Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출
이 논문에서
요약
초록
Enterohemorrhagic E. 대장균 (EHEC) O157:H7는 foodborne 병원 체는 causesdiarrhea, 출혈 성 대 장 염 (HS), 그리고 hemolytic 신부전 증후군 (HUS), 인간의 창 자 장관에 식민지. EHEC 식민 vivo에서 의 상세한 메커니즘 연구를 모니터링 하 고 계량 EHEC 식민 동물 모델에 필수적 이다. 여기 모니터링 하 고 계량 EHEC 식민지 생활 호스트에서 EHEC에 발광 표현 플라스 미드를 변형 하 여 마우스 EHEC 식민 모델을 설명 합니다. 동물 생물 발광 표시 EHEC로 주사는 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템으로 탐지 하 여 쥐에서 강렬한 발광 신호를 보여줍니다. 후 1, 2 일 게시 감염, 발광 신호 수 여전히 감지할 수 감염 된 동물에서 EHEC 호스트에 적어도 2 일 동안 식민지 건의 하. 우리는 또한 이러한 발광 EHEC ex vivo 이미지에서 맹에 콜론, 특히 마우스 소장을 찾아 보여줍니다. 이 마우스 EHEC 식민 모델 EHEC 식민 메커니즘의 현재 정보를 도구 될 수 있습니다.
서론
EHEC O157:H7 설사1, HS2에서3, 오염 된 물 이나 음식을 통해도 급성 신부전4 원인 병원 체 이다. EHEC 병원 성 enterobacterium 이며 인간1의 위장을 colonizes. EHEC 먼저 호스트 창 자 상피 준수 때 그들은 유형 III 분 비 시스템 (T3SS) 분자 주사기는 연결을 유도 하 고 적용을 이후에 병 변 (A/E) effacing 역할을 통해 호스트 세포에 주입 식민 요인 접착 (식민)5. 이 유전자는 A/E 병 변 형성에 관여 enterocyte 항목 (리) pathogenicity 섬5의 소재 시로 인코딩됩니다.
생물 발광은 빛 생산 화학 반응, 어떤 luciferase catalyzes 보이는 빛6를 생성 하는 기판 소. 이 효소 과정은 종종 산소 또는 아데노신 3 인산 염 (ATP)6의 존재를 필요로 한다. 생물 발....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
주의: EHEC O157:H7는 biosafety 수준 2 (BSL-2) 병원 체 질병 통제 및 예방 (CDC) biosafety 지시 (https://www.cdc.gov/)를 위한 센터에 따르면. 따라서, 모든 실험 절차 관련 된 EHEC BSL-2 시설에서 수행 되어야 합니다. 실험을 수행 하는 동안 실험실 코트와 장갑 착용. 인증된 biosafety 내각 (BSC)에서 작동 합니다. 70% 에탄올과 실험 절차 전후 실험 벤치를 소독. 모든 악기 또는 장비 연락처 (또는 잠재적으로 연락처) EHEC 70% 에탄올 이나 표 백제로 소독 되어야 한다. 신중 하 게 오염 된 (또는 잠재적으로 오염 된) 폐기물은 밀봉 하 고 압력가 이어야 한다. 필요한 경우 마스크, 눈 보호, 이중 장갑 또는 죄수 복을 착용. 6 주 된 C57BL/6 여성 마우스 구입 하 고 실험실 동물 센터의 국립 쳉 쿵 대학 (NCKU)에서 유지 했다. 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회 NCKU (승인 번호 104-039)에 의해 승인 되었다.
1. Bioluciferase 표시 된 EHEC 박테리아 생성
- 믹스 50 ng deoxyribonucleic 산 (DNA), 1 μ 각 10 μ M의 앞으로 반전 뇌관, 2 μ 2.5 m m deoxynu....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
우리는 생물 발광 표시 EHEC 관리 (~ 109 세균성 세포) 구강에 의해 6 주 오래 된 여성 C57BL/6 마우스. 1 시간 이내 쥐 EHEC의 구두 접종 후 동물 vivo에서 이미징 시스템 그림 7과 같이 발광 신호 위해 시험 되었다. 결과 생물 발광 표시 EHEC와 gavage 쥐에서 강한 발광 신호를 보여주었다. 우리는 2 일 게시물 감염에 신호를 검사합니다. 그림 8A같이 쥐 2 일 EHEC는 2 일에 의해 호스트에 식민지 제안 감염 게시 후에 강렬한 발광 신호를 보여 야생-타입 EHEC EDL933 생물 발광 표시와 주사. 우리는 또한 intragastrically 생물 발광 표시 된 EDL933ΔrfaD (ΔrfaD) 쥐 (그림 8A) 감염. 이.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
그것은 알려졌다 EHEC luciferase 플라스 미드와 변환 호스트 또는 유전자 식 vivo에서8,,1112에 그것의 지역화를 검사 활용 되었습니다. 여기 시연 murine 모델 또한 murine 호스트8에서 EHEC 식민지 시기와 지역화를 검색 하기 위해 보고 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 intragastrically 마우스 EHEC 접종을 관리 하는 방법과 구강에 대 한 발광 박테리아를 신중 하 게 준비 하는 방법의 세부 프로토콜을 제공 합니다. 특히,는 마우스 구강 EHEC (단계 3.7)의에 대 한 마우스 헤드의 위치 때 중요 gavage 바늘 삽입 됩니다. 위치 수직 하지 않으면 그것은 바늘을 통과 하기 어려울 것입니다 그리고 그것은 아마도 마우스를 다칠 수 있습니다. 3.8 단계에.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 없다.
