Summary
Здесь описан метод для подготовки совместного культуры трехмерные (3D) сфероида поджелудочный рак клеток и фибробластов, следуют измерения метаболических функций, с помощью анализатора внеклеточного потока.
Abstract
Многие типы рака, включая рак поджелудочной железы, у плотных фиброзных стромы, которая играет важную роль в прогрессии опухоли и вторжения. Активированные рака связанные фибробластов являются ключевым компонентом опухоли стромы, которые взаимодействуют с раковые клетки и поддержки их роста и выживания. Модели, которые пилки взаимодействия раковых клеток и активированных фибробластов являются важными инструментами для изучения биологии стромы и развития противоопухолевых агентов. Здесь описан метод для быстрого поколения надежные трехмерный (3D) сфероида Сопредседатель культуры поджелудочных клеток рака и активированные поджелудочной железы фибробласты, которые могут использоваться для последующего биологических исследований. Кроме того описано использование 3D сфероидов в выполнении функциональных метаболических анализов зонда клеточной биоэнергетики пути, с помощью анализатора внеклеточного потока в паре с сфероида микроплиты. Рак поджелудочной железы клетки (Patu8902) и активированного поджелудочной железы фибробластов клетки (PS1) были совместно культивируемых и намагниченных использование сборки биосовместимых наночастиц. Намагниченные клетки были быстро bioprinted с помощью магнитных дисков в формате 96 хорошо, в средствах массовой информации роста для создания сфероидов с диаметром от 400-600 мкм в течение 5-7 дней культуры. Функциональные метаболических анализов с использованием Patu8902-PS1 сфероидов затем были проведены с использованием технологии внеклеточного потока зонда энергичный сотовой пути. Метод здесь проста, позволяет последовательно поколения раковых клеток фиброцита сфероида Сопредседатель культур и может быть потенциально адаптированы для других типов клеток рака после оптимизации нынешней методологии, описанной.
Introduction
В течение последнего десятилетия были разработаны многочисленные в vitro 3D модели для пилки и расследования в vivo опухоли биологии, микроокружения и роста условий раковых клеток в1,2. Двухмерный (2D) монослоя клеточные культуры, системы с единой экспозиции биохимические факторы и исследуемых соединений не реплицировать родной 3D стромальные опухоли взаимодействия подвергаются градиент соединений, диффундирующих через внеклеточного Матрица3,белки (ECM)4. Таким образом по сравнению с 2D тканевой культуры модели, 3D рака моделей возникли лучше показать потенциал в имитации микроокружения опухоли и служил в качестве важных инструментов лучше понять в vivo характеристики опухоли, как гипоксия, desmoplasia, покоя, наркотиков пенетрантностью, токсичности и терапевтические сопротивление5,6. С этой целью 3D-модели имеют потенциал для преодоления разрыва между 2D клеточной культуры и все животные модели путем передразнивать в естественных условиях особенностей опухоли, будучи относительно недорогой и оптимизирован для быстрого поколения и последовательности. Эти преимущества эксплуатируются для ускорения трансляционного исследования во многих областях, включая биологии рака, морфогенез и ткани, инженерных7,8.
В всплеск меняющихся методов 3D культуры ткани магнитная левитация методы недавно разработаны и описаны для роста, опробование и визуализация сфероидов, полученных от различных клеток типы9,10, 11 , 12. Магнитные 3D подложке эксплуатирует использование магнитных сил инженер тканей намагничивания клетки с биосовместимыми наночастиц и их печати в нескольких хорошо форматах. Это позволяет быстрое производство последовательной, вблизи идентичные 3D сфероидов, которые могут быть использованы и для множества нисходящие приложения на биохимические и биофизические исследования10. Здесь мы адаптировали техника магнитные подложке, с использованием биосовместимого материала, называется Nanoshuttle (NS), состоящий из оксида железа, поли-L-лизин и золотом нано частиц для обозначения поджелудочных клеток рака и фибробластов. NS придает электростатически плазматической мембраны, не известно для привязки любых специфических рецепторов, и релизы от клеток поверхности в течение недели. Он требует очень низкие магнитные силы (30pN), достаточно, чтобы агрегат, но не вреда клетки и не влияет на жизнеспособность клеток, обмен веществ или распространения, чтобы сделать его весьма биосовместимых для 3D культур10,13,14 ,15.
