाह-carbogenation के साथ एक रीसाइक्लिंग छिड़काव प्रणाली है कि एक डुबकी टुकड़ा एक अपेक्षाकृत छोटे aCSF मात्रा का उपयोग कर चैंबर में क्षेत्र क्षमता की दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग के लिए पर्याप्त स्थिरता प्रदान करता है शामिल है । इसके अलावा, हम संक्षेप कैसे इस प्रायोगिक carbogenation/छिड़काव प्रणाली के उपयोग गतिविधि के परिणाम पर निर्भर synaptic प्लास्टिक की10 और कैसे युकेरियोटिक बढ़ाव कारक-2 कळेनासे (eEF2K) के निषेध को प्रभावित करता है synaptic ट्रांसमिशन20।

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Protocol

पशुओं की देखभाल और मस्तिष्क विज्ञान और फुदन विश्वविद्यालय, शंघाई, चीन के मेडिकल तंत्रिका के राज्य की कुंजी प्रयोगशाला के संस्थानों की प्रक्रियाओं के स्थापित मानकों के अनुसार बनाए रखा गया था ।

1. समाधान तैयारी

नोट: सामग्री की तालिकादेखें ।

  1. टुकड़ा करने की क्रिया बफर तैयार (संशोधित है Gey समाधान): ९२ मिमी NaCl, २.५ मिमी KCl, १.२५ मिमी णः2पीओ4, 30 मिमी NaHCO3, 25 मिमी ग्लूकोज, 20 मिमी HEPES, 3 मिमी ना+-पाइरूवेट, 10 मिमी MgSO4, और ०.५ मिमी CaCl2.
  2. carbogenation के बिना 1 मीटर NaOH का उपयोग कर ७.६ करने के लिए पीएच समायोजित करें ।
  3. बफ़र 4 ° c पर संग्रहीत है ।
    नोट: अनुमापन स्पष्ट है कि बादल तरल । परासरणीयता 305-310 mOsm है । carbogen21 में 5% कार्बन डाइऑक्साइड और ९५% ऑक्सीजन होता है ।
  4. कमजोर द्वारा aCSF तैयार aCSF की एक 10x शेयर समाधान है कि बिकारबोनिट और ग्लूकोज शामिल नहीं है, के एक अंतिम संरचना दे: १२४ mm NaCl, २.५ mm KCl, २.५ mm CaCl2, 2 mm MgCl2, और १.२५ mm KH2PO4।
  5. 10 मिमी ग्लूकोज और 26 मिमी NaHCO3तक पहुंचने के लिए बिकारबोनिट और ग्लूकोज जोड़ें ।
  6. Carbogenate एक अवरुद्ध अंत के साथ एक छिद्रित सिलिकॉन ट्यूब के माध्यम से aCSF NaHCO3जोड़ने के बाद तुरंत.
  7. carbogenating (पीएच 7.3-7.4) करते समय पीएच को मापने ।
    नोट: बफ़र क्षमता NaHCO3की मात्रा में फेरबदल करके थोड़ा समायोजित किया जा सकता है । के बाद से जिसके परिणामस्वरूप पीएच तापमान पर निर्भर है, यह आवश्यक है के परिणामस्वरूप पीएच की जांच करते हुए काम के तापमान (जैसे, 30 डिग्री सेल्सियस) पर carbogenating ।

2. एक्यूट हिप्पोकैम्पस स्लाइस की तैयारी

नोट: सामग्री की तालिकादेखें ।

  1. तीव्र मस्तिष्क स्लाइसें के लिए एक मशीन कक्ष में एक टुकड़ा धारण जाल प्लेस, aCSF के साथ चैंबर को भरने, और carbogenate (4-6 एल/एच.) के लिए 28-30 डिग्री सेल्सियस से कम 30 मिनट22 पर ।
  2. 2-4 ° c के लिए नीचे सर्जिकल उपकरणों शांत ।
  3. एक गिलास ठंडे और carbogenated टुकड़ा करने की क्रिया बफर (2-4 डिग्री सेल्सियस), vibratome के पास एक बर्फ/पानी के मिश्रण में बनाए रखा से भरा चोंच प्लेस ।
  4. Anesthetize चूहों या चूहों जब तक corneal सजगता गायब (30-50 s) एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में एक 2 एल ग्लास जार या १२.५ µ एल में ५०० µ एल लेने के द्वारा isoflurane का उपयोग कर ।
  5. एक विधि वर्णित है और विस्तार में Mathis एट अल के प्रकाशनों में कल्पना का उपयोग कर मस्तिष्क को अलग । (२०११) 23 और Yuanxiang एट अल । (२०१४) 24.
  6. सेरिबैलम और गोलार्द्धों को अलग करने से पहले एक बर्फ ठंड टुकड़ा करने की क्रिया बफर में 2-4 ° c करने के लिए नीचे मस्तिष्क ठंडा (कम 2 मिनट के लिए) ।
  7. एक ठंडे सर्जिकल ब्लेड का प्रयोग करें प्रत्येक गोलार्द्ध25 के पृष्ठीय किनारे के साथ एक ७० ° कोण पर पृष्ठीय प्रांतस्था का एक टुकड़ा टुकड़े ventral और हिप्पोकैंपस के मध्यवर्ती भाग से अनुप्रस्थ स्लाइस प्राप्त करने के लिए, के रूप में चित्रा 1सी में दिखाया गया है और ई.
  8. एक ठंडे दंत सीमेंट रंग के साथ, एक गोलार्द्ध को फ़िल्टर कागज के एक टुकड़े को संक्षिप्त करने के लिए बनाई गई सतह (1-2 s) सूखी हस्तांतरण ।
  9. तेजी से अभिनय चिपकने वाला गोंद का उपयोग कर बर्फ ठंडा टुकड़ा करने की क्रिया मंच पर हौसले से काट सतहों के साथ दो गोलार्द्धों माउंट; गोलार्द्धों के caudal अंत है उस्तरा ब्लेड (चित्रा 1डी) चेहरा ।
  10. एक vibratome के कूलिंग चैंबर में टुकड़ा करने की क्रिया मंच प्लेस और टुकड़ा करने की क्रिया बफर (2-4 डिग्री सेल्सियस) के साथ कि चैंबर भरें । Carbogenate एक छिद्रित सिलिकॉन ट्यूब का उपयोग कर ।
  11. कट ३५० µm पर्याप्त vibratome सेटिंग्स का उपयोग स्लाइसें (उदा., ब्लेड आगे गति: १.२ mm/एस, ब्लेड आयाम: 1 मिमी) ।
  12. subiculum और entorhinal से हिप्पोकैम्पस गठन को अलग कर दो इंजेक्शन cannulas (& #62; 28 ग्राम) का प्रयोग कर कैंची के रूप में cortices ।
  13. एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर पहले से तैयार मशीन चैंबर के स्लाइस-पकड़े जाल से बुलबुले निकालें ।
  14. स्लाइसें कि मशीन कक्ष के जाल पर टुकड़ा करने की क्रिया मंच से परत pyramidale में कुछ पारदर्शिता है हस्तांतरण । किसी भी तह से बचें, खींच, अतिव्यापी, और एक बड़े मुंह पाश्चर पिपेट में aspirating aCSF और टुकड़ा द्वारा तैर ।
    नोट: पूरी प्रक्रिया (कदम 2.5-2.14) 5-10 मिनट लग सकते हैं; इसलिए, यह 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए समय के साथ बफर समाधान के तापमान की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  15. 30 डिग्री सेल्सियस से कम 1.5-2 ज के लिए मशीन चैंबर में स्लाइसें और 4-6 एल पर carbogen प्रदान करें/
    नोट: carbogen की प्रवाह दर को समायोजित करने के लिए मशीन में बफर प्रसारित, लेकिन तैर से स्लाइस को रोकने के ।

