Summary
Yüksek yağlı diyet beslenme obezite Drosophila, anlayış temel moleküler mekanizmalar içinde lipotoxicity karıştığı için bir model olarak ikna etmek için iletişim kuralı bu. Ayrıca yüksek işlem hacmi triacylglyceride tahlil Drosophila ve potansiyel olarak diğer (böcek) modelleri çeşitli diyet, çevresel, genetik veya fizyolojik koşullar altında yağ birikimi ölçmek için sağlar.
Abstract
Kalp hastalığı insan ölüm dünya çapında bir numaralı nedenidir. Çok sayıda çalışmalar insanlarda güçlü bağlantıları arasında obezite ve kalp arıza göstermiştir ama daha fazla araç ve araştırma çabalarını daha iyi mekanizmaları dahil aydınlatmak için ihtiyaç vardır. İçin bir yüzyılı aşkın süredir, Drosophila genetik olarak son derece uysal modelinin anahtar genlerin ve türler arasında son derece korunmuş kanıtladı moleküler yollar keşfi vesile olmuştur. Birçok biyolojik süreçlerin ve hastalık mekanizmaları işlevsel olarak geliştirme (örneğin, vücut planı, kalp), kanser ve nörodejeneratif hastalık gibi anında korunmuş. Son zamanlarda, obezite ve model organizmalar, kalp hastalığı gibi ikincil patolojiler çalışma anahtar düzenleyiciler metabolik Sendromu insanlarda dahil tanımlama son derece kritik bir rol oynamıştır.
Burada, neden obezite, Yani, aşırı yağ birikimi ve yağ içeriği Etiketler birikimi şeklinde izlemek için verimli bir iletişim kuralı geliştirmek için etkili bir araç olarak bu model organizma kullanmayı öneriyorum. Ek olarak son derece korunmuş, ancak daha az karmaşık genom, anında da hızlı deneme, maliyet-etkililik ile kombine için kısa bir ömrü vardır. Bu inceleme obezite ve yağ içeriği yüksek tekrarlanabilir olmak amacı ile ilişkili artış ölçmek için bir yüksek üretilen iş triacylglyceride (TAG) tahlil ikna etmek için Drosophila yüksek yağlı diyet (HFD) beslenme için detaylı bir protokol sağlar ve büyük ölçekli genetik veya kimyasal tarama için etkili. Bu protokoller verimli düzenleyici mekanizmaları obezite ilgili araştırmak, aynı zamanda ilaç bulma araştırma geliştirme ilaç adaylarının etkisinin hızlı test etmek için standart bir platform sağlamak için yeni fırsatlar sunmak veya Obezite, diyabet ve ilgili metabolik hastalıkları önleme.
Introduction
Biz bir zaman obezite ve onun ilişkili ekonomik güçlükler, nerede bir dünya çapında sorun1vardır. İki her üç Amerikalı dışında fazla kilolu ya da obez ilgili kalp patolojiler, ölüm2yetişkin nüfus içinde birincil nedeni ile vardır. Yeni verimli yöntemleri yeterince metabolik sendrom model organizmalar kullanarak yönetmelikte karıştığı genetik ve moleküler bileşenleri araştırmaya ihtiyaç vardır. 3,4,5,6fareler ve insanlar da dahil olmak üzere memelilerin ile en temel biyolojik süreçlerin hisse çünkü bu nedenle, biz meyve sineği Drosophila modeli seçin. Drosophila' ın genom son derece korunmuş evrim sırasında ama genel olarak çok daha küçük daha az gen ikilenmesi ve metabolik karmaşıklığı, birçok insan hastalıkları4 ' te karıştığı temel mekanizmaları anlamak için idealdir , 7 , 8. Ayrıca, karakteristik süreçleri yağ dokusu, gut tarafından yürütülen ve pankreas sinek içinde gösterilir ve insanlar9' a, benzer olan düzenleyici işlevleri glikoz ve lipid metabolizması, örneğin, aracılık 10,11. Ayrıca, temel moleküler yolları obezite, insülin direnci ve insanlarda diyabet kontrol dahil işlevsel olarak Drosophila melanogaster12,13,14 ' te konservasyonu , 15 , 16. daha yüksek organizmalar gibi Drosophila geliştirme sırasında memeli kalp3,17' e benzer işlemler tarafından kurulmuş bir kalbi vardır. Böylece, besleme protokolü ve yüksek işlem hacmi etiket tahlil, Drosophila, genetik araç kutusunu kullanarak verimli tarama amaçlı adapte güvenilir bir HFD gelişimi sağlayan çalışma ve temel genetik temeli anlamak için önemli bir araç temel karmaşık metabolik hastalıklar.