В этом исследовании используя рака поджелудочной железы как примером и моделью, мы описываем поколения и метаболических assay 3D раковых клеток фиброцита сфероидов. Начиная с клетки культивировали в 2D судов, проиллюстрируем культуры и роста условий поджелудочной железы опухоль фибробластов сфероидов Сопредседатель культуры с использованием магнитной подложке. Культивированный сфероидов затем были использованы в функциональных метаболических анализов с использованием анализатора внеклеточного потока, технология продемонстрировали одновременно измерить два основных энергетических производство пути, гликолиза и митохондриальное дыхание, в различных живых клеток и тканей16,,1718,19,20. Гликолиз была измерена как изменение уровня внеклеточной подкисления (ECAR), в то время как митохондриальное дыхание или Оксидативное фосфорилирование была измерена как норма потребления кислорода (OCR). Мы предлагаем, что этот метод, разработанный для сфероидов опухоль поджелудочной железы может служить основой для оптимизации и перевод поколения сфероида 3D опухоли и пробирного в другие типы клеток/тканей.
Protocol
1. 3D сфероидов культуры рака поджелудочной железы с помощью магнитных подложке
техника- Использование стандартных асептических тканевой культуры, культуры клеток интерес в колбе T75 к confluency 70-80% в средствах массовой информации соответствующих роста.
Примечание: Как правило, 5-7 × 10 6 клеток из 70-80% вырожденная T75 колбу были собраны. В этом исследовании - Patu8902 использовались два различных типов клеток (клетки поджелудочной железы опухоль) и PS1 клетки ( 21 активированных клеток поджелудочной железы севрюга). Обе линии клетки были культивировали в Розуэлле Парк мемориальный Институт массовой информации 1640 (RPMI 1640) с 10% (v/v) плода говядину serum(FBS), 1 × пенициллин стрептомицином (p/s). - Мыть клетки один раз с 5 мл Дульбекко ' s фосфатного буфера saline(DPBS).
- Отсоединить клетки из пластика поверхности trypsinizing с 2 мл 0,05% трипсина-ЭДТА для 5-10 мин при 37 ° C. Check для отряда клеток под микроскопом.
- Отключить трипсина путем добавления 8 мл питательных сред для отдельные клетки. Избегайте над trypsinization, как это может негативно сказаться на здоровье/жизнеспособность клеток.
- Клетки накапайте вверх и вниз, чтобы генерировать одну ячейку подвеска и количество клеток плотности, используя счетчик автоматизированных клеток или Горяева.
- В то же время, сбалансировать флакон НС до температуры окружающей среды.
- Вычислить количество клеток, необходимых для заполнения нужное количество сфероидов (колодцы) и Алиготе к новой 15 мл Конические трубки. Например, для всего 96 также пластины с 5000 клеток/хорошо, Алиготе минимум 5,5 × 10 5 клеток семян.
- Собирать клетки центрифугированием на 500 x g на 3 мин тщательно аспирационная или сцеживаться супернатант и Ресуспензируйте клетки в концентрации 1,0 x 10 6 клеток/мл в средствах массовой информации роста. Пипетка, аккуратно с помощью кончика широкий скучно накапайте во избежание сдвига. Например, Ресуспензируйте 5.5 x 10 5 клеток в 550 мкл питательных сред.
- Намагнитить нужное количество клеток с использованием уравновешенной NS (шаг 1.6).
- Непосредственно добавить NS суспензию клеток в средствах массовой информации роста и агитировать осторожно. Для эффективного магнитного маркировки ячеек, используйте 10 мкл NS на 100 мкл клетки (высокомобильна в 1 x 10 6 клеток/мл).
Примечание: Для типичной эксперимента, лейбл 5,5 × 10 5 Patu8902 клеток в 550 мкл с 55 мкл NS и 1.1 × 10 6 PS1 клеток в 1100 мкл, (отдельно) с 110 мкл NS. - Нежно инвертировать трубки несколько раз для обеспечения суспензию клеток. Временно передача смеси клетки NS в одну скважину 24-ну плиты. Сделать это отдельно для каждого типа клеток, чтобы быть намагниченные. Крышка и инкубировать клетки при комнатной температуре на 2 ч с нежным пожимая разрешить NS привязку к поверхности клетки и.
Примечание: Культура и пробирного сфероидов, начиная от Patu8902 или PS1 только клетки, помимо совместного культуры сфероидов начиная с обоими ячейка типы смешиванием до печати на магнитных дисках была успешно достигнута с помощью этого метода в независимых эксперименты. Метод для создания совместного культуры сфероидов из клеток Patu8902 и PS2 описан ниже в последующих шагах.
- Непосредственно добавить NS суспензию клеток в средствах массовой информации роста и агитировать осторожно. Для эффективного магнитного маркировки ячеек, используйте 10 мкл NS на 100 мкл клетки (высокомобильна в 1 x 10 6 клеток/мл).
- Пипетки вверх и вниз намагниченных клетки осторожно, чтобы смесь равномерно и подготовить мастер смеси, содержащие номер нужной ячейки. Для посева сфероидов, использовать в общей сложности 15 000 клеток (5000 Patu8902 + 10000 PS1) и приспособиться к общим объемом 150 мкл на хорошо плиты 96-луночных.
