本文展示了一种基于流式细胞术的定量测定人类自然杀伤细胞细胞毒活性的方法。
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摘要
摘要
在先天免疫系统中，一类称为自然杀伤（NK）细胞的效应淋巴细胞在宿主防御异常细胞方面发挥着关键作用，尤其能够清除肿瘤细胞和病毒感染细胞。目前已知约有30种单基因缺陷以及其他多种病理状态会导致功能性或典型性NK细胞缺乏症，表现为细胞毒活性降低或缺失。传统上，细胞毒性的研究依赖放射性方法，这类方法操作繁琐、成本高昂且存在潜在危害。本文介绍一种简化、适用于临床的基于流式细胞术的定量检测NK细胞细胞毒活性的方法。在该实验中，将外周血单个核细胞（PBMCs）或纯化的NK细胞样本以不同比例与对NK细胞介导的细胞毒性（NKCC）敏感的靶肿瘤细胞系共同孵育。靶细胞预先用荧光染料标记，以便将其与效应细胞（NK细胞）区分开来。孵育结束后，通过核酸染色剂识别被杀伤的靶细胞，该染色剂可特异性穿透死亡细胞。该方法既可用于诊断，也可用于科研，并且得益于流式细胞术的多参数检测能力，还可进一步深入分析NK细胞的表型与功能。
引言
自然杀伤（NK）细胞是一类复杂的人类先天性淋巴细胞亚群，在清除病毒感染细胞、转化细胞及其他病理性威胁中发挥关键作用1,2。NK细胞的溶细胞性颗粒中含有穿孔素和颗粒酶等细胞毒性蛋白。激活后，NK细胞与其靶细胞形成一种称为免疫突触的复杂相互作用，从而局部释放这些溶细胞分子，导致靶细胞直接发生裂解和凋亡，同时伴随细胞因子和趋化因子的释放，最终诱导炎症状态的产生1,3,4。
NK细胞的活化涉及NK细胞受体与靶细胞表面配体之间一系列复杂的激活性和抑制性相互作用，构成一个高度调控的系统。其中被研究得最为深入的NK细胞活化机制之一是"缺失自我"。事实上，当感染细胞或转化细胞表面缺乏主要组织相容性复合体I类（MHC）分子，即人类白细胞抗原（HLA）分子时，会触发NK细胞的细胞毒性作用。肿瘤细胞和病毒感染细胞通常会下调这些抗原的表达，以逃避免疫系统中T细胞介导的免疫应答，因而成为NK细胞的主要攻击目标1,3,
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方案
样本采集遵循加州大学洛杉矶分校人类研究保护项目制定的伦理指南，并经机构审查委员会（IRB）批准。
1. 试剂的准备
注意：除非另有说明，所有试剂在使用前应于室温下平衡。所有试剂必须保持无菌。
- 使用 p20 移液器将 10 µL Tween-20 溶液加入 5 mL 不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制 2 倍工作浓度的 Tween-20 溶液（即 0.2%）。
- 由于 Tween-20 黏度较高，为确保准确性，请采取以下步骤：缓慢吸取以避免产生气泡，不要将吸头完全浸入液体中以防止交叉污染，并在 PBS 中反复吹打数次，以彻底清洗吸头内的 Tween-20。
- 将 2 µL IL-2 原液（2.1E6 IU/mL）加入 198 µL 完全培养基（即 1:100 稀释），该完全培养基为含 1% 青霉素-链霉素和 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基，随后再进行一次 1:100 稀释，即将 2 µL IL-2 中间稀释液加入 198 µL 完全培养基中，配制 7 倍工作浓度溶液（210 IU/mL）。
- 将 2 µL CFSE 原液（5 mM）加入 500 µL 基础培养基（RPMI）中。充分涡旋混匀，短暂离心以去除管盖内液滴，随后再进行一次 1:20 稀释，即将 50....