HFD yemek ile Hindistan cevizi yağı, çoğunlukla doymuş yağ asitlerinin metabolik sendrom18ile ilişkili olduğu bilinen oluşan takıma bir standart laboratuvar sinek yemek yapılır. Obezite gibi kemirgenler, memeli modellerinde inducing, ay19,20alırken, bizim en iyi duruma getirilmiş HFD Protokolü besleme Drosophila içinde etkili ve tekrarlanarak birkaç içinde organizma yağ içeriği artar gün12,14. Bu iletişim kuralı, bir yüksek işlem hacmi etiket tahlil ile birlikte genetik faktörler, çevresel etkilere ve yağ metabolizmasının yeni modülatörler keşfetmek için ilaç adaylarının etkileri için verimli kitle tarama sağlar. Sonuç olarak, bu protokoller olasılığı anlamak ve/veya insan patolojiler obezite ile ilişkili ve obezite ile mücadele ilgili.
Besleme protokolü çok yönlü ve tek doymuş veya doymamış yağ asidi metabolik ve fonksiyonel etkilerini incelemek için uygulanabilir. Bu yüksek işlem hacmi etiket tahlil kullanımını D. melanogasteriçin sınırlı değildir, ancak küçük model organizmalar kütikül veya zor ekstraselüler matrisler (örneğin, diğer Drosophila türler, C. elegans ile çeşitli adapte ve diğer omurgasız canlılar gelişmekte olan) farklı çevresel, genetik veya fizyolojik koşullar altında yağ içeriği geliştirme, yetişkinlik veya metabolik hastalık aşaması herhangi bir aşamasında ölçmek için. ETİKET tahlil Renkölçer ölçüm etiketleri içine serbest yağ asitleri, gliserol, gliserol 3-fosfat ve sonunda H2O2 4-aminoantipirin (4-AAP) ve 3,5 - ile tepki veren aşağılamak enzimatik reaksiyonlar bir dizi dayanmaktadır dichloro-2-hydroxybenzene Sülfonat (96-şey Spektrofotometre ölçülür bir kırmızı renkli ürün üretmek için 3,5 DHBS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. protokol besleme HFD
Tablo 1. Sinek yemek tarifi.
Bu tablo farklı malzemeler bizim kontrolümüz yemek hazırlamak için kullanılan özetler. Bir kez, gıda 10 mL tüpler dökülür, soğutmalı ve uzun süreli depolama için 4 ° C'de depolanan.
- HFD hazırlık
- 1 kg yüksek yağ yemek yapmak için önceden yapılmış normal sinek gıda 700 g tartmak (bkz. Tablo 1) ve 300 gr Hindistan cevizi yağı içine bir analitik denge kullanarak iki ayrı kapsayıcı.
- Mikrodalga, tek tek her kapta Isı içeriği tamamen eriyecek kadar. Hindistan cevizi yağı sinek gıda konteyner içine dökün. Kadar petrol de sinek gıda içine karışık bir çırpma teli kullanarak karıştırın.
Not: Gıda veya yağ yok parçalarını görünür olmalıdır. Sinek gıda mikrodalga eriyor, gıda mix ve üzerinde kaynar önlemek için 1 dk aralıklarla durdurur. - Yüksek yağ yemek yeniden tartın. Toplam ağırlığı 1 kg az (700 g gıda + 300 gr Hindistan cevizi yağı), su (yaklaşık 10 mL) telafi etmek için Isıtma sırasında buharlaşma ve ağırlık için 1 kg. geri getirmek için ekleyin
- Pour yaklaşık 10 mL iyi karışık şişe (şişe hacmi yaklaşık % 25) başına yüksek yağ gıda. Ardından, sinekler önlemek için tülbent ile kapak ' kirlenme. Oda sıcaklığında 1 h için serin sonra 4 ° c için depolama tüpleri için 4 hafta transfer.
Not: Normal gıda (NF) bir denetim gıda olarak kullanılır. Aynı zamanda şişe başına 10 mL (yaklaşık % 25 flakon biriminin) NF dökün. HFD yemek için NF gıda % 30'u Hindistan cevizi yağı ile değiştirin. Denetim ve deneysel koşullar için sinekler NF ve HFD (gıda şişe başına 10 mL) aynı miktarda verildi.
