Acredita-se que as bacteriocinas desempenham um papel fundamental na definição da diversidade microbiana em diferentes nichos ecológicos. Aqui, descrevemos um procedimento eficiente para avaliar como as bacteriocinas afetam a composição da microbiota intestinal em um modelo animal.
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Artigo de método
Um método para avaliar os efeitos da bacteriocina na microbiota intestinal de ratos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Perguntas muito intrigantes surgem com nosso conhecimento avançado sobre a composição da microbiota intestinal e a relação com a saúde, particularmente em relação aos fatores que contribuem para manter o equilíbrio populacional. No entanto, existem metodologias disponíveis limitadas para avaliar esses fatores. As bactérias são peptídeos antimicrobianos produzidos por muitas bactérias que podem conferir uma vantagem competitiva para aquisição de alimentos e / ou estabelecimento de nicho. Muitas bactérias de ácido láctico probiótico (LAB) têm um grande potencial para promover a saúde humana e animal, evitando o crescimento de agentes patogênicos. Eles também podem ser usados para imuno-modulação, pois produzem bacteriocinas. No entanto, a atividade antagonista das bacteriocinas é normalmente determinada por bioensaios laboratoriais em condições bem definidas, mas simplificadas em excesso, em comparação com o ambiente intestinal complexo em seres humanos e animais, onde bactérias enfrentam influências multifatoriais do hospedeiro e centenas de espécies microbianas sHaring o mesmo nicho. Este trabalho descreve um procedimento completo e eficiente para avaliar o efeito De uma variedade de bacteriocinas com diferentes especificidades alvo em um sistema murino. As alterações na composição de microbiota durante o tratamento com bacteriocina são monitoradas usando seqüência de rADN 16S composicional. Nossa abordagem usa os produtores de bacteriocina e os seus mutantes isogênicos que não produzem bacteriocinas, sendo este o último capaz de distinguir as modificações relacionadas à bacteriocina de modificações não relacionadas à bacteriocina nas microbiota. A extração de DNA fecal e os métodos de seqüência de rADN 16S são consistentes e, juntamente com a bioinformática, constituem um procedimento poderoso para encontrar mudanças fracas nos perfis bacterianos e estabelecer correlações, em termos de concentração de colesterol e triglicerídeos, entre populações bacterianas e marcadores de saúde. Nosso protocolo é genérico e, portanto, pode ser usado para estudar outros compostos ou nutrientes com o potencial de alterar o microfone hospedeiroComposição de robiota, seja ao estudar toxicidade ou efeitos benéficos.
Introdução
As bactérias são péptidos antimicrobianos produzidos por uma ampla gama de espécies bacterianas 1 , 2 . Esses compostos e seus produtores, especialmente LAB, foram explorados e explorados em todo o mundo há décadas por suas aplicações potenciais na preservação e medicina 3 . Várias bacteriocinas são conhecidas por matar agentes patogênicos importantes, incluindo espécies de Listeria, Enterococcus, Staphylococcus e Bacillus . Algumas bacteriocinas até têm a capacidade de modular a resposta imune 4 . Muitas bacteriocinas têm espectros relativamen....
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Protocolo
O cuidado e o manuseio devem ser realizados em uma unidade especializada de cuidados com animais. Os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo correspondente Comitê de Ética da Universidade de Valência e autoridades locais, seguindo os princípios de cuidados de animais de laboratório obrigatórios pelo Direito da União Européia e 2010/63 / UE e pelo Governo espanhol RD 53/2013 sobre proteção de animais Usado para fins científicos, a fim de respeitar o princípio 3R na experimentação animal (Replacement, Reduction, Refinement).
1. Culturas bacterianas congeladas usadas para inocular camundongos
- Inocule cepas individuais de....
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Resultados
A produção de bacteriocinas foi considerada uma característica probiótica positiva no LAB, já que se supunha que ele evita o crescimento de bactérias oportunistas e patógenos. O objetivo deste trabalho foi mostrar a capacidade das bacteriocinas para modular as populações de microbiota intestinal em um modelo de mouse. Para este propósito, foi desenvolvido um procedimento para comparar o efeito da ingestão de cepas produtoras de bacteriocina e suas cepas isogênicas não produtoras. O proce.......