Примечание: Окончательный объем в каждой скважине должны быть одинаковыми, независимо от количества ячеек, которые используются. - Место клетки репелленты 96-луночных пластины на вершине 96-луночных магнитные сфероида диск и отказаться от 150 мкл смесь клеток в каждой скважине. Соблюдайте клетки медленно собирать в центр хорошо над магнитом. Накрыть крышкой и инкубировать пластины на ночь в 5% CO 2 инкубатора набор при 37 ° C с магнитной сфероида диск еще прилагается. Снять магнитный диск и инкубировать для дальнейшего роста до 7 дней и.
Примечание: Очень важно использовать репелленты клеток роста пластины для печати сфероида, используя диски магнитные сфероида. Убедитесь, что используется сфероида диск с тоньше небольших магнитов, не диск Холдинг. - Контролировать рост сфероидов каждый день. Пополняться свежими роста СМИ каждые три дня, поместив пластине роста на магнитные Холдинг диск под углом и с помощью многоканальные пипетки для извлечения отработавшего СМИ.
Примечание: Patu8902 и PS1 клетки совместно посеян на 15 000 клеток/также будет расти в 3D сфероидов с диаметром 400-600 мкм в течение 5-7 дней. На данный момент сфероидов готовы метаболических характеристик, оценки и другие нисходящие приложения.
2. Метаболические Assay 3D поджелудочной железы опухоль сфероидов для биоэнергетики пути, с помощью внеклеточного анализатора потока
Примечание: В этом разделе, анализ метаболических функций сфероидов, используя внеклеточного потока описал анализатор с Пробирной планшет специально для 3D сфероидов.
- Мытье и передача сфероидов от роста пластины сфероида пробирного планшет.
Примечание: Сфероидов может использоваться для метаболических анализов, когда они достигают в диаметре ~ 500 мкм.- За день до проведения анализа, гидрата датчик или датчик патрон с Пробирной calibrant (200 мкл/а) в указанное приложение utility пластины и инкубировать ночь (4-18 ч) в увлажненные инкубатора (-CO 2) на 37 ° C.
- Подготовить соответствующий пробирного среднего для желаемого метаболических assay, дополняя базового средства массовой информации (см. таблицу материалы) либо пробирного 2 мм L-глютамин для стресс-тест гликолиз (GST) или с пируваткиназой 1 мм, 2 L-глютамина и 10 мм глюкозы для анализа митохондриальной стресс-тест (MST).
Примечание: Внеклеточная потока Анализатор измеряет митохондриальное дыхание (OCR) и гликолиз (ECAR) живых клеток в формате 96-луночных пластины. Эти курсы предоставляют обзор сотовых метаболические функции в образцах под следствием. Пожалуйста, обратитесь к руководству в Пробирной наборы для получения подробных инструкций. - После добавления анализа конкретных дополнений (см. шаг 2.1.1), теплый дополнениями пробирного среднего в ванну воды 37 ° C и скорректировать рН 7,4 ± 0,1 с 0.1N NaOH. Согреться до использования носителя.
- Воссоздать пробирного комплект реагентов в средне-калиброванные пробирного рекомендованные биржевые концентрации.
Примечание: Они сделаны на 10 × конечная концентрация, желательно в скважинах. Складе концентрации глюкозы, oligomycin и 2-deoxy глюкоза (2-ГД), 100, 100 мкм и 500 мм, соответственно.
Микроскоп - наблюдать сфероидов в роста пластины под свет проверить сфероида морфологии и общее единообразие; с точки зрения формы и structure сфероидов.
- Передача пластину роста на диск магнитные Холдинг и тщательно аспирационная ~ 120 мкл концентрированного роста средств массовой информации. Аккуратно мыть сфероидов с ~ 120 мкл утепленные и предварительно калиброванного пробирного СМИ, аспирационная и повторить мыть дважды. Осмотрите сфероидов под микроскопом снова, чтобы убедиться, что сфероидов не смываются.
- Подготовить микроплиты пробирного сфероида, добавив 180 мкл теплой пробирного СМИ в каждой скважине.
- P20 микропипеткой равным 10 мкл и подходят широкие скучно кончика к нему. Если не доступны широкой скучно советы, отрезать советы регулярных наконечники с чистой ножницы или скальпеля для расширения скважины.
Примечание: Это должно уменьшить наклон и сохранения общей морфологии сфероидов во время передаются пробирного пластин. - Использовать поверхность теплого (37 ° C) для выполнения передачи сфероидов. Использование просмотра поверхности рентгеновской пленки на разогретую с белого света лампы для повышения контраста и оказания помощи в визуализации сфероидов во время процесса передачи.