Resim 1 . Drosophila içinde besleme HFD.
Düzeni farklı beslenme adımları sinekler için bir denetim gıda (Hindistan cevizi yağı-NF ilavesi olmadan normal bir diyet) veya HFD (Hindistan cevizi yağı ilavesi ile) gösterir. Tüm süreç yetişkin sinekler ilk koleksiyonu sonra 10 gün sürer. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
- HFD D. melanogaster besleme
Not: Denetim gıda ve herhangi bir sinek çizgi ile uyumlu olan yordamlar besleme HFD bu iletişim kuralını içerir. Denetim ve deneysel sinekler aynı miktarda gıda (NF veya HFD) içeren şişeleri konur.- Sinekler anestezi için Kullanım CO 2.
Not: acemi için okuma referans lütfen 21 yetiştirme ve D. melanogaster işleme genel bir bakış için. - Toplamak 0-5 gün eski sinekler şişeleri ve transfer (çevirme tarafından) sinekler NF (oda sıcaklığında daha önce ısındı) içeren yeni tüpleri içine. Sinekler yaş 21 5 ek gün izin ° C.
- HFD ve NF 4'ten içeren şişeleri 5 günün sonunda çıkarmak ° C.
Soğuk sıcaklıklarda yaşam sinekler, stres gibi Not: kullanmadan önce ısınmak için oda sıcaklığında 30 dakika oturmak şişeleri izin. - Mendil kullanarak, temiz ve aşırı sıvı şişeleri taraftan kaldırmak.
- Hakkında filtre kağıdı, küçük bir parça eklemek 1 cm x 3 cm, herhangi bir fazla sıvı emmek için yüksek yağ gıda içine.
Not: Bu sinekler HFD gıda yapışmasını önlemek için kritik bir adımdır. - Sonra yüksek yağ yemek üzerine sinekler (saygısız) aktarın. Şişeleri (kalkmadığım) yatay olarak onların tarafında, 21-22 ° c 5 gün yattı.
Not: Bu kısmen yüksek yağ yemek, gıda ve ölmek için sopa sinek neden erime olabilir gibi yüksek sıcaklıklarda kaçının. - Sonra 5 günü, devir (saygısız) NF ve HFD uçar bağırsaklarını 30 dk için boş için izin vermek için gıda olmadan yeni tüpleri içine. Ardından, Sineklerin ağırlığında için devam.
Not: Bu HFD Protokolü besleme önemli adımlardan biri iyi karışık bir HFD, herhangi bir sinek gıda veya yoğun yağ parçalarını ücretsiz hazırlamaktır. Homojen karıştırma ve 45-30 ° c HFD soğutma tavsiye edilir, tüpleri dökme ve 4 ° C. uygun yaşta Gıda Depolama önce denetim ve deneysel sinekler eşleşen kontrollü beslenme ve çevre koşulları önceden yanı sıra önemlidir HFD besleme için. Besleme aşamasında kontrol ve deneysel sinekler NF ve HFD aynı miktarda verilmelidir. Hiç sinek kalabalık tüpleri veya şişe (transgenerational etkilerinden korunmak için) toplamak. Her zaman en fazla 25 sinekler NF ve diyet kısıtlaması veya diğer crowding etkileri önlemek için besleme HFD sırasında şişe koydu. HFD % 30 Hindistan cevizi yağı oluşur, böylece 22 ° C üzerindeki sıcaklıklarda kısmen yağlı yiyecek ve die sopa sinek neden HFD, eriyebilir. HFD üzerinde sinekler koymadan önce herhangi bir kalıntı petrol kaldırmak ve herhangi bir aşırı sıvı gıda emmek için bir filtre kağıdı eklemek için şişeleri temizle. HFD üzerinde sinekler kuluçka sırasında tüpleri üzerinde sinekler için yağsız yatay bir yüzey sağlamak için yan yana koyulur.
- Sinekler anestezi için Kullanım CO 2.
- Sineklerin ağırlığında
- her genotip ve test edilmesi için cinsiyet için önceden etiketli, boş 1.7 mL tüpler ağırlıkları kaydetmek için Ultra-duyarlı bir ölçek kullanın.
- Anestezi ve aynı genotip, cinsiyet, 36 sinekler toplamak sinek anestezi veya CO 2, kullanma ve bir fırça ile durum içine bir besleme önceden 1.7 mL tüp tartılır.