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Discussão
O procedimento descrito aqui foi usado para determinar se as mudanças na microbiota são vinculadas à saúde ou à idade. Diferentes partes do protocolo são importantes, mas entre elas, amostragem das fezes, a escolha do fragmento de DNA a ser sequenciado e analisado, e a realização da extração de DNA e análises bioinformáticas certamente podem ser os pontos mais críticos. A amostragem é crucial porque, por razões éticas, os camundongos não devem ser estressados e porque é conhecido por mudar a proporção de bactérias no .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores desejam agradecer a Mobilidade Coordenada da Ciência e da Sustentabilidade da NASA NELS Science (Coordenação 017-ABEL-CM-2013). CB e GP-M. Foram apoiados pela concessão AGL2015-70487-P do Ministério espanhol da Economia e Competitividade. OCOU e DBD foram apoiados por um programa de bolsas estratégicas para pesquisas em ciência da alimentação da Universidade de Ciências da Vida (NMBU) (projeto 1205051025). Também gostaríamos de agradecer a Inmaculada Noguera por sua assistência com cuidados com animais e amostragem e Jesus Dehesa por sua ajuda para garantir a disponibilidade de materiais de laboratório nas instalações de animais. Também apreciamos o profes....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos Balb/c (fêmeas) | Harlan | Os camundongos devem ter de 6 a 8 semanas de idade | |
| Placa de Petri de plástico | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| Caldo de infusão cérebro-coração | Conda | 1400.00 | |
| Ágar bacteriológico europeu | Pronadisa | 1800.00 | |
| Agarose D1 Low EEO | Pronadisa | 8010.00 | |
| 1x Tampão TAE | Thermo Scientific | 15558042 | |
| MRS caldo | Difco | 288130 | |
| PBS comprimidos | Sigma | P4417-100TAB | |
| balança | Mettler Toledo | PB602-S | |
| pinça estéril | Levantina de Laboratorios S.L. | 260-3710014 | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5424 | |
| Centrífuga | Hermle | Z383K | |
| cloreto de sódio | AppliChem Panreac | 121659.1211 | |
| Realpure SSS Kit | Real Life Science Solutions, Durviz, Espanha | RBME04 (300 ml) | |
| Isopropanol | AppliChem Panreac | 131090.1611 | |
| Etanol | AppliChem Panreac | 131086.1214 | |
| Fluorômetro Qubit | Invitrogen | ||
| Qubit dsDNA HS Kit de Ensaio | Invitrogen | Q32851 | |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter Genomics, EUA | A63881 (60 ml) | |
| PerfeCta NGS kit de quantificação de biblioteca | Quanta BioSciences, Maryland, EUA | 733-2300 | |
| Kit de reagentes MiSeq v3 | Illumina, San Diego, Califórnia, EUA | MS-102-3003 | |
| Primers para amplificação do gene 16S rRNA | Os primers contêm a região V3-V4 do gene bacteriano 16S rRNA e adaptadores de saliência Illumina: 5'-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3' e 5'-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3' | ||
| Kit Nextera XT Index | FC-131-1002 | Adaptadores de índices e sequenciamento Illumina | |
| Micropilão para tubos de 1,5 mL, Eppendorf / Sigma , Ref. | Sigma | Z317314-1PAK | |
| Contas de vidro, diâmetro de 0,1 mm | Biospec | 11079-101 | |
| Kit de Limpeza de Gel e PCR NucleoSpin | Macherey-Nagel | 740609.25 | |
| Omni Bead Ruptor 24 | Omni International Inc. | 19-040 | |
| mutanolisina | Sigma | M9901-10KU | |
| lisozima | Roche | 10837059001 | |
| proteinase K | Roche | 3115887001 | |
| RNase A | Sigma | R4875 |
Referências
- Papagianni, M. Ribosomally synthesized peptides with antimicrobial properties: biosynthesis, structure, function, and applications. Biotechnol Adv. 21 (6), 465-499 (2003).
- Gillor, O., Kirkup, B. C., Riley, M. A. Advances in Applied Microbiology. 54
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Reimpressões e permissões