3. छोटे जलाशयों के aCSF रीसाइक्लिंग के लिए Carbogenation का संशोधन

  1. रीसाइक्लिंग सिस्टम (चित्रा 2बी) के बहिर्वाह के लिए एक 3 तरह ट्यूब संबंधक जोड़ें ।
  2. एक carbogen आपूर्ति ट्यूब के साथ 3 तरह ट्यूब संबंधक के मध्य हाथ कनेक्ट और एक airflow मीटर (3-4 एल/एच, चित्रा 2डी और चित्रा 4सी) के साथ प्रवाह की दर को विनियमित ।
  3. रीसाइक्लिंग सिस्टम के प्रवाह के लिए एक दूसरा 3 तरह ट्यूब कनेक्टर जोड़ें । इनलाइन हीटर का सामना करना पड़ ट्यूब के लिए मध्य हाथ कनेक्ट, एक पतली सिलिकॉन ट्यूब (10 सेमी लंबाई) के ऊपरी हाथ, और जलाशय से बहिर्वाह ट्यूब के लिए कम हाथ (कम पास फिल्टर; चित्र 4 ग) ।
  4. ट्यूब के साथ एक स्थिति में एक पतली सिलिकॉन ट्यूब (आयुध डिपो: 2 मिमी) पर एक ट्यूब निचोड़ने प्लेस जहां स्लाइस चैंबर में aCSF की धड़कन, सिकुड़नेवाला पंप द्वारा उत्पंन, अपने ंयूनतम पर है ।
    नोट: बहिर्वाह-carbogenation (बहिर्वाह-carb.) संशोधन aCSF जलाशय की मात्रा के लिए carbogenation स्तर की संवेदनशीलता को कम कर देता है, aCSF रीसाइक्लिंग दर, और छोटे aCSF जलाशयों के भीतर रिश्तेदार ट्यूब पदों (& #60; ५० मिलीलीटर; चित्र 3) । कम पास फिल्टर के बारे में, पतली सिलिकॉन ट्यूब में हवा की एक निश्चित राशि aCSF प्रवाह की धड़कन कम कर देता है; इस प्रकार, ट्यूब ज्यादातर हवा के साथ भरा जाना चाहिए ।