- Aynı Ultra-duyarlı ölçek sinekli içeren tüp tartmak.
- Belirlemek bu formül takip ortalama sinek ağırlığı:
Not: Bu protokol sinekli 36 sayısıdır. - Flash 2 dk. toplamak için sıvı azot içine dalan tarafından sinekler içeren 1.7 mL tüpler donma ve tüpler kutulara koyun. Sonra kutuları etiketi tahlil ile kullanmak kadar depolama için-80 ° C (tercih sıcaklık) transfer.
Dikkat: Son derece düşük bir sıcaklıkta sıvı nitrojen var. Lütfen uygun kişisel koruyucu giysiler kullanın.
2. ETİKET tahlil
- Etiket standart konsantrasyonları hazırlanması
- 500 mL PBT hazırlamak (PBS 1 X, % 0.05 Triton).
- Kullanma 0.5 mL tüpler ve etiket çözüm (Tablo malzemeler), hazırlamak boş (sadece PBT) 100 µL ve altı standart etiket konsantrasyonları (2 µg/µL 1 µg/µL 0,5 µg/µL; 0,25 µg/µL; 100 µL 0,125 µg/µL; 0.0625 µg/µL) ile PBT.
- Tüpler Buza koyun ve sinekler taşlama ile devam edin.
- Sinekler taşlama
- -80 ° c (Adım 1.3) dondurulmuş sinekler çıkar. Buz üzerinde sinekler içeren tüpler transfer
- İlk olarak, yer 2 mm metal topları bir 96-iyi top dispanser taşlama, ek toplar kaldırmak için küçük bir fırça kullanın.
- 96-şey taşlama yeri plaka topu dağıtıcı ve flip metal topları doğrudan taşlama plaka aktarmak için üstüne baş aşağı. Orada-meli var olmak iyi başına bir top.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak PBT 600 µL 96-şey taşlama plaka her satır eklemek.
- 3 şey uçar Forseps ile ekleyin. Her satır/iyi 96-şey taşlama plaka sinekli genotip, cinsiyet ve gıda durumunu.
- Sıkıca kapaklar 96-şey taşlama plaka üzerine yerleştirin. Teyp hiçbir sızıntı olması için üstte yer yerleştirilebilir.
- Düzgün 96-şey taşlama tabaklar taşlama makinesi yerleştirin. En yüksek hız ve basın için set machine " çalıştırmak " 3 dakika süreyle sinekler öğütmek için
- Sonra 3 dk, taşlama durdurmak ve plaka Santrifüjü ile devam edin: centrifu4000 x g, 4 ° c de 15 dakika Ge Santrifüjü sonra dikkatle süpernatant ile Pelet karıştırma önlemek için bileme plaka yönetmek.
- Örnek yükleme ve etiket içerik kararlılık
- yeni bir 96-şey Spektrofotometre tabak al. Bir çok kanallı pipet ile plaka her satır etiket reaktif 200 µL yüklenmesi.
- PBT yükü 20 µL bir boşluk oluşturmak için ilk satırın ilk kuyunun içine. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Kabarcıklar oluşturan kaçının. İlk satır ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix
- yükü 20 µL kalan içine her standart seyreltme (Kimden adım 2.1.2), kuyu. Kabarcıklar oluşturan kaçının.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak transfer süpernatant ile 20 µL taşlama plaka her satırdan 96-şey Spektrofotometre plaka karşılık gelen satırda. Yukarı ve aşağı karıştırın için pipet. Kabarcıklar oluşturan kaçının.
- Sonra 96-şey plaka üzerinde gaz geçirgen bir folyo yerleştirin.
- Kuluçkaya plaka 10 dk. 37 ° C'de
Not: wells kabarcıklar eğer vasıl tüm kabarcıklar kaldırmak için 2.000 x g 2 dk plaka santrifüj kapasitesi. Kabarcıklar varlığı ile Absorbans okuma karışmamasıdır. - Okunur her şey 550, plaka Absorbans nm bir uyumlu Mikroplaka okuyucu kullanarak. Daha sonra standart eğri takip edip bilinmeyen örnekleri [µg/µL] konsantrasyonu belirlemek.
- Etiketinin içeriği başına ortalama sinek ağırlık miktarını belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın:
Not: Bu protokol için 3 sinekler PBT 600 µL içinde kıyılmış; ortalama sinek başı 200 µL birimdir.
