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海马体啮齿类动物脑切片中突触密度的评估

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DOI：

10.3791/56153

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2017年10月6日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文概述了一种利用免疫荧光技术在海马切片中准确识别和分析突触的实验方案。

摘要

在大脑中，突触是神经元之间特化的连接结构，决定着神经信号传递的强度与范围。在发育过程及神经元成熟期间，突触的数量受到严密调控。尤为重要的是，突触数量的异常可导致认知功能障碍。因此，对突触数量的评估是神经生物学研究的重要组成部分。然而，由于突触在完整大脑中体积微小且高度密集，对其绝对数量的测定具有挑战性。本实验方案介绍了一种利用免疫荧光显微镜技术在啮齿类动物海马脑片中简便识别和评估突触的方法。该方法包含三步流程，通过分析海马脑片中突触前和突触后蛋白的共定位，对高质量共聚焦显微镜图像中的突触进行评估。本文还详细说明了分析过程，并提供了兴奋性突触与抑制性突触的代表性示例。本方案为突触分析提供了可靠的基础，可广泛应用于任何关于脑结构与功能的研究。

引言

人脑大约包含 1014 个突触。在中枢神经系统（CNS）的发育和成熟过程中，突触数量受到严格调控。在整个发育过程中，通过突触生成和突触修剪共同调节突触数量，以形成功能性的神经元网络。学习和记忆依赖于突触数量和强度的调节，这一过程被称为突触长时程增强和长时程抑制1。重要的是，成熟突触的稳定对于维持神经元网络连接至关重要。此外，已有研究报道，在阿尔茨海默病（AD）等神经退行性疾病的早期阶段即出现突触密度的降低2。因此，准确识别和评估突触数量的能力对于脑生理与病理研究具有重要意义。

突触的极高密度和紧凑结构使得在完整脑区中精确估算其数量变得极具挑战性。中枢神经系统（CNS）中的化学突触由两个紧密相邻的神经元构成，二者之间被突触间隙分隔3。突触前终末（即突触小体）源自轴突，内含大量聚集的囊泡，这些囊泡中储存的神经递质决定了突触的特异性——兴奋性突触主要为谷氨酸，抑制性突触则为γ-氨基丁酸（GABA）。囊泡膜上含有针对每种神经递质特异的囊泡转运蛋白：谷氨酸囊泡转运蛋白（vGlut）负责谷氨酸，GABA囊泡转运蛋白（vGAT）负责GABA。突触后终末是一种高度致密的结构，由多种蛋白质组成，包括受体、黏附分子和支架蛋白。在兴奋性突触中，突触后密度蛋白-95（PSD-95）是最丰富的支架蛋白4，可调节兴奋性N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体和α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）受体的功能；而在抑制性突触中，gephyrin蛋白则将抑制性受体锚定于突触后终末5。总体而言，突触前和突触后区室中蛋白质的特异性有助于区分和鉴定不同类型的突触亚型。

突触数量的评估可通过多种技术实现。最常用的方法是电子显微镜（EM）技术，该技术能够以高放大倍数和高分辨率对致密且完整的脑区中的突触进行分析。然而，该技术成本高昂，需要复杂的样品制备过程，且耗时极长。其他技术包括阵列断层成像技术6，但其主要缺点在于需要专用且昂贵的设备才能完成分析。此外，表达特定突触标记物的转基因品系在评估突触数量方面也具有应用价值7，但新品系的构建可能受到限制且成本较高，同时蛋白的过表达可能导致非预期的脱靶表型。

由于这些局限性且为了简化操作，许多研究人员通过检测突触总蛋白水平来评估突触数量。然而，在突触蛋白发生显著变化之前，即可观察到突触丢失，因为结构性突触重塑会导致突触前或突触后结构的分离，而突触蛋白本身并未降解。此外，在阿尔茨海默病（AD）中，突触蛋白水平的降低发生在突触变性或神经元死亡之后8,9。因此，仅对总蛋白水平进行定量无法区分这些情况。由此可见，亟需建立一种可靠、简便且准确的方法，用于评估脑内突触数量。