4.एक डुबकी स्लाइस चैंबर में Synaptic प्रतिक्रियाओं रिकॉर्डिंग

नोट: सामग्री की तालिकादेखें ।

  1. पूर्व के बारे में 28-30 ° c करने के लिए एक जल स्नान में aCSF समाधान गर्म (यह रिकॉर्डिंग चैंबर में बुलबुला गठन को रोकने जाएगा) ।
  2. रीसाइक्लिंग सिस्टम (4-5 एमएल/शुरू) और इनलाइन हीटर सक्रिय करने के लिए सिस्टम को कम से equilibrate 1 ज ।
  3. कागज और एक नायलॉन कुछ मिनट के लिए डुबकी स्लाइस चैंबर में एक यू के आकार का प्लैटिनम तार पर तय की मेष सफाई लेंस का एक छोटा सा टुकड़ा (चित्रा 4) भिगोना ।
  4. यू के आकार का प्लैटिनम वायर निकालें ।
  5. बंद रिसाइकिलिंग स्विच और लेंस कागज सफाई पर एक टुकड़ा जगह है ।
  6. तुरंत स्लाइस के शीर्ष पर टुकड़ा पकड़ जाल जगह है, पंप पर स्विच, और aCSF में उद्देश्य सूई के बिना 30 मिनट के लिए टुकड़ा equilibrate चलो ।
  7. borosilicate micropipette (यानी, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड) aCSF (टिप प्रतिरोध: 1-2 MΩ, aCSF के साथ 1/3 भर) के साथ भरें और पिपेट धारक में माउंट ।
  8. यह NaHCO3 समाधान में रखकर धातु उत्तेजना इलेक्ट्रोड के इंसुलेशन की जांच करें (& #62; ४० mM) । एक डीसी वोल्टेज जनरेटर के नकारात्मक ध्रुव के लिए इलेक्ट्रोड कनेक्ट (1-2 वी, सकारात्मक ध्रुव: चांदी या प्लैटिनम तार), और एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत टिप पर बुलबुले के गठन का पालन (& #62; 60x आवर्धन).
  9. जगह का परीक्षण epoxy-जोड़ तोड़ में टंगस्टन उत्तेजना इलेक्ट्रोड और टुकड़ा चैंबर में संदर्भ तारों ।
  10. चैंबर के लिए एक दूसरे संदर्भ इलेक्ट्रोड जोड़ें और यह रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के headstage के संदर्भ सॉकेट से कनेक्ट (चित्रा 4ए).
  11. एम्पलीफायर नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, "शून्य दबाना मोड" बॉक्स पर क्लिक करें और "आउटपुट लाभ सूची" बॉक्स डबल क्लिक करके आगे बढ़ना. का एक लाभ चुनें "१००," डबल-क्लिक करें "उच्च पास फ़िल्टर सूची बॉक्स (बिसेल)," चुनें "०.१ हर्ट्ज," और डबल क्लिक करें "कम पास फ़िल्टर सूची बॉक्स (AC)" चुनने के लिए "3 kHz."
  12. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में, पर क्लिक करें "मोल | प्रोटोकॉल खोलें. " एक प्रोटोकॉल है कि सेटिंग्स प्रासंगिक उत्तेजना के लिए अनुमति देता है और 10-20 kHz पर प्रवर्धित क्षमता के डिजिटलाईजेशन 50-100 ms के लिए और है कि स्वचालित रूप से एक प्रासंगिक रिकॉर्डिंग के शुरू होने के बाद एक प्रेरणा अलग 10 ms चलाता है चुनें ।
  13. उत्तेजना प्लेस और लाइन और परत pyramidale के समानांतर में इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग, उदाहरण के लिए (चित्रा 4बी और चित्रा 5) ।
  14. क्लिक करें "मोल | प्रोटोकॉल संपादित करें "और" ट्रिगर "टैब चुनें (पॉप अप विंडो में). "ट्रिगर स्रोत" बॉक्स पर क्लिक करें और "अंतरिक्ष बार" ट्रिगर स्रोत के रूप में चुना है । "ठीक" बटन पर क्लिक करें । अधिग्रहण शुरू करने के लिए "रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक करें और एक ट्रिगर बटन के साथ पॉप-अप विंडो पर ध्यान दें ।
  15. उत्तेजना में अलग सॉफ्टवेयर, "वोल्टेज नियंत्रण" बॉक्स पर क्लिक करें और "0 प्रवेश." "डाउनलोड" बटन पर क्लिक करें । "रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर" खिड़की पर क्लिक करें और अंतरिक्ष बार दबाएँ. इस चक्र को क्रमिक रूप से 1 से 8 तक मानों में प्रवेश करके दोहराएँ, उदाहरण के लिए, "वोल्टेज नियंत्रण" बॉक्स में 1 एमवी चरणों में.
  16. fEPSP-ढलान मूल्यों के साथ उत्तेजना ताकत सहसंबंधी और उत्तेजना शक्ति fEPSP-ढाल अधिकतम के ४०% पाने के लिए आवश्यक निर्धारित करते हैं । "वोल्टेज नियंत्रण बॉक्स" पर क्लिक करें और निर्धारित मूल्य दर्ज. "डाउनलोड" बटन पर क्लिक करें ।
    नोट: एक प्रेरणा अलग मस्तिष्क ऊतक के लिए संक्षिप्त वोल्टेज या वर्तमान दालों को लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है. biphasic दालों में १०० µs प्रति चरण हो सकती है ।
  17. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में, stop बटन और फिर "मोल" मेनू पर क्लिक करें । "संपादन प्रोटोकॉल" पर क्लिक करें और पॉप-अप विंडो में "ट्रिगर" टैब चुनें. ट्रिगर स्रोत बॉक्स पर क्लिक करें और ट्रिगर स्रोत के रूप में "आंतरिक टाइमर" चुना. "ठीक" बटन पर क्लिक करें । प्रत्येक 30 s, उदाहरण के लिए फ़ील्ड क्षमता की स्वचालित रिकॉर्डिंग प्रारंभ हो जाता है जो रिकॉर्ड बटन क्लिक करें । 30-60 मिनट के बाद "stop" बटन पर क्लिक करें ।
  18. पर क्लिक करें "प्राप्त" मेनू पर क्लिक करें "पर खुला प्रोटोकॉल," synaptic प्लास्टिक की वांछित प्रेरण प्रोटोकॉल चुनें, और क्लिक करें "ठीक है" बटन । स्वचालित रूप से उच्च आवृत्ति उत्तेजना और रिकॉर्डिंग को सक्रिय करने के लिए "रिकॉर्ड" बटन पर क्लिक करें । "stop" बटन पर क्लिक करें ।
    नोट: synaptic प्लास्टिक से संबंधित अध्ययन के मामले में लंबे समय तक आधारभूत रिकॉर्डिंग के बाद दीर्घकालिक potentiation या दीर्घकालिक अवसाद के लिए मानक प्रेरण मानदंड में से एक लागू होते हैं । synaptic संचरण के परिणामस्वरूप मॉडुलन के प्रतिनिधि उदाहरण चित्रा 7 और चित्रा 8में चित्रित कर रहे हैं.
  19. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में, क्लिक करें "मोल | खुला प्रोटोकॉल "और चरण ४.१२ में के रूप में एक ही प्रोटोकॉल चुनें । "ठीक" बटन क्लिक करें, और उसके बाद "रिकॉर्ड." उदाहरण के लिए, 2-4 h के लिए फ़ील्ड संभावित रिकॉर्डिंग स्वचालित रूप से चालू रखें । रिकॉर्डिंग समाप्त करने के लिए "stop" बटन पर क्लिक करें ।
  20. दवा अध्ययन के मामले में, स्थायी यौगिक प्रशासन (चित्रा 6) वांछित है अगर aCSF जलाशय के लिए सीधे यौगिक लागू होते हैं.