- Bradford tahlil ve normalleştirme etiket içerik protein içeriği ile
- yedi hazırlamak sığır serum albumin (BSA) standart dilutions 100 µL (75 µg/mL, 100 µg/mL, 150 µg/mL; 200 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1000 µg/mL) ile PBT.
- Yeni bir 96-şey plaka almak ve 1 X Bradford reaktif 200 µL plaka her satır yük.
- İlk satırının ilk kuyuda bir boşluk oluşturmak için PBT 10 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından karıştırın. Kabarcıklar oluşturan kaçının. İlk satır ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından mix
- kalan içine her standart seyreltme eklemek 10 µL kuyu. Kabarcıklar oluşturan kaçının.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak transfer süpernatant sinek 10 µL taşlama plaka her satırdan karşılık gelen satırda 96-şey plaka içine. Yukarı ve aşağı karıştırın için pipet. Kabarcıklar oluşturan kaçının.
- 96-şey plaka üzerinde gaz geçirgen bir folyo yerleştirin.
- Plaka, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Wells kabarcıklar varsa, bunları kaldırmak için 2.000 x g de 2 dk plaka santrifüj kapasitesi.
Not: Kabarcıklar varlığı ile Absorbans okuma karışmamasıdır. - Kullanım Spektrofotometre okuma boş Absorbans, standartları ve bilinmeyen örnekleri, 595 nm. Her satırda örnekleri [µg/µL] konsantrasyonları belirlemek için standart eğri kullanın.
- Normalize etiketi aşağıdaki formülü kullanarak protein seviyesi ile içerik:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
D. melanogasteriçinde diğer türler ile olduğu gibi işte cinsel dimorfizm kadın ve erkek22arasında. İyi kadınlar daha büyük, onların abdomens daha fazla yağ daha erkek22ile bilinmektedir. Bizim iletişim kuralı etkinliğini test etmek için etiket deneyleri Etiketinin içeriği standart laboratuvar wildtype (w1118) kadınlar ve erkekler arasındaki farklılıkları uçar belirlemek için gerçekleştirilen. Kadın erkek meslektaşlarına (Şekil 2A, B) daha fazla tüm vücut yağ olması verileri göstermek. Verileri ayrıca tahlil etiketi miktar zaman içinde hiçbir varyasyon ile tutarlı olduğunu gösterdi (50 dakikaya kadar kuluçka sonra) ve hiçbir varyasyon biyolojik örnek boyutu (3 veya 5 sinekler) bağlı olarak.
HFD tüketimi obezite insan ve fare19,20,23neden olduğu gösterilmiştir. Bizim besleme protokolü etkinliğini test etmek için etiket deneyleri HFD ve dişi sinekler beslenen denetim ile gerçekleştirilen. Bulduk Drosophila HFD tüketimi giderek (şekil 3A-C) zamanla birikir artan yağ içeriği neden olur. Daha sadece 18 h (biz bu sinekler yağ içeriği önemli bir artış ikna edebildikşekil 3C), besleme HFD sonra bu bulmak önemli. Bu bulgular bu genetik model sistem hızlandırılmış araştırma içine HFD kaynaklı obezite roman düzenleyiciler bulmak için ideal bir araç olduğunu göstermektedir.
Resim 2 . ETİKET deneyleri erkek ve dişi sinekler de.
2 - haftalık sinekler normal diyet toplanmış, seks (kadın ve erkek) tarafından gruplandırılmış, tartılır ve (iyi başına 3 veya 5 sinekler) kadar etiketi çözümleme için zemin. Bu makalede açıklanan yordamları izleyerek etiketi deneyleri gerçekleştirilmiştir. Her örneği 550'Absorbans nm okumak farklı noktalarda zaman-(0 dk, 5 dk, 20 dk ve 50 dk) nihai TAG miktar dalgalanmalar belirlemek için zaman, şişman içerik varyasyon üzerinde farklı nüfus boyutlarda (3 ve 5 sinekler) w1118 uçar ve etiket içeriklerini erkek ve kadın arasındaki farklar. Sonuçlar gösterdi kadın erkek meslektaşlarına (A-B) daha fazla yağ birikir, etiket ölçüleri 50 dakikaya kadar tepki kuluçka 37 ° c (A-B) sonra dalgalanma değil. Ayrıca, ortalama etiket düzeyleri arasında 3 veya 5 sinekler (A-B) kullanarak etiket deneyleri değişmeden kalır. Verileri ortalama ± SEM istatistik sunulmaktadır: anlamlı bir fark. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Yağ birikimi üzerine etkileri HFD.