- Тщательно аспирата, единый предварительно выстиранные сфероида от клеток репелленты роста пластины с помощью P20 микропипеткой оснащены широким родила подсказка и аккуратно передача сфероиде непосредственно в центр каждой скважины сфероида пробирного плиты для проведения метаболических анализа. Разрешить каждый сфероида нежно попадают в Центральный микро камеры каждой скважины самотеком чисто для заполнения пластину пробирного.
Примечание: Обычно это занимает 5-8 s для каждого сфероида попасть в центр хорошо под действием силы тяжести. Не вытащить пипеткой, до тех пор, пока сфероидов обосновались в микро камеры. Делать не депозит сфероидов в скважинах 4 угла пробирного пластины (А1, A12, H1, Н12) поскольку будет использоваться как фон Уэллс. - Мониторинг морфологии и положение каждого сфероида, для обеспечения того, чтобы каждый сфероида в центре каждой скважины. При необходимости, переместить в центр хорошо, аспирационных вне сфероида, используя широкий родила наконечник пипетки и последующее осаждение самотеком.
- После того, как были переданы все сфероидов, место пластину пробирного в инкубатор увлажненный воздух 37 ° C (-CO 2) для одного часа до пробирного.
- Загрузки датчик патрон с соединениями и выполнение анализа
- подготовить 10 × сосредоточены пробирного определенных реагентов в Пробирной конкретных средств массовой информации, описанные в шаге 2.1.2. К примеру осуществлять GST, глюкоза, oligomycin и 2-DG в рекомендуемых объемах упоминаемые в Пробирной руководство. GST и MST анализы были проведены с использованием Patu8902-PS1 сфероидов.
- Должным образом ориентировать датчик картридж с рядами маркировкой A-H на стороне left hand и место загрузки руководство на верхней части картриджа датчик. Обеспечения правильной загрузки нужного порта ориентируя загрузки руководства таким образом, чтобы письмо, соответствующий порт, чтобы загрузить в левом верхнем углу.
- С помощью многоканальных дозаторов, обойтись реагентов непосредственно в инъекции порты. Держите загрузки руководства в положении с помощью пальцев во всей процедуре.
Примечание: Каждый реагент будут вводиться в рекомендуется порт, упомянутые в руководстве пробирного. Избегайте создания пузырьков воздуха, но не коснитесь любой частью картриджа для удаления воздушных пузырей. - Удалить загрузки руководства и позиции на уровне глаз с картриджа осмотрите инъекции порты даже загрузки.
- Создать протокол экспериментальной assay дизайн/инструмент, с помощью инструмента контроллера волны (программное отныне, анализ), как описано в разделе 2.3.
- Assay дизайн и исполнение с использованием программного обеспечения для анализа
- создать шаблон пробирного для эксперимента
- откройте программное обеспечение для анализа и нажмите кнопку " шаблоны " или выбрать из существующих assay шаблон. Дважды щелкните на " пустой шаблон ".
- Определение экспериментальных групп и условий.
- Инъекции определить стратегии для портов A, B и C. отпуск порта D пустой.
Примечание: Для GST assay, только эти порты будут загружены с глюкозой, Oligomycin и 2-DG. В случае пробирного MST, oligomycin, FCCP и ротенон загружается. - Определение предварительного лечения если сфероидов относились с одного или нескольких испытаний соединений и в контрольной группе. Определить пробирного СМИ включить источник, добавки и другие сведения.
- Определить один или несколько тип ячейки (например, Patu8902, PS1) видя номер информацию о плотности и прохода.
- Инъекции определить стратегии для портов A, B и C. отпуск порта D пустой.
- Нажмите " создавать группы ".
- Нажмите " пластина карта " вкладке и назначить группы пробирного пластины, соответствующий экспериментальный дизайн.
- Выберите четыре угловых скважин как фон скважин. Убедитесь, что в этих скважинах не сфероидов.
- создать шаблон пробирного для эксперимента
- Выполнения анализа на анализаторе
- нажмите на вкладку Протокол инструмент сохранить по умолчанию команды протокола путем проверки " калибровка ", " Equilibrate " и " цикл измерения исходных ".
- Нажмите " инъекции " и определить составные для каждого порта. Редактировать циклы измерения до 6 циклов по умолчанию 3 циклов для сфероидов. Держите по умолчанию 3 мин микс, 0 мин ожидания и раз мера 3 мин.
Примечание: По умолчанию микс ждать мера раз являются 3 мин, 0 мин, 3 мин, соответственно. Три измерения базальной ставка обычно принимаются до введения первого анализа составных. Эти измерения могут быть откалиброван и скорректированы в соответствии с экспериментальными. - Обзор протокола и группы резюме.
- Сохранить шаблон дизайна пробирного.
- Перейти к предварительно пробирного калибровка после инъекции порты были загружены с Пробирной субстратов. Передать анализатор внеклеточного потока картриджа с пластиной утилита.