5. सेटअप और संकेत सफाई

नोट: सामान्य युक्तियों के लिए नीचे देखें.

  1. 10% H2o2 के लिए रिसाइकिलिंग द्वारा प्रणाली साप्ताहिक साफ 20 से अधिक मिनट के लिए, के साथ धोने के द्वारा पीछा किया ज2हे ।
    नोट: इथेनॉल सफाई के लिए अनुशंसित नहीं है । यह इसी तरह के संदर्भ तारों और उद्देश्य में विसर्जित करने के लिए अनुशंसित नहीं है एच2ओ2.
  2. ०.१ एन एचसीएल और फिर पानी के साथ उद्देश्य लेंस या चैंबर परिवेश की सतह पर उपजी नमक निकालें ।
  3. आसुत जल या ०.१ एन एचसीएल में carbogen bubbler धो लो ।
  4. 5 मिनट के लिए 10% एच2हे2 में स्लाइस मशीन चैंबर विसर्जित कर दिया और फिर अच्छी तरह से के साथ मशीन चैंबर कुल्ला एच2ओ ।
  5. धातु उत्तेजना इलेक्ट्रोड के मामले में, प्रत्येक प्रयोग के बाद पानी के साथ उत्तेजक इलेक्ट्रोड टिप कुल्ला और धीरे अवशिष्ट ऊतक को दूर करने के लिए इथेनॉल के साथ लथपथ एक कपास की गेंद के साथ उत्तेजक इलेक्ट्रोड टिप पोंछ.
  6. के साथ एक सावधान कड़ी चोट के माध्यम से टिप पर इंसुलेशन निकालकर वाणिज्यिक धातु उत्तेजना इलेक्ट्रोड के प्रतिरोध को कम करें ।
  7. aCSF से carbogen के नुकसान को कम करते हुए ट्यूब के माध्यम से रिसाइकिलिंग polytetrafluoroethylene ट्यूबों के साथ सिलिकॉन ट्यूबों की जगह द्वारा ।
  8. तार की सतह पर AgCl फार्म के लिए कई दिनों के लिए ब्लीच में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड और संदर्भ इलेक्ट्रोड के चांदी के तारों रखें.

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Representative Results

प्रोटोकॉल अनुभाग में, हम हिप्पोकैम्पस गठन के ventral और मध्यवर्ती भाग से तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस की तैयारी का वर्णन (चित्रा 1) पुरुष C57BL/6 चूहों और पुरुष Wistar चूहों (5-8 सप्ताह). स्लाइसर प्लेटफ़ॉर्म पर गोलार्द्धों की स्थिति उन्हें स्थिर रखने में मदद करता है और आगर या agarose के साथ स्थिरीकरण की आवश्यकता को निकालता है । छिड़काव प्रणाली ही एक सिकुड़नेवाला उच्च रोटेशन पर संचालित पंप के लिए तरल की आवश्यकता प्रवाह दर देने पर आधारित है । इस प्रकार, पंप के भीतर मानक ट्यूबों के तेजी से उंर बढ़ने एक पर्याप्त समस्या है कि हम गैर का उपयोग करके overcame सिलिकॉन ट्यूबों (आईडी: १.०२ mm) बनाया । बहिर्वाह के लिए नकारात्मक दबाव भी दो समानांतर से जुड़े ट्यूबों कि २.७९ mm का एक भीतरी व्यास है द्वारा बनाई गई है । इन दो ट्यूबों रिकॉर्डिंग चैंबर में एक प्रवेशनी से जुड़े हुए है तरल की आकांक्षा (चित्रा 4ए) के लिए अनुमति देते हैं । जलाशय में aCSF के carbogenation दर कई घंटे से अधिक स्थिर होना चाहिए, जो छोटे pores के साथ वेंटिलेशन पत्थर या ट्यूबों का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए मुश्किल हो सकता है । के बाद से बहिर्वाह-carbogenation छोटे pores पर भरोसा नहीं करता है, समय के साथ carbogen प्रवाह दर स्थिर (चित्रा 2) रहता है । यदि प्रयोग एक छोटे aCSF जलाशय के साथ आयोजित कर रहे हैं, बहिर्वाह-carbogenation को भंग ऑक्सीजन का एक संतुलन को प्राप्त करने में मदद करता है (चित्रा 3) । इसके अलावा, यह एक बदल प्रवाह के आधार पर प्रयोगों के बीच ऑक्सीजन स्तर की परिवर्तनशीलता को कम/बहिर्वाह ट्यूब स्थिति, सक्रिय की संख्या carbogen बुलबुला ट्यूबों में pores, और तरल रीसाइक्लिंग दर ।

टुकड़ा लेंस कागज पर रखा नीचे से कुछ तरल मुद्रा (चित्रा 4ए) की अनुमति है । चूंकि स्लाइस चैंबर एक 40X उद्देश्य से सुसज्जित है कि एक ईमानदार खुर्दबीन पर रखा जा सकता है, इलेक्ट्रोड की स्थिति अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है (चित्रा 4बी और चित्रा 5). इससे आगे दिन-प्रतिदिन के कार्य में होने वाले प्रयोगों की परिवर्तनशीलता कम होती है.