A-b 2 - hafta yaşlı kadın sinekler normal veya HFD 5 gündür kaldırdı toplanmıştır ve yağ düzeylerini belirlemek için etiket deneyleri gerçekleştirilmiştir. Etiketinin içeriği ağırlık(a)veya protein düzeyleri (B) ile normalleştirilmiş. Veri HFD tüketimi artan yağ içeriği için normalleştirme her iki yöntem ile yol gösterdi. C: 2 - hafta yaşlı kadın sinekler normal/denetim gıda (NF) ve 18 h, 1 gün ya da 2 gün HFD Etiketinin içeriği için denetlesinler. Sonuçlar 2 gün HFD etkilenme 18 h dan etiket düzeylerinin önemli ve ilerici bir artış gösterir. Verileri ortalama ± SEM istatistik sunulmaktadır: Öğrenci t-testi. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Obezite indüksiyon farelerde ay19,20alabilir. Sinekli, aşırı yağ birikimi bir kaç gün veya daha az, (bkz: Şekil 2) sadece 18 s sonra yağ birikimi artar neden indüksiyon Protokolü besleme bu HFD sağlar. Açıklanan protokolü ile besleme HFD glikoz içerik 12 artırır ve Bmm lipaz ve PGC-1 ifade24azaltır. Bu yağ ve şekeri içeriği25,26 ve artan Bmm ifade24hızlı bir düşüş neden olan yetişkin Drosophila Orucun aksine. Ayrıca, Bmm veya PGC-1 düzeyleri yükselen obezite HFD kaynaklı14,24karşı korur. %30 HFD % 3, %7 veya % 15 yağ sinekli besleme bu protokol için kullanılmış olan bir doz bağımlı indüklenen obezite diyet yaparken HFD (şekil 3) besleme süresi artan olduğu gibi12, moda. Ayrıca Hindistan cevizi yağı, Yani, % 14 laurik asit veya % 5 miristik asit ana bileşenlerinin tek yağ asitleri besleme, nedenleri önemli ölçüde yağ birikimi12yüksek bulduk.
Bu sinekler bulunan bir HFD rejimi ile hızlandırılmış metabolik yanıt memeliler28gözlemlediği gibi sınırlı ömrü27 ile ilişkilidir ama > %80 "Sineklerin Tanrısı" hayatta HFD2720 gün geçmiş. Yağ birikimi hızlı indüksiyon lipid kontrol korunmuş hücresel ve moleküler işlemler tarafından aracılık ve glukoz metabolizma şeker hastası veya lipotoxic kardiyomiyopati10gibi birçok obezite ile ilgili çalışmalar için avantajlıdır, 12,13,14,15,16. Anahtar bulgular sonuçları metabolik dengesizlikler ve ilgili kardiyak işlev bozuklukları olarak büyük olasılıkla karşılaştırmalı translasyonel çalışmalar insanlarda sağlayacaktır.
İletişim kuralı besleme HFD kullanım için benzer diyetler D. melanogasterile paylaşan diğer Drosophila türler ve böcekler modelleri ile uyumludur. İletişim kuralları besleme bu HFD organizma C. elegans ya da farklı 'normal' Gıda medya gerektiren diğer böcekler gibi uygun bir şekilde uyum sağlamış. % 30 HFD için uygun değildir yüksek sıcaklık gerektiren deneme kullanın; Ancak, Hindistan cevizi yağı veya tek yağ asitleri düşük konsantrasyonlarda yeterli alternatifler12olacaktır.