本文介绍了如何利用免疫荧光显微镜对啮齿类动物海马脑片中的突触进行充分识别并确定其数量。突触通过突触前和突触后标记物的共定位来界定，这些标记物呈点状分布。 我们通过研究大脑中Wnt信号通路来验证该技术的有效性。Wnt是一类分泌性蛋白，在突触的形成、消除和维持过程中发挥重要作用。 体内 Wnt信号通路分泌型拮抗剂Dickkopf-1（Dkk1）的诱导会导致海马区兴奋性突触丢失，同时保留抑制性突触10我们展示了在表达 Dkk1 的成年小鼠海马脑片中兴奋性和抑制性突触的鉴定与计数方法，并强调了该技术向其他类型组织或培养样本的可转移性。

方案

所有使用小鼠和大鼠的实验均经批准，并依据英国内政部《1986年动物（科学程序）法案》规定的第1类程序进行。人工脑脊液（ACSF）配方见表1。

1. 急性海马脑片制备

  1. 尽快取出小鼠脑组织，使用刮铲和锐利的剪刀剪开颅骨，并将其置于冰浴、通氧（95% O2, 5% CO2）的高蔗糖人工脑脊液（ACSF，约100 mL）中。
  2. 将小鼠脑组织置于培养皿中，用解剖刀去除小脑及一小部分额叶皮层，然后沿脑中线进行半脑切分。
  3. 将两个半脑切面朝下放置，并将每个半脑用胶固定在振动切片机的载物台上。
  4. 对目标区域进行完整切片，厚度为200–300 µm。以海马为例，每个半脑通常可获得3–4片切片。
  5. 使用塑料巴斯德吸管将切片转移至盛有通氧（95% O2, 5% CO2）ACSF的孵育槽中，在34 °C条件下孵育30分钟。
    注意：可在该步骤向孵育槽中添加活性药理学试剂（如重组Dkk1蛋白）对切片进行处理。
  6. 用画笔将切片从孵育槽中取出，放入24孔板中，在室温下用4%多聚甲醛（PFA）/4%蔗糖溶液固定20分钟至1小时。
    警示：PFA具有毒性，操作时应穿戴适当的防护装备。
  7. 用1X PBS缓冲液清洗切片三次，每次10分钟。
    注意：只要将切片保存在4 °C的1X PBS中，本方案可在此处暂停1–2天。

2. 突触标志物的免疫荧光染色

注意：所用所有缓冲液的配方均可在表2中找到。

  1. 用封闭/透化缓冲液替换 PBS表 2) 置于切片孔板中，在室温下孵育 4 - 6 小时。
  2. 在封闭/通透缓冲液中，将抗vGlut1的多克隆豚鼠抗体按1:2,000比例稀释。
    注意：vGlut1 是用于兴奋性突触前终末可视化标记的指标。为鉴定兴奋性突触后突触，可使用抗 PSD-95 的多克隆抗体，并以相同溶液按 1:500 比例稀释。使用最小体积的 300 µL 每个孔中。为确定海马体的解剖位置，可使用能够标记神经元结构的抗体，例如 MAP2 或 Tubulin。优化所选突触标志物（突触前和突触后）各一抗的合适浓度，并用新鲜的封闭/通透缓冲液稀释。
  3. 将切片在一抗溶液中孵育过夜（或1 - 2天），置于 4 °C使用具有剧烈振荡运动的摇床平台。
  4. 用 PBS 清洗切片三次（每次 10 分钟）。
  5. 将适当的二抗用封闭缓冲液按1:500稀释。例如，当使用vGlut1豚鼠抗体时，应使用识别豚鼠组分的二抗例如， 驴抗豚鼠）与特定荧光染料偶联。使用 PSD-95 兔抗体时，应选用可识别兔成分的二抗（例如， 驴抗兔）偶联不同特异性荧光染料。
  6. 将切片在该溶液中于室温孵育 2 - 3 h。孵育过程中需避光，以防二抗因光敏感而降解。
  7. 用 PBS 清洗切片三次（每次 10 分钟）。
  8. 使用画笔小心地从24孔板中取出切片，均匀地放置在预先标记好的玻璃载片上。在每一片切片上滴加一滴封片剂，然后轻轻将玻璃盖玻片覆盖在切片上。避免产生气泡。注意使用足量的封片剂（300-400 µL），因为量不足可能导致切片干燥。
  9. 室温下避光干燥至少1 - 2天。
  10. 将载玻片存放于 4 °C 短期内使用，但长期保存应置于 -20 °C.

3. 共聚焦图像采集与分析

  1. 使用共聚焦激光扫描显微镜成像。
    1. 确定要成像的海马区域（例如， 使用10倍或20倍物镜观察海马CA1区、CA3区（cornu ammonis 1和3）或齿状回（dentate gyrus, DG）。
    2. 切换至40倍或63倍油镜物镜，通过识别连续的神经突和有序的结构来确认切片解剖结构的完整性。使用神经元标记物（如MAP2）作为参考图1A).
    3. 随后，切换至60倍油镜物镜（NA = ~1.3 - 1.4），调节各通道参数以获得最佳信号与对比度。使用高/低对比度选项调节每台激光器的强度，避免任何像素出现饱和。
      注意：这些设置将取决于所使用的显微镜，但可参考显微镜的 材料表 用于激光功率设置的 图2, 图3，以及 图4为获得最佳效果，建议使用 1024 × 1024 像素的分辨率。同一实验的不同条件下，设置应保持一致。如有需要，可额外应用放大功能。
    4. 评估染色均匀的深度，获取至少8个等距（250 nm）层面的图像堆栈。然后从每张切片同一兴趣区域连续采集3组相邻的代表性图像堆栈。
      注意：不同切片的深度可能有所不同，但应始终约为 2 - 5 µm 从切片表面
    5. 每种条件下至少采集3个切片，并从每组处理的6至8只动物中获取数据。
  2. 图像分析。
    注意：使用自动图像分析软件（参见 材料清单）。请注意，某些系统需要许可证，而其他系统则是免费的，例如 ImageJ。所使用的软件必须能够通过考虑成像堆栈的所有层面，对图像进行三维分析。参考 材料清单 有关图像分析所用软件的详细信息（图1).
    1. 使用基于自定义强度阈值的方案来识别所有突触斑点及神经元标记物，这些标记物在软件内经过手动优化和选择[参见 材料表 用于本方案的特定软件]
      注意：软件会识别每种荧光染料的最小和最大强度，并为每个被识别的对象关联相应的强度百分比。需注意，强度百分比将根据所使用的荧光染料及针对突触标志物的抗体而有所不同。
    2. 对于突触标记物，确保使用尺寸过滤器（>0.1µm3 和 <0.8µm3) 在软件中被选中并应用于图像。调整参数以确保所选对象不相互重叠。排除任何过大或过小而不能被视为突触斑点的对象（参见 图2B).
      注意：优化后，同一实验中的所有图像均应用相同的阈值。
    3. 使用软件中选定的优化阈值方案，对单个突触斑点（突触前或突触后）的数量、强度和体积进行定量分析。将斑点数量归一化至成像视野的体积（约 16,928 µm3 在此系统中，将突触斑点的荧光强度归一化至参考神经元标记物的强度。
      注意：突触定义为突触前和突触后标记物的共定位。一旦确定了突触前和突触后斑点的阈值设定方案，软件应将突触斑点的共定位识别为单个平面上至少一个像素的重叠。
      注意：进行统计分析时，需通过 Lilliefors 检验和 χ² 检验分别确认所有样本组是否符合正态性与方差齐性。对于符合正态分布且方差齐性的样本，应采用参数检验方法进行分析，具体方法如下所述。例如，兴奋性突触斑点分析应采用带区组和重复的单因素方差分析（one-way ANOVA）。每个独立实验应视为一个区组；通常包含三个独立实验，每个实验条件下包含 1 - 3 只小鼠。

突触斑点分析；强度阈值设定；测量数据提取；数据表；实验装置。
图1：使用图像分析软件对突触斑点进行分析。（A）强度阈值设定流程的自定义界面截图。以PSD-95为例，所选斑点的体积范围定义为>0.1 µm3 且 <0.8 µm3，并尽可能减少重叠对象。注意，图中所示为单个共聚焦成像层面，以便更清晰地观察突触斑点并准确选择参数。（B）软件分析结果输出界面截图（采用优化后流程进行分析）。图中示例为基于体积的原始突触斑点数量测量值，这些数值随后将导出至电子表格软件中进行进一步处理。请点击此处查看此图的放大版本。

神经组织显微图像；MAP2，vGlut1；突触蛋白分布；荧光分析。
图2：切片质量检查及突触斑点的参数设置。 (A代表性共聚焦图像（40倍物镜）显示感兴趣区域：海马脑片中的CA1辐射层（sr）和锥体层（so），由MAP2染色标记。比例尺 = 2 µm. (B共聚焦图像（60倍物镜，采集软件中额外放大1.3倍），显示海马CA1区辐射层中兴奋性标记物vGlut1（绿色）和PSD-95（红色）的分布。可见清晰的突触前和突触后斑点。斑点尺寸大于 0.8 µm3 被排除在定量分析之外（白色箭头）。比例尺 = 2 µm （C）CA1区辐射层的共聚焦图像（60倍物镜，采集软件额外放大1.3倍），显示兴奋性标记物vGlut1（绿色），样本为经PFA固定的全脑切片的冷冻切片。注意可见较大空洞及不规则、成团状的vGlut1染色。比例尺 = 2 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

结果

突触丢失在阿尔茨海默病（AD）和帕金森病等神经退行性疾病早期即已发生2,11,12。然而，这些缺陷背后的分子机制仍不清楚。Wnt信号通路的缺陷已被证实与AD相关13,14,15,16,17。Wnt是一类分泌型糖蛋白，在突触形成及突触传递调节中发挥关键作用18,19,20,21。近期，我们发现Wnt是成熟神经系统中突触维持的关键调控因子10,22。为了准确研究Wnt信号通路对基因修饰小鼠海马区突触的影响，我们采用脑切片制备结合共聚焦显微镜技术，评估突触数量的变化。我们筛选出结构保存良好的健康脑片（图2A）。此外，对突触 puncta 的选择进行了严格界定，排除了可能代表蛋白聚集物的大尺寸染色结构（图2B）。该标准应用于所有图像，并采用一致的严格分析参数。

我们采用了一种转基因模型系统，在四环素控制下诱导成年小鼠中分泌型Wnt拮抗剂Dkk1的表达（iDkk1）（参见 材料清单)10,22我们证明，在成年海马体中阻断Wnt信号通路会特异性地导致CA1辐射层兴奋性突触的丢失（图3). 图 3A 展示了表达 Dkk1 两周的 iDkk1 小鼠及其相应对照组海马脑片中兴奋性突触前和突触后标志物（分别为 vGlut1 和 PSD-95）的代表性共聚焦图像。我们使用 Volocity 软件对这些图像进行分析，结果显示，在诱导 Dkk1 表达两周后，iDkk1 小鼠海马 CA1 区域中兴奋性突触数量显著减少，该结果通过 vGlut1 与 PSD-95 标记的荧光斑点共定位情况进行量化图3B，*p <0.05；Kruskal-Wallis 检验；每种基因型 6 只小鼠）。在 CA1 区辐射层中，每单位的兴奋性突触斑点数量 1,000 µm3 从对照组小鼠的500个减少到iDkk1小鼠的300个。相比之下，诱导Dkk1表达并不影响抑制性突触的数量（通过突触前和突触后标志物vGAT与gephyrin的共定位来鉴定），如图所示 图4A-B (p >0.05；Kruskal-Wallis 检验；每种基因型 3 只小鼠。

重要的是，我们进行了统计功效分析，以估算获得这些可靠结果所需的适当切片数量和动物数量。使用 R 软件，我们计算得出，在单因素方差分析（ANOVA）中采用区组设计和重复实验时（如步骤 3.2.6 所述），为检测到较大的效应量（f = 0.4）并达到 80% 的置信度（功效 = 0.8），每种条件大约需要 35 个切片（3 张图像 × 3 个切片 × 6 只动物 = 36）。

突触的荧光显微镜图像，vGlut1 和 PSD95 标记物，以及突触计数柱状图。
图3：iDkk1小鼠海马切片中兴奋性突触的丢失。（A）CA1区辐射层的代表性共聚焦图像显示兴奋性突触，通过vGlut1与PSD-95的共定位（白色箭头）进行识别。下图是高倍放大显示的高亮矩形区域。比例尺 = 2 µm。（B）使用材料表中提到的软件对对照组与iDkk1小鼠之间的兴奋性突触百分比进行量化（*p <0.05；Kruskal-Wallis检验；每种基因型6只小鼠）。数据以±标准误（SEM）表示。本图改编自参考文献10。请点击此处查看该图的放大版本。

突触蛋白的免疫荧光显微镜图像；柱状图显示突触抑制结果。
图 4：iDkk1 小鼠海马切片中的抑制性突触未发生变化。（A）通过 vGAT 与 gephyrin 共定位（白色箭头）鉴定的 CA1 辐射层抑制性突触的代表性共聚焦图像。下排图像为高倍放大图，对应于上图中高亮矩形区域。比例尺 = 2 µm。（B）使用 Volocity 软件定量分析对照组与 iDkk1 小鼠之间抑制性突触的百分比（p > 0.05；Kruskal-Wallis 检验；每种基因型 3 只小鼠）。数据以均值 ± 标准误表示。本图改编自参考文献10。请点击此处查看该图的放大版本。

高蔗糖人工脑脊液成分浓度备注
NaCl75 mM
NaHCO325 mM
KCl2.5 mM
NaH2PO4, 2H2O1.25 mM
犬尿酸1.25 mM
丙酮酸2 mM
EDTA0.1 mM
CaCl21 mM溶液氧合后加入
MgCl24 mM溶液氧合后加入
D-葡萄糖25 mM
蔗糖100 mM
浸没式切片记录室人工脑脊液成分
NaCl125 mM
NaHCO325 mM
KCl2.5 mM
NaH2PO4, 2H2O1.25 mM
CaCl21 mM溶液氧合后加入
MgCl21 mM溶液氧合后加入
D-葡萄糖25 mM

表1：ACSF成分。

封闭/透化缓冲液浓度备注
驴血清10%
Triton-X0.50%
PBS1x
10x PBS调至 pH 7.4
NaCl1.37 M
KCl27 mM
NaH2PO4100 mM
KH2PO418 mM
4% PFA/4% 蔗糖调至 pH 7.4
PBS1x从 10x 稀释
PFA1.33 M
蔗糖117 mM

表2：免疫荧光染色所用缓冲液。

讨论

对突触数量的精确定量在神经科学领域至关重要。本文以海马脑片CA1区辐射层为模型系统，介绍如何评估该区域突触的密度。我们近期发表的研究论文探讨了海马区Wnt缺乏的影响，并采用单层电镜技术对突触数量进行了定量分析，从而展示了本方法相对于现有技术的优势10。单层电镜与本文所述脑片方法所测得的突触丢失程度相似10，表明该技术具有较高的准确性和可靠性。

重要的是，如本文所述，单切片电镜和免疫染色突触分析方法均存在一个局限性，即无法准确估算特定脑区的绝对突触数量。事实上，识别任何全局性的形态学变化非常重要，因为总体积的变化可能影响突触数量。另一个局限性在于，某些抗体对完整脑区的染色效率较低，部分原因在于突触连接的密度极高。我们发现，与直接将整个脑组织用多聚甲醛（PFA）立即固定相比，采用本实验中的脑片制备方法并在后续使用PFA固定不超过1小时，可获得更高质量的vGlut1和gephyrin染色效果（图2C）。后者常导致突触染色呈聚集状，并在组织中出现空洞。尽管如此，两种方法中vGlut1抗体的渗透深度仍然受限（仅数十微米）。即使延长抗体孵育时间，我们也未能完全克服这一限制；但只要抗体渗透深度超过成像的总深度，就不会影响最终结果。此外，应特别注意确保在整个采集的图像堆栈中染色均匀一致。

在本研究中，我们希望区分兴奋性突触与抑制性突触。因此，我们分别选用vGlut1/PSD-95和vGAT/gephyrin作为标记物，因为这些蛋白在成年小鼠海马中高表达，并且特异性地存在于各自的突触亚型中4,5。其他兴奋性和抑制性突触标志物也可用于识别相应的突触类型，例如在各类突触中富集的受体，包括兴奋性突触中的NMDA受体和AMPA受体，以及抑制性突触中的GABAA受体。此外，只要存在特异性抗体，我们的实验方案也可用于鉴定其他神经递质或神经调质，如在纹状体中多巴胺能突触的检测所示22。另外，将每片切片的厚度减少至120 µm，可在一定程度上缓解急性脑片取材时样本量较少的问题，这对于研究杏仁核等较小脑区的研究尤为重要。

本方案的未来应用可拓展至不同脑区及相关疾病的研究。例如，在与帕金森病相关的脑区——纹状体中，可分别使用vGlut2/PSD-95或vGlut1/PSD-95组合，以区分来自皮层或丘脑传入纤维的兴奋性突触22。

综上所述，我们展示了一种利用突触前和突触后标记物来定义突触，从而检测脑组织中突触数量的可靠方法。关键步骤包括制备高质量的海马切片、使用PFA固定不超过1小时、加入足量的封片介质、使用可靠的抗体、设置适当的图像采集参数，以及严格地识别突触 puncta。最终，该方法相对快速，且任何具备共聚焦显微镜的实验室均可轻松重复此方法。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了英国医学研究理事会（MRC）、欧盟第七框架计划（EU FP7）、阿尔茨海默病研究英国中心（ARUK）、惠康信托基金（Wellcome Trust）以及帕金森病英国基金会（Parkinson's UK）的支持。我们还要感谢 Johanna Buchler 女士提供共聚焦图像，以及实验室成员对本文稿和研究方法提出的建设性意见。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
振动切片机LeicaVT1000S
一抗MilliporeAB5905vGlut1 (1:2000)
一抗Thermo ScientificMA1-046PSD-95 (1:500)
一抗Synaptic Systems131 004vGAT (1:500)
一抗Synaptic Systems147011Gephyrin (1:500)
一抗Abcamab5392MAP2 (1:10000)
二抗Jackson Laboratories706-545-148驴抗豚鼠 Alexa Fluor 488 (1:600)
二抗Abcamab175470驴抗兔 Alexa Fluor 568 (1:600)
封片剂SouthernBiotech00-4958-02Fluoromount-G
共聚焦显微镜OlympusNA使用60倍、数值孔径（NA）为1.35的油镜在FV1000共聚焦显微镜上成像。检测vGlut1时，使用488 nm激光，功率设为14%；检测PSD-95时，使用559 nm激光，功率设为20%。
分析软件PerkinElmerNAVolocity
手术刀Swann-Morton20311号刀片
超级胶水Loctite1446875
95% O2, 5% CO2BOCNA气瓶
24孔板Corning3524
载玻片Thermo710708-1.0 mm 厚
培养皿Corning430167
iDkk1 小鼠N/AN/A通过将 tetO Dkk1 转基因小鼠与 CaMKIIα rtTA2 转基因小鼠杂交获得。tetO Dkk1 转基因小鼠与 CaMKIIα rtTA2 小鼠均以杂合子状态进行杂交。两个小鼠品系均在 C57BL/6J 背景下繁育。单转基因小鼠及野生型同窝仔鼠作为对照。
名称公司目录编号备注
溶液配制试剂：
NaClSigmaV800372
KClSigmaP9333
Na2HPO4Sigma255793
KH2PO4SigmaP9791
Ca2ClSigma223506
Mg2ClSigmaM9272
NaH2PO4Sigma71505
犬尿酸SigmaK3375
NaHCO3SigmaS5761
丙酮酸Sigma107360
EDTASigmaE6758
D-葡萄糖SigmaG5767
蔗糖SigmaS8501
Triton-XSigmaT8787
驴血清MilliporeS30-100ml
PFASigmaP6148

参考文献

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海马体啮齿类动物脑切片中突触密度的评估
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