को उत्तेजना क्षेत्र क्षमता की आधारभूत रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक शक्ति का निर्धारण, उत्तेजना शक्ति पर क्षेत्र संभावित आकार की निर्भरता अलग उत्तेजना शक्तियों पर fEPSPs रिकॉर्डिंग द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए (चित्रा 5 ). इनपुट की माप-आउटपुट विशेषता उच्च उत्तेजना शक्तियों पर टुकड़ा पर कुछ तनाव पैदा करता है । इस प्रकार, एक और दृष्टिकोण के लिए एक उत्तेजना ताकत है कि सिर्फ fEPSP में एक सकारात्मक जनसंख्या स्पाइक घटक उदाहरण के लिए खोज है-क्षय ( चित्रा 5में काले तीर)26।

न्यूनतम 30 मिनट के लिए एक स्थिर आधार रेखा रिकॉर्डिंग के बाद, दवा प्रशासन शुरू कर सकते हैं । यहां, हम synaptic संचरण पर एक eEF2K अवरोध करनेवाला के प्रभाव का एक उदाहरण प्रस्तुत किया । eEF2K के निषेध synaptic संचरण को बढ़ावा देता है (चित्रा 6ए), एक प्रभाव है कि p38 MAPK (चित्रा 6बी)20के अवरोध से तनु था ।

गतिविधि पर निर्भर synaptic प्लास्टिक उत्तेजना मानदंड की एक किस्म के द्वारा प्रेरित किया जा सकता है10। यहां, हम synaptic प्लास्टिक की है कि उत्तेजनाओं के एक सतत अनुक्रम पर आधारित है के प्रतिनिधि प्रयोग प्रस्तुत १०० हर्ट्ज पर और दोहराया उत्तेजना पर 15 मिनट से अधिक 1 हर्ट्ज पर । synaptic ट्रांसमिशन के परिणामस्वरूप मॉडुलन चित्रा 7 और चित्रा 8में चित्रित किया गया है. इसके अलावा, यह चित्रा 7 और चित्रा 8 में दिखाया गया है कि बहिर्वाह-carbogenation द्वारा छोटे बफर जलाशयों के ऑक्सीजन स्तर के स्थिरीकरण (सफेद हलकों, सापेक्ष ऑक्सीजन स्तर 24-40 मिनट में चित्रा 3में) LTP सुधार और जलाशय के साथ प्रयोगों की तुलना में लिमिटेड प्रेरण-carbogenation केवल (ग्रे हलकों, 7-24 मिनट में ऑक्सीजन स्तर) । हम बहिर्वाह-carbogenation और जलाशय-carbogenation (7-24 मिनट) के संयोजन का परीक्षण नहीं किया क्योंकि हम कम और सरल carbogen उपयोग के साथ एक प्रयोगात्मक प्रणाली बनाने में रुचि रखते थे । कोई रिसाइकिलिंग के साथ जलाशय-carbogenation (7 मिनट तक) aCSF जलाशय में ऑक्सीजन की आधारभूत स्तर का प्रतिनिधित्व करता है ।