Bu etiket Protokolü PBS üzerinde dayanır, kolay kullanım ve deneme olmadan duman hood, daha önce aksine sağlar bir toksik olmayan arabellek organik çözücüler (metanol/kloroform veya Dietil eter) lipid çıkarma ve miktar15 içinde kullanılır. , 29 , 30. bu arabelleği bir diğer avantajı bu protein içerik şişman belirlenmesi küçük doku örneklerinde organ çalışmaya kolayca ulaşılabilir ve sunan yeni fırsatlar yapmak aynı ilk homogenate üzerinde temel etiket düzeylere normalleştirmek olduğunu çapraz-organizma metabolik homeostazı hadis. Ayrıca, paralel glikoz ve glikojen deneyleri, lipid ve glukoz metabolizması aynı biyolojik örneklerinden değişiklikleri çalışma izin gerçekleştirmek için aynı ilk sinek homogenate zımpara sonra elde edilen kullanılabilir. Bu etiket iletişim kuralı daha az zahmetli veya daha önceki iletişim kuralları15,29,30zaman alıcı ve oldukça yüksek hızlı yakın 100 örnek için test sağlayan bir 96-şey biçimi kullanılarak üretilen iş, bir saat içinde. Bu iletişim kuralı da yağ içeriği yüksek şeker diyeti13,31, diyet kısıtlaması ve açlık, dahil olmak üzere diğer diyet koşullar altında yanı sıra yaş ilişkili değişiklikleri anlamak yaşlanma Etütler ölçmek için kullanılabilir yağ metabolizmasında.
Obezite, metabolik sendrom ve ilgili patolojiler bir tüm zamanların en yüksek insan sağlığı1,2yıkıcı sonuçlara ile altındadır. Kombine HFD Protokolü ve yüksek işlem hacmi hızla obezite ve genetik faktörler, ekran ikna etmek için model organizmalar, Drosophilagibi kullanmak için benzersiz bir platform tahlil teklif etiketi veya doğal ve sentetik kimyasal bileşikler, daha iyi anlamak metabolik dengesizlik. Sonuçta bu yeni tedaviler veya tedavileri metabolik hastalıklar için geliştirmek için bilimsel keşifler ilerlemesi katkı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Erika Taylor bu el yazması düzenleme için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser S.B.D. Ulusal Sağlık Enstitüleri (P01 HL098053, P01 AG033561 ve R01 HL054732) R.B. için bir doktora sonrası araştırma ek (R01 HL085481) ve arkadaş grubu (AAUW) hibe ve S.B.D. Amerikan Kalp Derneği'nden hibe tarafından finanse edildi ve R.T.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Talboys Ball dropper/bead Dispenser | Talboys | #: 930150 | |
| Talboys High Throughput Homogenizer | Talboys | #: 930145 | |
| Grinding Balls, Stainless Steel | OPS Diagnostics, LLC | # GBSS 156-5000-01 | 5000 balls |
| Masterblock 96 Well deep Microplates | Greiner Bio-One | # T-3058-1 | case of 80 plates |
| Greiner 96 well microplate flat bottom | Sigma Aldrich | # M4436 | 40 plates |
| Greiner CapMat for sealing multiwell plates | Sigma Aldrich | # C3606 | 50 sealing plates |
| Reagent Reservoirs | Thomas Scientific | # 1192T71 | 12/PK |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661040 | Thermo Scientific | # 4661040 | 1-10 ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661070 | Thermo Scientific | # 4661070 | 30-300ul multipipette |
| Thermo Scientific Finnpipette 4661020 | Thermo Scientific | #4661020 | 10-100ul multipipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3131-S | for 10 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | # P3133-S | for 200 uL pipette |
| Multichannel tips | Denville Scientific Inc | #P1125 | for 100 uL pipette |
| Forceps | Roboz Surgical | # 5 Dumonts | Super fine forceps |
| Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-00 | |
| Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance | Cole-Parmer scientific experts | # EW-11333-49 | |
| 96-Well microplate Centrifuge | Hettich Zentrifugen | # Rotina 420R | |
| Microplate Reader | Molecular devices | # SpectraMax 190 | |
| Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator | Biostad | # 3527 | |
| Infinity Triglycerides reagent | Thermo Scientific | # TR22421 | |
| Triglyceride Standard | Stanbio | #2103 - 030 | |
| Quick Start Bradford Protein Assay | Bio-RAD | # 500-0205 | 1x dye Reagent |
| Coconut oil | Nutiva | # 692752200014 | 15 0z jar |
| PBS 10X | Thermo Scientific | # AM9625 | 500 ml |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | # 9002-93-1 | |
| Gas-permeable Foil | Macherey-Nagel | # 740675 | 50 pieces |
| filter Paper | VWR | # 28317-241 | Pack of 100 |
| Drosophila vials | Genesee Scientific | Cat #: 32-116SB | |
| Quick Start Bovine Serum Albumin Standard | Bio-Rad | # 5000206 | |
| FlyNap Anesthetic | Carolina | # 173025 | 100 mL |
| Kimwipes Low-Lint | Uline | # S-8115 | 1-Ply, 4.4 x 8.4" |
References
- Ng, M., et al. Global, regional, and national prevalence of overweight and obesity in children and adults during 1980-2013: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2013. Lancet. 384, 766-781 (2014).