Примечание: Это обычно завершается в течение 15-20 мин и калибровка датчиков проводить измерения OCR и ECAR. - После калибровки картриджа, замените пластину подогретым пробирного, содержащий 3D сфероидов пластину утилита и инициировать assay. После завершения измерений, экспортируйте данные в электронную таблицу или графиков и статистическое программное обеспечение для анализа данных о.
Representative Results
Общий рабочий процесс для магнитных подложке и внеклеточной потока анализа 3D сфероидов
Рисунок 1 изображает обзор всего процесса, указанных в настоящем Протоколе. Рак поджелудочной железы клетки (Patu8902) и активированные клетки Ито (PS1) были культивировали в колбах культуры ткани, содержащие соответствующие роста СМИ confluency 70-80%. Клетки были отдельно от 2D культуры судна и промывают, плотность клеток определяли и клетки, наконец высокомобильна в средствах массовой информации роста на 1 × 106 клеток/мл. НС, наночастиц Ассамблея, состоящая из золота, оксид железа и поли L-лизин был использован намагнитить клетки. Индивидуально намагниченных Patu8902 и PS1 клетки были затем смешанные и напечатаны на 96-луночных репелленты клеток роста пластин, монтируется на диске магнитные сфероида. Мы оптимизировали 15000 быть общее количество клеток для заполнения одной скважины (5000 Patu8902 клетки смешивают с 10000 PS1 клетки для создания единого сфероида). После инкубации в условиях соответствующей культуры ткани для 5-7 дней 3-мерной сфероидов были получены, во время которого контролируется и Записанная рост этих сфероидов. После мытья с Пробирной СМИ, сфероидов физически были переведены на сфероиде Гонав для осуществления метаболических анализов с использованием анализатора внеклеточного потока для одновременного измерения гликолиза и митохондриальное дыхание.
Культура и рост опухоли поджелудочной железы-фибробластов сфероидов
Чтобы получить функциональные и надежные сфероидов, Эпителиальный рак клеток линии Patu8902 и активирован севрюга клетки PS1 были культивировали в RPMI 1640 дополнена плода бычьим сывороточным. Pat8902 и PS1 клетки намагниченных с NS были затем смешиваются в соотношении 1:2, с тем чтобы семя в общей сложности 15 000 ячеек на хорошо в пластине роста. В течение 24 ч печати клетки на магнитные диски, клетки сфокусированных в центр хорошо именно на вершине каждой Сцепляющий магнит под каждой скважины. Рост Patu8902-PS1 сфероидов контролируется изображений на дни 2, 4, 7 и 9 после посева клетки. Рисунок 2 показывает количественное определение среднего диаметра представитель сфероидов в различные моменты времени выше. Диаметр сфероидов увеличивается от 414 мкм на день 2 596 мкм на 7 день после печати. Существует никакого существенного различия между ростом на 7 и 9, и таким образом всех дальнейших экспериментов было ограничено до 7 дней сфероида роста. Мы заметили, что сфероидов приобрести острее морфология особенно вокруг наружных краев и NS постепенно более равномерно распространяется по всему объему сфероида с несколько дней в культуре. Мы также оценили шарообразность 10 сфероидов, основанное на продолжительности их основных и вспомогательных осей. Средняя шарообразность-0,92 ± 0.04 для только Patu8902 (опухоль), 0,95 ± 0.04 для PS1 (стромы) только и 0,94 ± 0,02 для совместного культуры сфероидов.
Функциональных метаболических пробирного поджелудочной железы 3D сфероидов с помощью внеклеточные потока анализатор
Чтобы проверить функциональность сфероидов, мы заняты метаболических и биоэнергетика анализ зонда энергетические каналы в сфероидов. Мы провели гликолиз стресс-тест на сфероидов культивировали как описано выше. С этой целью сфероидов генерируется из Patu8902 или PS1 клеток помимо вытекающих из совместного культуры клеток двух типов были подвергнуты assay. Интересно, что все три вида сфероидов, ли возникая от отдельных или смешанных клеток, выставлены биологически функционального реагирования на пробу GST. После инъекций насыщения концентрации глюкозы, сфероидов испытания показывают увеличение в гликолитических пути как свидетельствует увеличение ECAR (рис. 3). Когда, митохондриальных производства АТФ был тормозится, с помощью oligomycin, производство энергии сдвигает гликолиза и толкнул клетки к максимальной гликолитических емкости, как дальнейшее увеличение ECAR. Ингибирование гликолиза, используя 2-DG, аналоговый глюкозы, что конкурентоспособная связывает глюкозы гексокиназа, привело к снижению ECAR, подтверждающий, что предварительное увеличение ECAR было обусловлено Активность гликолитических. Мы заметили, что испытания в этом исследовании сфероидов ответил таким образом, хотя только сфероидов PS1 (средний диаметр 250 мкм) относительно низкий сигнал, возможно, вследствие их меньшего размера и Нижняя гликолитических потенциал, по сравнению с Patu8902 рака клетки (средний диаметр 600 мкм). В общем выше ECAR сигнал от опухолевых клеток, полученных по сравнению с теми из относительно небольших PS1 фибробластов сфероидов производные сфероидов, возможно может объясняться раковые клетки присущие метаболических склонность к гликолиз22, 23. Все три вида сфероидов были получены от посева одинаковое количество клеток, хотя мы заметили сфероида размер различия между каждого типа, с PS1 только сфероидов, будучи самым маленьким, следуют сфероидов Сопредседатель культуры, и Patu8902 только сфероидов крупнейший.
