Este protocolo foi desenvolvido para identificar quantitativamente os componentes do microambiente tumoral em resecções do paciente com glioblastoma usando imuno-histoquímica cromogênica e ImageJ.
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Artigo de método
Imuno-histoquímica quantitativa do microambiente celular em resecações do glioblastoma do paciente
Neste artigo
Resumo
Resumo
Com o crescente interesse no microambismo do tumor, buscamos desenvolver um método para determinar especificamente os componentes do microambiente dentro de amostras de pacientes com glioblastoma, o câncer cerebral mais mortal e invasivo. Não só os métodos quantitativos são benéficos para descrever com precisão os tecidos doentes, mas também podem contribuir para um prognóstico mais preciso, diagnóstico e desenvolvimento de sistemas e substituições de engenharia de tecidos. No glioblastoma, as células gliais, como a microglia e os astrócitos, foram correlacionadas de forma independente com um mau prognóstico com base na classificação de patologistas. No entanto, o estado dessas células e outros componentes das células gliais não foram bem descritos de forma quantitativa. Isso pode ser difícil devido aos grandes processos que marcam essas células gliais. Além disso, a maioria das análises histológicas se concentra na amostra de tecido geral ou apenas na maior parte do tumor, ao contrário de delinear as quantificações com base em regiõesSobre o tecido altamente heterogêneo. Aqui, descrevemos um método para identificar e analisar quantitativamente as populações de células gliais dentro do tumor a granel e regiões adjacentes de ressecções tumorais de pacientes com glioblastoma. Utilizamos imuno-histoquímica cromogênica para identificar as populações de células gliais em resecções tumorais do paciente e ImageJ para analisar a cobertura percentual de coloração para cada população glial. Com essas técnicas, podemos descrever melhor as células gliais em todas as regiões do microambiente do tumor de glioma.
Introdução
O glioblastoma (GBM), o câncer cerebral mais comum e maligno, é caracterizado por invasão altamente difusa do tumor primário para o parênquima 1 , 2 do cérebro circundante. Essa invasão difusa torna o tumor particularmente difícil de ressecar completamente, e as células cancerígenas invasoras que permanecem pós-terapia são a razão mais comum para recorrência inevitável 2 , 3 , 4 . Anteriormente, achamos inibir a invasão de células de glioma difuso para ser terapeuticamente benéfico 5 , porém p....
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Protocolo
Este protocolo identifica componentes celulares em amostras embutidas em parafina fixada em formalina (FFPE), como é típico para amostras de pacientes clínicas bancárias. A incorporação de parafina permite a melhor manutenção da morfologia celular e tecidual, além de ter uma melhor longevidade das seções. As amostras utilizadas para esta análise foram acessadas através da Universidade de Virginia Biorepository e Tissue Research Facility. As amostras de pacientes foram selecionadas por um neuropatologista com base em um diagnóstico definitivo de glioblastoma (astrocitoma, grau IV da OMS) que completaram ressecções tumorais na Universidade da Virgínia entre 2010 e 2013....
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Resultados
Para esta análise, duas regiões de interesses dentro de nossas ressecções tumorais - o tumor primário e as regiões adjacentes, principalmente composta de tecido saudável com células invadidas de câncer invasivo ( Figura 1A , 1B ) - foram identificadas por neuropatologistas colaboradores em hematóxilina e paciente com corante de eosina Amostras. Dentro de cada amostra de paciente, identificou-se a coloração positiva para astrocitos (
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Discussão
Nosso método aqui proposto é uma abordagem quantitativa para analisar amostras histológicas coradas usando imunohistoquímica cromogênica tradicional. A metodologia atual para este tipo de análise inclui protocolos de coloração semelhantes, seguidos pela classificação por patologistas independentes. Este método tem sido confiável, no entanto, para uma série de aplicações, é necessária uma compreensão mais precisa da maquiagem celular, como melhor compreensão da heterogeneidade associada aos tumores e recapitulação precis.......
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Agradecimentos
Os autores agradecem os Drs. Fahad Bafakih e Jim Mandell para aquisição e identificação de amostras de pacientes, Garrett F. Beeghly para assistência com imuno-histoquímica e o Centro de Pesquisa de Biorepositórios e Tecidos, Centro de Pesquisa Cardiovascular Center Histology Core e o Centro de Análise Biomolecular da Universidade da Virgínia para assistência com Aquisição de amostras, imuno-histoquímica e imagens.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Xileno | Fisher Químico | X3P | |
| Etanol | |||
| desmascaramento de antígeno de pH alto | Vector Labs | H-3301 | |
| TBS | |||
| Triton-X | Amresco | 9002-93-1 | |
| Soro | |||
| de cavalo Anti-ALDH1L1 | abcam | ab56777 | |
| Anti-IBA1 | abcam | ab5076 | |
| Proteína Específica Anti-Oligodendrócito1 | abcam | ab53041 | |
| ImmPRESS anti-cabra | Vector Labs | MP-7405 | |
| ImmPRESS Universal (anti-rato / coelho) | Vector Labs | MP-7500 | |
| Peróxido de hidrogênio | Sigma Aldrich | 216763 | |
| ImmPACT DAB substrato | Vector Labs | SK-4105 | |
| Contracoloração de hematoxilina | ThermoScientific | 72404 | |
| Meios de montagem | de Amresco | H157-475 | |
| Aperio Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Imagem Scanscope | Leica Biosystems | ||
| Super HT PAP Pen | Produtos de | pesquisa 195506 |
Referências
- Claes, A., Idema, A. J., Wesseling, P. Diffuse glioma growth: a guerilla war. Acta Neuropathol. 114 (5), 443-458 (2007).
- Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (12), 6242-6244 (2000).
- Wild-Bode, C., Weller, M., Rimner, A., D....
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Reimpressões e permissões