- Murphy, S. L., et al. Mortality in the United States, 2014. NCHS data brief, no 229. , Available from: https://www.cdc.gov/nchs/products/databriefs/db229.htm (2015).
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends Cardiovasc Med. 5, 21-28 (1995).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. Using Drosophila melanogaster to map human cancer pathways. Nat Rev Cancer. 5, 626-639 (2005).
- Chan, H. Y., Bonini, N. M. Drosophila models of human neurodegenerative disease. Cell Death Differ. 7, 1075-1080 (2000).
- Levine, M., et al. Human DNA sequences homologous to a protein coding region conserved between homeotic genes of Drosophila. Cell. 38, 667-673 (1984).
- Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat Rev Genet. 6, 9-23 (2005).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Noyes, B. E., et al. Identification and expression of the Drosophila adipokinetic hormone gene. Mol Cell Endocrinol. 109, 133-141 (1995).
- Rajan, A., Perrimon, N. Of flies and men: insights on organismal metabolism from fruit flies. BMC Biol. 11, 38 (2013).
- Rulifson, E. J., et al. Ablation of insulin-producing neurons in flies: growth and diabetic phenotypes. Science. 296, 1118-1120 (2002).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, 533-544 (2010).
- Musselman, L. P., et al. A high-sugar diet produces obesity and insulin resistance in wild-type Drosophila. Dis Models Mech. 4, 842-849 (2011).
- Diop, S. B., Bodmer, R. Gaining Insights into Diabetic Cardiomyopathy from Drosophila. Trends Endocrinol Metab. 26, 618-627 (2015).
- Williams, M. J., et al. The Obesity-Linked Gene Nudt3 Drosophila Homolog Aps Is Associated With Insulin Signaling. Mol Endocrinol. 29, 1303-1319 (2015).
- Morris, S. N., et al. Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster. Biochim Biophys Acta. 1822, 1230-1237 (2012).
- Bodmer, R. The gene tinman is required for specification of the heart and visceral muscles in Drosophila. Development. 118, 719-729 (1993).
- Erkkila, A., et al. Dietary fatty acids and cardiovascular disease: an epidemiological approach. Prog Lipid Res. 47, 172-187 (2008).
- Ganz, M., et al. High fat diet feeding results in gender specific steatohepatitis and inflammasome activation. World J Gastroenterol. 20, 8525-8534 (2014).
- Wang, C. Y., Liao, J. K. A mouse model of diet-induced obesity and insulin resistance. Methods Mol Biol. 821, 421-433 (2012).
- Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods Mol Biol. 420, 27-44 (2008).
- Mathews, K. W., et al. Sexual Dimorphism of Body Size Is Controlled by Dosage of the X-Chromosomal Gene Myc and by the Sex-Determining Gene tra in Drosophila. Genetics. 205, 1215-1228 (2017).
- Golay, A., Bobbioni, E. The role of dietary fat in obesity. Int J Obes Relat Metab Disord. 21, Suppl 3 2-11 (1997).
- Diop, S. B., et al. PGC-1/Spargel Counteracts High-Fat-Diet-Induced Obesity and Cardiac Lipotoxicity Downstream of TOR and Brummer ATGL Lipase. Cell Rep. 10, 1-13 (2015).
- Chatterjee, D., et al. Control of metabolic adaptation to fasting by dILP6-induced insulin signaling in Drosophila oenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 17959-17964 (2014).
- Palanker, L., et al. Drosophila HNF4 regulates lipid mobilization and beta-oxidation. Cell Metab. 9, 228-239 (2009).
- Heinrichsen, E. T., Haddad, G. G. Role of high-fat diet in stress response of Drosophila. PLoS One. 7, 42587 (2012).
- Kitahara, C. M., et al. Association between class III obesity (BMI of 40-59 kg/m2) and mortality: a pooled analysis of 20 prospective studies. PLoS Med. 11, 1001673 (2014).
- Reis, A., et al. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. J Lipid Res. 54, 1812-1824 (2013).
- Turne, C., et al. Supercritical fluid extraction and chromatography for fat-soluble vitamin analysis. J Chromatogr A. 936, 215-237 (2001).
- Na, J., et al. Drosophila model of high sugar diet-induced cardiomyopathy. PLoS Genet. 9, 1003175 (2013).