Для тестирования функции митохондрий в 3D сфероидов, мы подвергнуты Сопредседатель культуры сфероидов пробирного MST. MST меры ключевые параметры функции митохондрий, непосредственно измеряя распознавания клеток (рис. 4A и 4B). Последовательный впрыск с соединениями (oligomycin, FCCP и смесь ротенон и antimycin A) был использован для измерения ключевых параметров митохондриальной например, производства АТФ, максимальная дыхания и не митохондриальное дыхание. Эти параметры и базальной дыхания ставки также использовались для расчета Протон утечки и запасных дыхательные способности (рис. 4 c). Уменьшение в OCR в ответ на oligomycin, ингибитор АТФ-синтазы (комплекс V) коррелирует митохондриальное дыхание, связанные с сотовой производства АТФ. Сфероидов инкубировали с oligomycin на более длительный срок позволить максимального проникновения и время эффективного ответа. Вторая инъекция с uncoupler FCCP стимулирует потребление кислорода Максимальная и соответствующее увеличение OCR. FCCP-стимулирует OCR использовалась для расчета запасных дыхательных возможностей, мера способности клеток реагировать на спрос на энергию. Третий инъекции; смесь ротенон (комплекс я ингибитор) и antimycin A (ингибитор комплекс III) блокирует митохондриальное дыхание, как резкое снижение в OCR (Рисунок 4BОнг >).
В целом наши наблюдения подтверждают функциональность культивировали сфероидов с использованием анализатора внеклеточного потока как мера их метаболические след/деятельности как с точки зрения гликолитических и митохондриального потенциала, как описано выше.
Рисунок 1 . Схематическое представление методологии для культуры и пробирного рака поджелудочной железы клетки/фибробластов сфероидов. Patu8902 и PS1cells были культивировали, trypsinized, промывают и рассчитывал. Для заполнения каждого сфероида, Patu8902 (5000 клеток/а) и PS1 фибробластов (10 000 клеток/хорошо) были намагничены с помощью NS и напечатаны на клетки репелленты роста пластины на 1 день. После посева, пластины роста был смонтирован на диск магнитный сфероида (с одним магнитом по каждой скважине пластины роста 96 хорошо формат) и разрешено культуры для 2-7 дней, чтобы получить 3D сфероидов. Результате сфероидов были промывают и переданы сфероида пробирного планшет осуществлять метаболических анализов на инструменте внеклеточного потока. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Рост опухоли поджелудочной железы-фибробластов сфероидов. (A представитель изображение Patu8902-PS1 Сопредседатель культуры сфероида соответствующий день в культуре показано на верхней части и размер в диаметре сфероида (мкм) количественно ниже. Постепенное увеличение сфероида размер и диффузия частиц NS (темные точки) на протяжении всего его объем очевидно, между 2 и 7 дней. Сфероидов хранились в культуре еще 2 дней после этого, которые не привели к значительному увеличению диаметра сфероида. (B) представитель фотографии сфероидов, производный от опухолевых клеток (Patu8902), клетки стромы (PS1) и совместно культивируемых клеток (Patu8902 + PS1) показано. (C) шарообразности данных изображен от 10 отдельных сфероидов от каждой группы. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Гликолиз стресс-тест (GST) с поджелудочной железы сфероидов. (A) схематическое представление типичной гликолитических функция пробирного с различными параметрами пробирного изображены. (B) пример теста GST над поджелудочной железы сфероидов, культивируемых с использованием методики, описанной. Глюкозы раствор для инъекций наращивает гликолиза, как увеличение ECAR, с дальнейшего увеличения на добавление oligomycin для отключения митохондриальное дыхание. ECAR падает в ответ на 2-DG, конкурентоспособной аналоговый глюкозы, блокируя гликолиза. Все сфероидов отмечены выставлять функциональный ответ GST assay. (C) выход с помощью генератора отчетов производителя, изображающие трех основных параметров GST пробирного анализа GST. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Митохондриальных стресс-тест (MST) с Patu8902-PS1 сфероидов. (A) схематическое представление типичной митохондриальной функции анализа с различными параметрами пробирного изображен. (B) пример MST на поджелудочной железы опухоль фибробластов сфероидов показан. (C) совместно культуры 3D сфероидов экспонат функционального реагирования на MST assay. Как и ожидалось, митохондриальной функции измеряется как упадок в OCR заметил когда сфероидов были оспорены с oligomycin, ингибитор NO-синтетазы АТФ. С помощью FCCP нарастить поток электронов привело к максимальной OCR, который сразу же рухнули на ингибирование митохондриальное дыхание с использованием комплекса ингибиторов митохондриальных коктейлем-. Планки погрешностей представляют Среднеквадратичная ошибка среднего (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
С помощью рак поджелудочной железы, 3rd ведущей причиной рака смертей в Соединенных Штатах,24, как примером и моделью, быстрого и последовательного метода был разработан расти и пробирного 3D сфероидов, с использованием совместного культуры клеток поджелудочной железы и активирован поджелудочной железы фибробластов. С помощью магнитного подложке, были получены сфероидов колебаясь в размере от 400-600 мкм в диаметре. Они были подвергнуты метаболических анализов для успешного тестирования функциональных возможностей искусственного 3D сфероидов. Этот метод прост, последовательной и может быть легко адаптирована для других типов клеток.