감사의 글
우리는 인정 하는 치 정 첸에서 학과의 의료 연구, 치 매 의료 센터 (타이난, 대만), 감염 및 국립 쳉 쿵 대학 실험실 동물 센터에서 지원에 마우스에 도움. 이 작품은 과학의 성직자에 의해 지원 하 고 기술 (대부분) CC를 (가장 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005)를 부여 합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 셰이커 인큐베이터 | YIH DER | LM-570R | 박테리아 인큐베이션 |
| 안와 진탕 인큐베이터 | FIRSTEK | S300 | 박테리아 인큐베이션 |
| pBSL180 | nptII 유전자 | ||
| pAKlux2 | luxCDABE 오페론 | ||
| T& 복제 키트 | Yeastern Biotech | FYC001-20P | TA 복제에 사용 |
| Nsi I | NEB | R0127S | 플라스미드 클로닝에 사용 |
| Sca I | NEB | R0122S | 플라스미드 클로닝에 사용 |
| Spe I-HF | NEB | R0133S | 플라스미드 클로닝에 사용 |
| Sma 나는 | 플라 | 스미드 클로닝에 NEB | R0141S |
| 플라스미드 클로닝에 T4 | 리가제 | NEB | M0202S |
| Ex | Taq TaKaRa | RR001A | PCR 증폭 사용 |
| 10X Ex Taq 버퍼 | TaKaRa | RR001A | PCR 증폭 |
| dNTP 혼합물 사용 | TaKaRa | RR001A | 는 PCR 증폭 |
| PCR 기계에 | 사용됩니다. Biosystem을 적용했습니다. | 2720 써멀 사이클러 | PCR 증폭용 |
| 글리세롤 | SIGMA | G5516-1L | 박테리아 스타킹 용액 |
| NaCl | Sigma | 31434-5KG-R | LB 매체 제조용 화학품, 10g/L |
| 트립톤 | CONDA pronadisa | Cat 1612.00 | LB 배지 제조용 화학품, 10g/L |
| 효모 추출물 분말 | Affymetrix | 23547-1 KG | LB 배지 제조용 화학품, 5g/L |
| Agar | CONDA pronadisa | Cat 1802.00 | LB 한천 카나마이신을 만들기 위한 화학물질 |
| Sigma | K4000-5G | 항생제, 셀렉시톤 | |
| 스트렙토마이신에 사용 | Sigma | S6501-100G | 항생제, 쥐의 미생물군 제거 |
| EDL933 유능한 세포 | 집에서 만든 | 방법은 보충 문서에 있습니다 | |
| Electroporator | MicroPulser | for electroporation | |
| Electroporation Cuvettes | Gene Pulser/MicroPulser | 1652086 | for electroporation |
| 고속 원심분리기 | Beckman Coulter | Avanti, J-26S XP | use for centrifuging bacteria |
| 고정 각도 로터 | Beckman Coulter | JA25.5 | 박테리아를 원심분리하는 데 사용됩니다 |
| 고정 각도 로터 | Beckman Coulter | JLA10.5 | 박테리아를 원심분리하는 데 사용됩니다 |
| 원심분리기 병 | Beckman Coulter | REF357003 | 박테리아 원심분리에 사용 |
| 원심분리기 병 | Thermo Fisher scientific | 3141-0500 | 세균 원심분리에 사용 |
| Eppendorf BioPhotometer Plus | Eppendorf | AG 22331 함부르크 | 의 OD600 값을 측정하기 위한 |
| NCKU | |||
| 실험실 코트의 실험실 동물 센터, | 개인 보호용 장갑 | ||
| 이소플루란 | 파니온 & BF 생명 공학 Inc. | G-8669 | 마우스 마취용, 제약 등급 |
| 1ml 주사기 | 마우스의 구강 간을 위한 사용 | ||
| 재사용 가능한 22 G 볼 팁 먹이 바늘 | & 파이; 0.9 mm X L 50 mm | 마우스 구강 위장에 사용 | |
| 가위 | 생쥐 실험에 사용 | ||
| Xenogen IVIS 200 이미징 시스템 | Perkin Elmer | IVIS 스펙트럼 | 생물 발광 이미지 캡처에 사용 |
| 데이터를 정량화하는 데 | Living Image Software | Perkin Elmer | 버전 4.1 |
참고문헌
- Pennington, H. Escherichia coli O157. Lancet. 376 (9750), 1428-1435 (2010).
- Mayer, C. L., Leibowitz, C. S., Kurosawa, S., Stearns-Kurosawa, D. J. Shiga toxins and the pathophysiology of hemolytic uremic syndrome in humans and animals. Toxins (Basel). 4 (11), 1261-1287 (2012).
- Tarr, P. I., Gord....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