Figure 1
चित्र 1: एक vibratome का उपयोग कर हिप्पोकैंपस के अनुप्रस्थ स्लाइस प्राप्त करने के लिए मस्तिष्क गोलार्द्धों पोजिशनिंग. (क) हिप्पोकैम्पस गठन एक पुनर्निर्माण माउस मस्तिष्क मॉडल के भीतर, हरे रंग में, दाएँ गोलार्द्ध के एक पार्श्व दृश्य में संकेत दिया है. (B) हिप्पोकैम्पस गठन का एक ventral दृश्य । (C) rostral-से-caudal दृश्य क्षैतिज विमान में दाएं गोलार्द्ध के लिए हिप्पोकैम्पस गठन के ventral और मध्यवर्ती भाग के अनुभाग को प्रदर्शित करता है । हिप्पोकैंपस के septotemporal अक्ष के साथ विभिंन क्षेत्रों के बाद से इन्नेर्वतिओन और समारोह के विभिंन डिग्री है31,३२, एक अलग काटने कोण पृष्ठीय हिप्पोकैंपस के अनुप्रस्थ स्लाइस के लिए आवश्यक है, के लिए उदाहरण. स्केल बार = 3 मिमी (क्षैतिज सफेद लाइनें) । (D) फ़ोटो किसी vibratome प्लेटफ़ॉर्म पर चिपके हुए चूहे के मस्तिष्क के गोलार्द्धों को दिखाता है । स्केल बार = 6 मिमी । (E) स्केच को अलग दाएँ गोलार्द्ध के प्रांतस्था (ऊपरी स्कीमा) के पृष्ठीय किनारे को ट्रिम करने के लिए कोण को चित्रित किया गया है (डॉटेड काली रेखा) और रोटेशन (लाल तीर) को टुकड़ा करने की क्रिया मंच पर बनाई गई सतह पर मस्तिष्क को । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : ५० एमएल नीचे aCSF जलाशयों के लिए carbogenation प्रणाली के तत्वों । (क) मानक carbogenation प्रणाली का उपयोग (क) एक carbogen बुलबुला डिवाइस के रूप में छिद्रित ट्यूबों; एक ट्यूब एक २५० µm व्यास स्टेनलेस स्टील वायर के साथ कई पंचर द्वारा छिद्रित किया गया था । (ख) बहिर्वाह-carbogenation द्वारा (ख) एक 3 तरह ट्यूब कनेक्टर (भीतरी व्यास: 2 मिमी) या (ग) एक वेंट इकाई है कि एक hydrophobic फिल्टर के साथ तरल वापस प्रवाह रोकता है ।3 तरह के ट्यूब कनेक्टर के मध्य हाथ एक नापने के बाद एक carbogen टैंक से जुड़ा हुआ है (गैस दबाव: & #60; 1 एटीएम) और एक प्रवाह मीटर । शेष हथियार aCSF बहिर्वाह ट्यूब के भीतर जुड़े हुए हैं । (D) carbogen प्रवाह दर को प्रवाह मीटरों द्वारा नियंत्रित किया जाता है । प्रयोगों के दौरान, aCSF जलाशयों को 28-30 ° c में रखा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: विभिंन स्थितियों में aCSF के ४० मिलीलीटर में ऑक्सीजन का स्तर । जलाशय के दौरान ऑक्सीजन स्तर-carbogenation (res.-carb.) और aCSF रीसाइक्लिंग लगातार कम (ग्रे-भरा हलकों, n = 3) । हालांकि, बहिर्वाह-carbogenation (बहिर्वाह-carb.) aCSF रीसाइक्लिंग के दौरान ऑक्सीजन स्तर है, जो आधारभूत स्तर पर संतुलन (सफेद-भरा हलकों, n = 3) पर पहुंच की गिरावट को कम कर दिया । आधारभूत स्तर res के साथ मापा गया ।-carb. बिना aCSF रीसाइक्लिंग । अनुलंब डॉटेड धूसर रेखाएं भिंन carbogenation प्रोटोकॉल के लिए स्विच को इंगित करती हैं । res के प्रभाव.-रीसाइक्लिंग (7-24 मिनट) और बहिर्वाह-carb के साथ carb । रीसाइक्लिंग (सफेद हलकों, 24-40 मिनट) LTP और लिमिटेड के प्रेरण के साथ चित्रा 7 और चित्रा 8में चित्रित कर रहे हैं । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 : एक डुबकी स्लाइस चैंबर में प्रयोगों के लिए बहिर्वाह-carbogenation के घटक. (क) डुबकी स्लाइस चैंबर की प्रस्तुति. यू के आकार का एक हिप्पोकैम्पस टुकड़ा पकड़े नायलॉन फाइबर के साथ प्लैटिनम तार दर्शाया गया है । चांदी के तार एक छोटे से प्रवेशनी के आसपास लिपटे थे, एक तार बनाने के लिए चांदी के तार समाप्त होने के क्षेत्र में वृद्धि । उत्तेजना संदर्भ तार बहिर्वाह चैंबर में रखा गया था, और रिकॉर्डिंग संदर्भ मुख्य कक्ष में था । विभिन्न तरल स्तर पर संदर्भ इलेक्ट्रोड संभावित स्थिर रखने के लिए, रिकॉर्डिंग संदर्भ तार एक प्लास्टिक ट्यूब से अछूता किया जा सकता है, केवल "पानी" के भाग के तार बफर को उजागर छोड़ने. (B) उज्ज्वल-फ़ील्ड छवि एक प्रतिनिधि तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस और इलेक्ट्रोड दिखाता है । CA1, CA3: कोर्नु Ammonis 1, 3; DG: dentate गाइरस; उप: subiculum; EC: entorhinal प्रांतस्था. (ग) योजनाबद्ध बहिर्वाह के मुख्य घटकों पर प्रकाश डाला गया-carbogenation, carbogen और सिकुड़नेवाला पंप के लिए प्रवाह मीटर का एक संकेत के बिना । एक कम पास फिल्टर इनलाइन हीटर के सामने सिर्फ aCSF प्रवाह की धड़कन को कम करने के लिए रखा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : उत्तेजना शक्ति और इलेक्ट्रोड की स्थिति पर क्षेत्र संभावित आकार की निर्भरता. (एक) क्षेत्र की क्षमता के प्रतिनिधि उदाहरण, परत pyramidale (str. pyr.) से अलग दूरी पर पैदा की, और उत्तेजना ताकत चित्रित कर रहे हैं । क्षैतिज काले तीर क्षेत्र संभावित क्षय में जनसंख्या स्पाइक के सकारात्मक स्रोत घटक संकेत मिलता है । जनसंख्या स्पाइक के सकारात्मक स्रोत घटक लगभग प्रारंभिक fEPSP वृद्धि चरण के मध्य में सभी परीक्षण "में लाइन" इलेक्ट्रोड स्थिति, सेल शरीर परत (ई) के बहुत करीब एक को छोड़कर रह गया । (B) जनसंख्या स्पाइक के धनात्मक स्रोत घटक की स्थिति उत्तेजना और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के ग़लत संरेखण के कारण बहुत भिंन होती है । एलएसी.: परत lacunosum आण्विक; रड.: परत radiatum; Pyr.: परत pyramidale; आरईसी.: इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग; Stim.: उत्तेजना इलेक्ट्रोड. स्केल बार = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 : हिप्पोकैम्पस synaptic संचरण पर एक eEF2K अवरोधक के प्रभाव का प्रतिनिधि उदाहरण बहिर्वाह का उपयोग-carbogenation, एक छोटे से aCSF जलाशय के पुनर्चक्रण के साथ20 . 