Хотя эта методология будет ускорить и добавить к значению трансляционная анализов, выполненных с 3D сфероидов, он может быть улучшено путем разработки методов, которые позволяют мультиплексирование сфероида манипуляции и обработки. Это должно еще больше снизить общее время, стоимость и труда, необходимых для выполнения анализа. Кроме того сфероиде томов может использоваться для нормализации распознавания сигналов как сообщили другие6. Сфероида объём нормализованной средний объем ячейки могут быть использованы для определения оптического распознавания текста в ячейке, но поскольку рост сфероидов не будет идентичным, расчета абсолютной OCR в клетку может быть сложным. В настоящее время эта методология ограничивается отсутствием эффективным инструментом мультиплекс сфероида обработки и передачи от роста пластины для анализа окружающей среды.
Метод, описанный изменения и адаптировано из технологии магнитных подложке и далее проверяется, чтобы показать функциональные актуальности путем применения искусственного сфероидов к течению метаболического анализа. Этот метод обеспечивает важный инструмент для создавать надежные, жизнеспособные и функциональных сфероидов, которые содержат два типа основных клеток в большинстве тканей тумора, раковые клетки и связанных рака фибробласты, которые могут быть использованы для других исследуемых анализов, такие экраны наркотиков. Относительной легкости и эффективности методологии NS является значительное улучшение над другими методами25, такие как повешение падение метод2,26 сфероида поколения.
Созданный таким образом надежный сфероидов предоставляют в vitro опухоли модель которая включает стромальные клетки, которые часто отсутствуют многие исследования 3D культуры. Возможности для применения сфероида 3D моделей, созданных таким образом огромны. Например такие модели могут быть использованы для расследования ячеек взаимодействий, биоэнергетика сдвиги и тестирования генетической предрасположенности и зависимость различных терапевтических схем. 3D сфероидов которые пилки микроокружения опухоли в естественных условиях служат весьма актуальным и полезным инструментом для наркотиков скрининговых исследований и те изучение механизмов действия текущих и новых терапевтических средств. Метаболические анализов зондирующего энергетические каналы, с помощью сфероидов культур с мутантные клетки может помочь пролить новый свет на роль этих генов и соответствующих путей в pathobiology в соответствующих 3D модели рака, как сфероидов, описанные в данном исследовании.
Успешное применение данного метода опирается прежде всего на здоровье клеток, необходимых для магнитных печати, именно поэтому клетки, растущих в логарифмической фазе следует собирают и намагниченных. Важно использовать магнитные сфероида диск для печати намагниченных клетки и не Холдинг диск, который должен использоваться только во время стирки сфероида и СМИ, пополняя шаги описаны метода. Другие наиболее важным аспектом для успешного считывания метаболических анализов является поддержание морфология сфероидов во время процесса передачи от роста пластины на пластину пробирного.
В целом этот протокол был создан для поколения 3D сфероидов, которые содержат рака и стромальных клеток, после последующих метаболических пробирного сфероидов, используя анализатор внеклеточного потока. Ключевые особенности этого метода, что это быстро, легко адаптируемых и последовательной, отношение к и имитирует микроокружения опухоли в естественных условиях , сравнительно недорогой и может служить новый инструмент для изучения биология опухоли и разработка противоопухолевых агенты.
