Method Article

在体内小鼠激光诱导脉络膜新生血管模型的多模态成像与分析

DOI:

10.3791/56173

⸱

January 21st, 2018

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1Experimentica Ltd., 2Leica Microsystems, 3Spective LLC, 4Department of Ophthalmology, Stritch School of Medicine, Loyola University Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里, 我们介绍了纵向的在体内成像在激光诱导的小鼠脉络膜新生血管形态学变化中的作用。

Abstract

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激光诱导脉络膜新生血管 (CNV) 是模拟年龄相关性黄斑变性 (AMD) 的湿型的一个良好建立的模型。在本议定书中, 我们的目标是引导读者不只是通过技术考虑产生激光诱导的损害, 以触发新生血管的过程, 而是侧重于强大的信息, 可以获得从多式联运纵向在体内的整个随访期内的成像。

激光诱导的小鼠 CNV 模型是由二极管激光管理产生的。多模态在体内成像技术被用来监测 CNV 的诱导, 进展和回归。首先, 在激光后立即进行光谱域光学相干层析成像 (SD OCT) 来验证赫膜的断裂。随后使用荧光素血管造影 (FA) 进行的活体成像证实了赫膜从脉络膜水平获得的序列图像的成功损伤。CNV 增殖和回归的纵向后续在天 5, 10 和14以后使用了 SD OCT 和 FA 激光执行。提出了从 FA 图像中 CNV leasions 的简单可靠的分级方法。自动分割的测量总视网膜厚度, 结合手动口径应用测量视网膜厚度的 CNV 地点, 允许无偏见的评价存在水肿。最后, 利用 isolectin GS-IB4 染色对脉络膜 flatmounts 进行了 CNV 的组织学验证。染色是值, isolectin 阳性面积计算 ImageJ。

该协议特别适用于需要高通量样的 CNV 病理筛查的治疗研究, 因为它可以快速、多式、可靠地分类 CNV 病理和视网膜水肿。此外, 高分辨率 SD OCT 可以记录其他病理特征, 如视网膜或 intraretinal 液的积累。但是, 此方法不提供从 SD OCT 图像中自动进行 CNV 卷分析的可能性, 必须手动执行。

Introduction

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第一次成功的尝试模仿人类 CNV 在啮齿目动物的病理证实了近三年前与氪激光在长埃文斯鼠1。此后, 氪激光被用来打破赫的细胞膜在最流行的鼠标应变, C57BL/6J2,3,4。用 FA 和组织学染色验证了 CNV 诱导的成功率。快速发展的无创成像模式, 如 OCT, 促进了啮齿动物的临床前模型领域的增长。在同一眼的多个时间点, 监测视网膜形态变化的能力大大降低了动物的使用, 提高了实验研究的效率。组织学评价 CNV 病变是相当直接的, 并要求标签的异常血管生长周围的激光管理, 图像采集, 和面积/体积估计使用图像分析软件。相比之下,在体内成像模式引入了对 CNV 病理及其解释的更复杂的分析。

在这里, 我们提出了一个简单的和相对快速的方法来评分的诱导, 进展, 和回归的 CNV 使用 FA, SD OCT, 和自动分割方法的小鼠激光诱导 CNV 模型。

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Protocol

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所有的动物都是按照帕特声明, 为使用动物在眼科和视力研究和欧共体指令 86/609/EEC 动物实验, 使用的协议批准和监测的动物实验委员会芬兰。

1. 激光诱导小鼠 CNV 模型5

  1. 从宏观上检查动物的眼睛是否有异常。
  2. 称量鼠标。
  3. 计算和准备适当数量的麻醉剂使用, 根据动物的重量,例如medetomidine (1 毫克/千克), 氯胺酮 (75 毫克/千克) 和蒸馏水 (0.9% NaCl 溶液) 的比例为 1:1. 5:2. 5, 或氯胺酮 (40-75 毫克/千克),嗪 (5 毫克/千克), 蒸馏水 (0.9% 氯化钠溶液) 的比率为 1:2. 5:1;对于20克老鼠, 注入0.1 毫升的混合物。
  4. 注射麻醉腹腔。
  5. 把老鼠放回笼子里, 等到动物被麻醉。确认鼠标没有踏板反射就能正确麻醉。
  6. 确保使用激光安全个人防护设备。
  7. 打开一个狭缝灯和 532 nm 二极管激光器。
  8. 将鼠标从笼子里取出, 放在暖气垫上。
  9. 应用一滴卡进行瞳孔扩张。等待3-5 分钟的全 (3 毫米) 瞳孔扩张。
  10. 将鼠标放在狭缝灯的舞台上。
  11. 将一滴眼科液体凝胶放在片上, 扁平角膜。
  12. 用中心的视神经头定位鼠标的眼睛....