20 मिनट के लिए 1 मिनट के अंतराल पर fEPSPs रिकॉर्डिंग के बाद, eEF2K अवरोधक एक-४८४९५४ aCSF जलाशय (क्षैतिज रेखा) के लिए सीधे जोड़ा गया था । synaptic ट्रांसमिशन की तेजी से वृद्धि (सफेद-भरे घेरे) का पता लगाना था । दवा लागू नहीं किया गया था, fEPSP-ढाल रिकॉर्डिंग (ग्रे-भरे हलकों) के समय पर स्थिर रहे । (B) p38 MAPK अवरोध करनेवाला (धूसर क्षैतिज रेखा) के अनुप्रयोग ने क्षेत्र क्षमता के eEF2K inhibito-प्रेरित वृद्धि को रोका । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: गतिविधि के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग-synaptic संचरण के आश्रित potentiation बहिर्वाह का उपयोग-carbogenation (बहिर्वाह-carb.; सफेद हलकों) और जलाशय-carbogenation (res.-carb.; काले हलकों), एक छोटे से aCSF के पुनर्चक्रण के साथ जलाशय. potentiation समय बिंदु 0 से तीन बार १०० हर्ट्ज/s गाड़ियों (Tet.: tetanization, उच्च आवृत्ति उत्तेजना) के बाद प्रेरित किया गया था । डेटा मतलब ± SEM. ब्रैकेट के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं: समय बिंदु प्रति समूहों की सांख्यिकीय तुलना; न बिगड़ा टी परीक्षण, मान अनुरूप मानक विचलन नहीं. * प & #60; ०.०५.कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 8
चित्र 8 : गतिविधि की निर्भरता-उत्तेजना शक्ति और carbogenation पर synaptic संचरण के आश्रित अवसाद । (क) जलाशय का प्रयोग-carbogenation (res.-carb.) एक बड़ी aCSF मात्रा के पुनर्चक्रण के साथ, 15 मिनट के लिए 1 हर्ट्ज उत्तेजना अधिक से अधिक fEPSP के ८०%-ढलान synaptic संचरण की एक मजबूत अवसाद पैदा (सफेद हलकों) । हालांकि, के रूप में प्रतिनिधि fEPSP निशान से पहले (काले ट्रेस) और बाद (११०वें मिनट में लाल ट्रेस) लिमिटेड प्रेरण संकेत मिलता है, presynaptic फाइबर वॉली (ऊर्ध्वाधर काले तीर) बहुत कम हो गया था । यह एक संकेत है कि उत्तेजना इलेक्ट्रोड पर विद्युत प्रक्रियाओं afferents को नुकसान पहुंचा सकता है उदाहरण है, एक अवसाद है कि लिमिटेड पर आंशिक रूप से निर्भर तंत्र से संबंधित नहीं है कारण । fEPSP के ५०% करने के लिए उत्तेजना ताकत को कम करने-ढाल अधिकतम एक कम डिग्री करने के लिए synaptic संचरण के अवसाद प्रेरित है, लेकिन presynaptic फाइबर वॉली (भूरे भरे हलकों) को बदलने के बिना. (ख) लिमिटेड प्रेरण fEPSP के एक स्थाई अवसाद पैदा नहीं किया-जलाशय के साथ प्रयोगों में ढलानों-carbogenation और एक छोटे से aCSF जलाशय (res.-carb.; ग्रे-भरे चौकों) के पुनर्चक्रण । (ग) एक छोटे से aCSF जलाशय के पुनर्चक्रण के साथ बहिर्वाह-carbogenation लिमिटेड प्रेरण के परिणाम में सुधार हुआ । संमिलित करता है वर्तमान प्रतिनिधि fEPSPs से पहले (काले निशान) और उसके बाद (११०गु मिन, लाल निशान) लिमिटेड प्रेरण । प्रतिनिधि fEPSPs के लिए, ऊर्ध्वाधर पैमाने सलाखों के 1 mV इंगित करता है, और क्षैतिज पैमाने सलाखों के अनुरूप 2 ms. डेटा एक्यूट हिप्पोकैम्पस स्लाइस (३५० µm) से प्राप्त किया गया था 1 करने के लिए 2 महीने पुराने C57/बीएल 6 चूहों और अर्थ ± SEM. कोष्ठक के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं : समय बिंदु प्रति समूहों की सांख्यिकीय तुलना; न बिगड़ा टी परीक्षण, मान अनुरूप मानक विचलन नहीं. * p & #60; ०.०५, ns: गैर-भरपुर. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हालांकि इंटरफेस स्लाइस मंडलों और अधिक मजबूत synaptic प्रतिक्रियाओं25,26,27,28, डुबकी कक्षों पैच-दबाना रिकॉर्डिंग और प्रतिदीप्ति के लिए अतिरिक्त सुविधा प्रदान प्रदर्शन इमेजिंग. इस प्रकार, हम तीव्र हिप्पोकैम्पस स्लाइस में क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग के कई पहलुओं का वर्णन किया है कि आसानी से ंयूरॉंस में प्रतिदीप्ति जांच की इमेजिंग करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है एक वाणिज्यिक डुबकी स्लाइस चैंबर का उपयोग कर17,18, 19. टुकड़ा तैयारी25के अलावा, कई घंटे के बाद रिकॉर्डिंग चैंबर में एक निरंतर carbogen स्तर के रखरखाव बाधाओं में से एक का प्रतिनिधित्व करता है । चूंकि carbogen स्तर aCSF जलाशय के प्रारंभिक संतृप्ति से ही नियंत्रणीय है, aCSF में ऑक्सीजन के स्तर में अंतर आसानी से दिन के लिए दिन के प्रयोगों में प्राप्त कर रहे हैं । इस प्रकार, एक ऑक्सीजन मीटर के लिए समस्या निवारण की गति की सिफारिश की है और शर्तों को समायोजित करने के लिए (जैसे, तापमान, carbogen प्रवाह दर, carbogenation उपकरण, और aCSF रीसाइक्लिंग दर) aCSF जलाशय में स्थिर पर कम से 28 मिलीग्राम/L ऑक्सीजन तक पहुंचने के लिए स्तर. इसके अलावा, दवा आवेदन के लिए aCSF कंटेनर के आकार को बदलने के लिए आम अभ्यास अपने carbogen के स्तर में अंतर के कारण क्षेत्र क्षमता पर प्रभाव पैदा कर सकता है ।

एक छोटे रीसाइक्लिंग बफर मात्रा के बहिर्वाह-carbogenation का उपयोग synaptic प्लास्टिक के प्रयोगों के परिणाम में सुधार हुआ । तरल में ऑक्सीजन के सुधार भंग तरल और carbogen के संपर्क क्षेत्र के बीच बड़ा अनुपात पर आधारित है । इसके अलावा, बहिर्वाह-carbogenation aCSF जलाशय में carbogen घट aCSF की आपूर्ति कम हो जाती है । carbogenation की स्थिरता और एक विशेष रूप से डिजाइन venturi वाणिज्यिक उत्पादों के सिद्धांत के आधार पर29द्वारा सुधार किया जा सकता है ।

यहां तक कि सबसे अच्छा टुकड़ा तैयारी और सेटअप शर्तों के साथ, यह अक्सर अपरिहार्य है कि क्षेत्र क्षमता जब अछूता धातु उत्तेजना इलेक्ट्रोड इस्तेमाल किया जाता है प्रेरित नहीं किया जा सकता है । अक्सर कारण यह है कि इंसुलेशन झुकने या सफाई के कारण क्षतिग्रस्त हो गया है । जैसा कि हम तरीकों में संकेत दिया है, एक सरल दृष्टिकोण को कम डीसी-वोल्टेज पर बुलबुला गठन की जांच है । इसके अलावा, इस कदम टिप को साफ करने के लिए और उत्तेजना इलेक्ट्रोड के प्रतिबाधा को कम करने में मदद करता है. उत्तेजना के लिए ग्लास पिपेट का उपयोग आम है और फाइबर उत्तेजना का एक संकरा क्षेत्र प्रदान करने का लाभ है । अक्सर, यह संभव नहीं है एक अधिक से अधिक fEPSP ढलान खोजने के लिए जब कांच पिपेट उत्तेजना प्रयोग किया जाता है । fEPSP-क्षय चरण में जनसंख्या स्पाइक के सकारात्मक स्रोत घटक की उपस्थिति तो उत्तेजना शक्ति को समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है23.

गतिविधि पर निर्भर synaptic प्लास्टिक की प्रेरण और लागू प्रेरण प्रोटोकॉल पर निर्भर अलग संकेतन रास्ते की भागीदारी के बारे में प्रकाशन मई10उपलब्ध हैं । हालांकि, देखने के methodological बिंदु से, उच्च आवृत्ति उत्तेजना अलग कलाकृतियों कि synaptic प्लास्टिक की सफल प्रेरण को रोकने सकता है कारण हो सकता है । एक दोहराया १०० हर्ट्ज/उत्तेजना इलेक्ट्रोड या विद्युत प्रतिक्रियाओं के ध्रुवीकरण का कारण सकता है30, afferents को नुकसान के कारण synaptic संचरण के अवसाद में जिसके परिणामस्वरूप (एक उदाहरण के लिए चित्र 8 देखें). विद्युत प्रक्रियाओं को कम करने के लिए, biphasic उत्तेजना दालों का उपयोग और एक उत्तेजना शक्ति नहीं से अधिक 2 वी आधार रिकॉर्डिंग के लिए सिफारिश कर रहे हैं.

संक्षेप में, बहिर्वाह-carbogenation प्रयोगों में ऑक्सीजन के स्तर को स्थिर करने में मदद करता है कि एक छोटे बफर जलाशय के पुनर्चक्रण पर निर्भर, दवा प्रयोगों की लागत कुशलता को बढ़ाने.

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि अनुसंधान किसी भी व्यावसायिक या वित्तीय संबंधों कि ब्याज की एक संभावित संघर्ष के रूप में लगाया जा सकता है के अभाव में आयोजित किया गया ।

Acknowledgments

W.W. आयोजित, विश्लेषण, और प्रयोगों डिजाइन और पांडुलिपि लिखा था । D.X. और C.P. चित्रा तैयारी में सहायता प्रदान की है और प्रयोगों का आयोजन किया । यह काम NSFC (३१३२०१०३९०६) और १११ परियोजना (B16013) द्वारा समर्थित किया गया था T.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents required
NaCl Sinopharm Chemical Reagent, China 10019318
KCl Sinopharm Chemical Reagent, China 10016318
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent, China 10017618
MgCl2·6H2O Sinopharm Chemical Reagent, China 10012818
CaCl2 Sinopharm Chemical Reagent, China 10005861
NaHCO3 Sinopharm Chemical Reagent, China 10018960
Glucose Sinopharm Chemical Reagent, China 10010518
NaH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent, China 20040718
HEPES Sigma H3375
Sodium pyruvate Sigma A4043
MgSO4 Sinopharm Chemical Reagent, China 20025118
NaOH Sinopharm Chemical Reagent, China 10019718
Tools and materials for dissection
Decapitators Harvard apparatus 55-0012 for rat decapitation
Bandage Scissors SCHREIBER 12-4227 for mouse decapitation
double-edge blade Flying Eagle, China 74-C
IRIS Scissors RWD, China S12003-09
Bone Rongeurs RWD, China S22002-14
Spoon Hammacher  HSN 152-13
dental cement spatula Hammacher  HSN 016-15
dental double end excavator Blacksmith Surgical, USA BS-415-017
Vibrating Microtome Leica, Germany VT1200S
surgical blade  RWD, China S31023-02
surgical holder RWD, China S32007-14
Electrophysiology equipment and materials
Vertical Pipette Puller Narishige, Japan PC-10
Vibration isolation table Meirits, Japan ADZ-A0806
submerged type recording chamber Warner Instruments RC-26GLP
4 Axis Micromanipulator Sutter, USA MP-285, MP-225
Platinum Wire World Precision Instruments PTP406
Amplifier Molecular Devices, USA Multiclamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices, USA Digidata 1440A
Anaysis software Molecular Devices, USA Clampex 10.2
Fluorescence Microscope Nikon, Japan FN1
LED light source Lumen Dynamics Group, Canada X-cite 120LED
micropipettes Harvard apparatus GC150TF extracelluar recording
borosilicate micropipettes Sutter, USA BF150-86 patch clamp
tungsten electrode A-M Systems, USA 575500
peristaltic pump Longer, China BT00-300T
tubes for peristaltic pump ISMATEC, Wertheim, Germany SC0309 1x inflow, ID: 1.02 mm
tubes for peristaltic pump ISMATEC, Wertheim, Germany SC0319 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm
CCD camera PCO, Germany pco.edge sCMOS
lens cleaning paper Kodak
50 mL conical centrifuge tube Thermo scientific 339652
Prechamber Warner Instruments BSC-PC
Inline heater Warner Instruments SF-28
Temperature Controller Warner Instruments TC-324B

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १३१ हिप्पोकैंपस eEF2 कळेनासे प्रोटीन संश्लेषण लर्निंग मेमोरी synaptic प्लास्टिक ऑक्सीजन
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Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System. J. Vis. Exp. (131), e55936, doi:10.3791/55936 (2018).

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