Disclosures
Авторы George W. Роджерс и Эндрю Neilson являются сотрудники/акционерами Agilent Technologies, которая производит реагентов и инструменты, используемые в этой статье. Все другие авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить за помощь в оптимизации условий культуры и мониторинга роста сфероида Samuel Zirbel. Мы благодарны Agilent technologies для предоставленияe96 анализатор SeaHorse XF, пробирного реагентов и технические идеи. Мы также благодарим доктора Hemant Kocher в институте рака Barts в Соединенном Королевстве за предоставление PS1 клетки. Эта работа была частично поддержана Фондом Magowitz Seena поджелудочной железы рак исследований и стоять до-рак исследований Великобритании-Люстгартен фонд поджелудочной железы рак мечта команды исследовательский грант (номер гранта: SU2C-AACR-DT-20-16). Стенд до рак является программа Фонда индустрии развлечений. Исследовательские гранты находятся в ведении американской ассоциации по исследованию рака, научным партнером SU2C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin EDTA | Sigma | 25300-054 | |
| 96 well cell repellant plate | USA Scientific/ Griener Bio-One | 655970 | spheroid growth plate |
| Cellometry Cell counting slides | Nexcelom | CHT4-SD100-002 | |
| D-Glucose | Sigma | D9434 | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Glycolysis Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103020-100 | |
| L-Glutamine | Sigma | 59202C | |
| Mitochondrial Stress Test Kit | Agilent Technologies | 103015-100 | |
| n3D Magnetic Spheroid drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
| n3D Magnetic Spheroid holding drive | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit |
| n3D NanoShuttle-PL | Nano3D Bioscience | 655841 | Part of Spheroid Bioprinting Kit: store at 4 °C |
| Patu8902 cells | Laboratory Stock | pancreatic ductal adenocarcinoma cells | |
| PS1 cells | Laboratory Stock | activated pancreatic stellate cells | |
| RPMI1640 | Gibco | 11875-093 | growth media for cells, spheroids |
| SeaHorse XFe96 extracellular flux analyzer | Agilent Technologies | extracellular flux analyzer | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| XF Base media | Agilent Technologies | 102365-100 | base media for metabolic assays on XFe96 |
References
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: Novel in vitro approaches to cancer studies. J Cell Commun Signal. 5 (3), 239-248 (2011).
- Ware, M. J., et al. Generation of an in vitro 3D PDAC stroma rich spheroid model. Biomaterials. 108, 129-142 (2016).
- Zhang, S. Beyond the Petri dish. Nat Biotechnol. 22 (2), 151-152 (2004).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, New York, N.Y. November 1708-1712 (2001).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer. Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Jiang, L., et al. Reductive carboxylation supports redox homeostasis during anchorage-independent growth. Nature. 532 (7598), 255-258 (2016).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Souza, G. R., et al. Three-dimensional tissue culture based on magnetic cell levitation. Nat Nanotech. 5 (4), 291-296 (2010).
- Haisler, W. L., Timm, D. M., Gage, J. A., Tseng, H., Killian, T. C., Souza, G. R. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat Protoc. 8 (10), 1940-1949 (2013).
- Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Sci Rep. 5, 13987 (2015).
- Tseng, H., et al. Luminescent Viability Assays in Magnetically Bioprinted 3D Cultures. , Promega Corporation. Updated (Figure 1) 1-9 (2015).
- Tseng, H., et al. Assembly of a three-dimensional multitype bronchiole coculture model using magnetic levitation. Tissue Eng Part C Methods. 19 (9), 665-675 (2013).
- Daquinag, A. C., Souza, G. R., Kolonin, M. G. Adipose tissue engineering in three-dimensional levitation tissue culture system based on magnetic nanoparticles. Tissue Eng Part C, Methods. 19 (5), 336-344 (2013).
- Tseng, H., et al. A three-dimensional co-culture model of the aortic valve using magnetic levitation. Acta Biomat. 10, 173-182 (2013).
- Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. a Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), e3-e7 (2010).
- Wang, R., et al. The Acute Extracellular Flux (XF) Assay to Assess Compound Effects on Mitochondrial Function. J Biomol Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
- Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300 (2013).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. J Vis Exp. (106), e53464 (2015).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. J Vis Exp. (117), e54918 (2016).
- Froeling, F. E. M., et al. Organotypic culture model of pancreatic cancer demonstrates that stromal cells modulate E-cadherin, beta-catenin, and Ezrin expression in tumor cells. Am J Pathol. 175 (2), 636-648 (2009).
- Kim, J. W., Dang, C. V. Cancer's molecular sweet tooth and the warburg effect. Cancer Res. 66 (18), 8927-8930 (2006).
- Holley, A. K., Dhar, S. K., St. Clair, D. K. Curbing cancer's sweet tooth: Is there a role for MnSOD in regulation of the Warburg effect. Mitochondrion. 13 (3), 170-188 (2013).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2017. CA: Cancer J Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