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结果
在建立检测之前，强烈建议评估所选效应细胞群体中的自然杀伤细胞含量。 图1 显示NK细胞富集前（浅蓝色）和富集后（红色）典型的CD56染色结果。NK细胞在PBMCs中占比可达15%，富集后纯度应至少达到80%。
本实验中的流式细胞术分析涉及两个参数的检测：CFSE（可在与 FITC 相同的通道中检测）和死细胞染料（可在与 APC 相同的通道中检测）（图 2A、B）。数据采集后，采用 图 2 中的设门策略分析数据。将死亡（即死细胞染料阳性）的 K562 靶细胞从 CFSE 阳性群体中排除，从而获得靶细胞群中被杀伤细胞的百分比。
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讨论
本文所述方法为评估自然杀伤细胞（NK细胞）细胞毒活性提供了一种简单且经济的替代方案，可取代传统的51Cr释放试验。该方法比以往的标准方法（如CRA）更灵敏、更可重复，且耗时更短，适用于临床和科研应用。
尽管该检测可使用总PBMC或富集的NK细胞进行，但在处理采集的血量较少或患者样本中细胞数量少、质量差的情况下，无需纯化细胞群而直接使用PBMC是一项显著优势。该检测仅使用CFSE和死细胞排除法 viability 染料。仅通过分析这两个参数即可获得简洁且足以满足诊断需求的信息，同时避免了流式细胞术分析中额外的补偿设置。
该方法还可用于研究自然杀伤细胞（NK细胞）的基本生物学特性，并测试新型靶向NK细胞的治疗方法。在此方面，流式细胞仪不断扩展的检测能力为该实验带来了宝贵的灵活性，使得能够对NK细胞及其活性进行多参数分析，这是以往如CRA等实验方法所无法实现的。此外，还可提供在其他通道中发光的替代性细胞追踪和活力染料，以满足研究人员的需求。
本方案经过优化.......
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披露
作者声明不存在经济利益冲突。
致谢
我们感谢加州大学洛杉矶分校免疫遗传学中心的Jill Narciso在手稿准备过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲液（1x，不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺） | Corning (Cellgro) | 21-040-CM | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Tween-20 | Sigma | BP337-100 | |
| RPMI 1640 培养基 | Corning (Cellgro) | 10-040-CV | |
| 热灭活胎牛血清 | Omega Scientific | FB-02 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140-163 | 储存液浓度为 10,000 U/mL |
| IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | 由经 0.2 μm 滤膜过滤的乙腈和三氟乙酸溶液冻干而成，含牛血清白蛋白作为载体蛋白。用 500 μL 无菌 100 mM 乙酸溶液（含至少 0.1% 牛血清白蛋白）重悬至 100 μg/mL（2.1×10⁶ IU/mL） |
| K562 细胞 | ATCC | CCL-243 | 肿瘤细胞系 |
| T-75 细胞培养瓶 | Corning | 431464 | |
| CFSE 细胞增殖检测试剂盒 | Life Technologies (CellTrace) | C34554 | 将一瓶用 18 μL DMSO 重悬，配制成 5 mM 储存液。避免反复冻融。 |
| Sytox Red | Life Technologies | S34859 | 储存液为 5 μM 的 1 mL DMSO 溶液。DMSO 溶液可经受多次冻融循环而不发生试剂降解。 |
| 钠/锂肝素抗凝采血管 | BD | 02-687-95 | |
| U 型底 96 孔板 | Corning | CLS3897 | |
| 刻度移液管 | BD Falcon | ||
| 聚苯乙烯圆底试管（5 mL） | BD Falcon | 14959-5 | |
| 50 mL 聚丙烯锥形管 | BD Falcon | 352070 | |
| 15 mL 聚丙烯锥形管 | BD Falcon | 352097 | |
| 试剂储液槽 | USA Scientific | 2321-2230 | |
| 人 NK 细胞富集试剂盒 | StemCell Technologies (RosetteSep) | 15065 |
参考文献
- Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.
Figure 4 was updated from:
to:
