Представлен подробный протокол мыши модели для энтерогеморрагические E. coli (EHEC) колонизации с помощью биолюминесценции меченых бактерий. Обнаружение этих биолюминесцентных бактерий неинвазивные в vivo imaging системы в живых животных можно заранее нашего нынешнего понимания особенностей ЭГКП колонизации.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение энтерогеморрагические Escherichia Coli колонизации в мышиных принимающей системой неинвазивные в Vivo биолюминесценции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Энтерогеморрагические E. coli (EHEC) O157: H7, который является пищевых патогенов, causesdiarrhea, геморрагический колит (СС), и гемолитический уремический синдром (ГУС), колонизации кишечного тракта человека. Чтобы изучить подробные механизм ЭГКП колонизации в естественных условиях, важно иметь животных моделей для мониторинга и количественной оценки ЭГКП колонизации. Мы демонстрируем здесь модель колонизации мыши-инфекции ЭГКП, превращая биолюминесцентных выражая плазмиды к инфекции ЭГКП для мониторинга и количественной оценки ЭГКП колонизации в жизни хозяев. Животные привиты с помечены биолюминесценция ЭГКП Показать интенсивной биолюминесцентных сигналов в мышей обнаружения с неинвазивные в vivo imaging системы. После того, как 1 и 2 дней после инфицирования, биолюминесцентных сигналы могут по-прежнему быть обнаружены в зараженных животных, который свидетельствует о том, что ЭГКП колонизировать в hosts для по крайней мере 2 дней. Мы также продемонстрировать, что эти биолюминесцентных ЭГКП locate для мыши кишечника, особенно в слепой кишки и толстой кишки, от ex vivo изображений. Эта модель колонизации мыши ЭГКП может служить в качестве инструмента для продвижения текущий набор знаний о механизме колонизации ЭГКП.
Введение
EHEC O157: H7 является возбудителя, который вызывает понос1, HS2, Гус3и4 даже острая почечная недостаточность через загрязненной воды или пищи. ЭГКП является патогенным enterobacterium и колонизирует желудочно-кишечного тракта человека1. Когда впервые ЭГКП придерживаться принимающей кишечного эпителия, они впрыскивают факторов колонизации в клетки хозяина через систему секреции типа III (T3SS), которая функционирует как молекулярные шприц вызывая присоединения и их стирания (A/E) поражения впоследствии для обеспечения адгезия (колонизация)
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Предупреждение: EHEC O157: H7 представляет собой биобезопасности уровня 2 (BSL-2) возбудителя по данным центров по контролю над заболеваниями и профилактике (CDC) Инструкция по биобезопасности (https://www.cdc.gov/). Таким образом должны выполняться все экспериментальные процедуры с участием ЭГКП в объекте BSL-2. Носите пальто лаборатории и перчатки при выполнении эксперимента. Работа в сертифицированных биобезопасности кабинета (BSC). Продезинфицируйте экспериментальный стенд до и после экспериментальной процедуры с 70% этиловом спирте. Все инструменты или оборудование, что контакт (или потенциально контакта) ЭГКП должен быть вылечен с 70% этанол или отбеливатель. За....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы ведении помечены биолюминесценция ЭГКП (~ 109 бактериальной клетки) для 6 - неделю старых самок мышей C57BL/6 пероральная затравка. После устного прививка ЭГКП мышам в течение 1 ч животные были рассмотрены биолюминесцентных сигнала система электронного фотографирования в естественных условиях как показано на рисунке 7. Результаты показали сильный сигнал биолюминесцентных затравки мышей с помечены биолюминесценция ЭГКП. Мы изучили сигнал.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Сообщается, что ЭГКП преобразована с Люцифераза плазмида была использована для изучения его локализации в hosts или выражение гена в vivo8,,1112. Для обнаружения инфекции ЭГКП колонизировали сроков и локализации в мышиных хост8поступили также мышиных модели продемонстрировали здесь. Тем не менее мы предоставляем детали протокола как управлять ЭГКП прививка для мышей intragastrically и как подгото.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Мы признаем Чи-Чун Чен из департамента медицинских исследований, Chi Mei медицинский центр (Тайнань, Тайвань) за помощь в мыши, инфекции, а также поддержку от лабораторных животных центра национального университета Cheng Kung. Эта работа поддерживается министра науки и технологии (большинство) предоставляет CC (наиболее 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006--011,-005 and106-2321-B-006).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Шейкер | инкубатор YIH DER | LM-570R | инкубации бактерий |
| Орбитальный встряхивающий инкубатор | FIRSTEK | S300 | для инкубации бактерий |
| pBSL180 | источник гена nptII | ||
| pAKlux2 | источник luxCDABE operon | ||
| T& Набор для клонирования | Yeastern Biotech | FYC001-20P | для клонирования ТА |
| Nsi I | NEB | R0127S | использование для клонирования плазмид |
| Sca I | NEB | R0122S | использовать для клонирования плазмид |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | использование для клонирования плазмид |
| Sma I | NEB | R0141S | использование для клонирования плазмид |
| Использование Т4-лигазы | NEB | M0202S | для клонирования плазмид |
| Ex Taq | TaKaRa | RR001A | использование для амплификации ПЦР |
| 10X Ex Taq Буфер | TaKaRa | RR001A | использование для амплификации ПЦР |
| dNTP Mix | TaKaRa | RR001A | использование для ПЦР амплификации |
| ПЦР машинное | применение Biosystem | 2720 Термоамплификатор | для амплификации ПЦР |
| Глицерин | SIGMA | G5516-1L | использовать для хранения бактерий |
| раствор NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | химикат для приготовления LB среды, 10 г/л |
| Триптон | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | химикат для приготовления LB среды, 10 г/л |
| Порошок дрожжевого экстракта | Affymetrix | 23547-1 KG | химикат для приготовления LB среды, 5 г/л |
| Агар | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | химикат для производства LB агара |
| канамицина | Сигма | К4000-5G | антибиотики, применение для сесецитона |
| стрептомицина | Антибиотики | Sigma S6501-100G | , устраняют микробиоту у мышей |
| компетентная клетка Домашний | находится в дополнительном документе; | ||
| Электропоратор | MicroPulser | для электропорации | |
| Кюветы для электропорации | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | для электропорации |
| Высокоскоростная центрифуга | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | использование для центрифугирования бактерий |
| Ротор с фиксированным углом | Beckman Coulter | JA25.5 | для центрифугирования бактерий |
| Ротор с фиксированным углом наклона | Beckman Coulter | JLA10.5 | используется для центрифугирования бактерий |
| центрифугные бутылки | Beckman Coulter | REF357003 | использования для центрифугирования бактерий |
| центрифуга флаконы | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | использование для центрифугирования бактерий |
| Eppendorf Biophotometer Plus | eppendorf | AG 22331 hamburg | для измерения значения OD600 у |
| бактерий мышей C57BL/6 | Центр лабораторных животных НЦКУ | ||
| лабораторный халат, перчатки | для защиты персонала | ||
| изофлуран | Панион и Панион BF Biotech Inc. | G-8669 | для мышиной анестезии, фармацевтический |
| шприц 1 мл | использование для орального зондирования мышей | ||
| Многоразовая игла для кормления 22 г с шариковым наконечником | 0,9 мм X Д 50 мм | использование для орального зондирования мышей | |
| хирургические ножницы | использование для эксперимента на мышах | ||
| Xenogen IVIS 200 imaging system | Perkin Elmer | IVIS использование спектра | для захвата биолюминесцентных изображений |
| Программное обеспечение Living Image для | Perkin Elmer | версии 4.1 | используется для количественной оценки данных изображения |
Ссылки
- Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
- Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
- Tarr, P. I., Gord....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