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Results

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激光后立即出现气泡或视网膜出血并不总是可见的。因此, SD OCT 对于验证赫膜的损伤尤为重要。图 1显示了激光管理后在不同时间点的 OCT 成像的示例。

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图 1: 眼睛眼底的 OCT (VIP 图像) 显示在白色、绿色和红色圆圈中勾勒出的三激光区域.OCT B 扫描图像之前采取的激光 (基线), 立即激光后, 以验证赫的膜断裂 (0 天, 箭头点的损害网站), 和 5, 10 和14天后, 激光管理。从白色 (第一排图像) 中所勾画的区域可以看出, CNV 在以后的 timepoints 中没有发展。在绿色和红色概述的区域开发了 CN.......

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Discussion

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多模态成像为 CNV 病理评价提供了有价值的工具。在这里, 我们提出了一个成像协议, 包括 FA, SD OCT, 自动分割的快速, 重现性, 可靠的评价 CNV 病理。经激光管理后, 赫膜断裂。此外, 在这个阶段使用 SD OCT 也可以立即可视化可能的 intraretinal 和视网膜出血, 这可能混淆结果的解释。根据 FA 图像的荧光素信号对视网膜渗漏进行分级。使用 SD OCT 提供了更详细的描述 CNV 病理。此外, 纵向 SD OCT 分析在不同的时间点在整个随访期强调的时间差异的病理, 将仍然难以捉摸, 如果依赖于 FA 单独。

用自动分割法测量视网膜总厚度。人工测量 CNV 诱导的视网膜厚度。对脉络膜 flatmount 的组织学评价进行了验证, 用图像分析软件图像 J 对新生血管面积进行了测量。

可视轴的正确透明度对于所提出的协议的成功执行至关重要。角膜干燥和白内障的形成是诊断的主要因素。因此, 一旦鼠标被麻醉, 眼睛应该不断水合与人工泪液或凝胶保持适当的角膜水化。建议的协议应在10分钟内优先进行麻醉诱导。.......

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Disclosures

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作者 Symantas Ragauskas, 博士是 Experimentica Ltd. 的一名雇员 (研究科学家) 和股东, 提供合同研究服务, 采用了本文所用的临床前 CNV 模型。

作者 Eva Kielczewski 是一个员工 (研究应用工程师, oct) 的徕卡系统, 生产的 SD oct 在本文中使用。

作者约瑟夫万斯是一个雇员 (NA oct 销售总监) 的徕卡微系统, 生产的 SD oct 体系在本文中使用。约瑟夫. 万斯也是 Spective 的总裁兼董事总经理。

作者西蒙卡洛特尼斯卡娅博士是 Experimentica Ltd. 的顾问首席科学官和股东, 这是一家提供合同研究服务的临床前合同研究机构, incl. 了本文所用的临床前 CNV 模型。西蒙卡洛特尼斯卡娅, 博士也是 & p 科学, LLC, 生命科学咨询公司的首席执行官, 并担任 Dr. 约翰 p 和苔蕾丝 e. 马尔卡希在 Stritch 医学院芝加哥大学的眼科教授。这项安排的条款已根据其利益冲突政策, 由美国芝加哥大学学院审查和批准。

作者 Giedrius Kalesnykas, 博士是 Experimentica Ltd. 的一名雇员 (CEO) 和股东, 提供合同研究服务, 采用本文所用的前 CNV 模型。

Acknowledgements

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作者要感谢 Yuliya Naumchuk (芝加哥大学) 和 Agne žiniauskaitė (Experimentica Ltd.) 的优秀技术和录像支持。Dr. 卡洛特尼斯卡娅的研究项目是由 Dr. 的约翰 P 和苔蕾丝马尔卡希在美国芝加哥大学的眼科教授的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
美托咪定（商品名 Domitor）OrionVnr 01 56 02麻醉
氯胺酮介入剂Vnr 51 14 85麻醉
0,9% NaClB Braun357 0340麻醉
甲苯噻嗪（商品名 Rompun vet）拜耳vnr 14 89 99麻醉
托吡卡胺SantenVnr 04 12 36散瞳剂
ViscotearsAlconVnr 44 54 81润滑剂
SystaneAlcon -润滑剂
5% 荧光素钠盐Sigma AldrichF6377-100G荧光剂
阿替美唑（商品名 Antisedan）OrionVnr 47 19 53麻醉

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dobi, E. T., Puliafito, C. A., Destro, M. A new model of experimental choroidal neovascularization in the rat. Arch. Ophthalmol. Chic. Ill 1960. 107, 264-269 (1989).
  2. Tobe, T., et al. Evoluti....

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Laser Induced Choroidal NeovascularizationIn Vivo ImagingSpectral Domain OCTFluorescein AngiographyRetinal Thickness MeasurementAutomated SegmentationHistological VerificationBruch s Membrane DamageCNV Pathology ClassificationMouse CNV Model

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