分离小鼠皮层神经元培养物的制备 关键词：小鼠, 皮层神经元, 原代培养, 神经元分离, 细胞培养

摘要

本视频展示了一种从晚期胚胎和早期出生后小鼠大脑皮层制备神经元培养物的方法。这些培养物可用于免疫细胞化学、生物化学、电生理学、钙离子和钠离子成像，为研究携带出生后致死性基因突变的转基因动物的神经元发育提供了平台。

摘要

本视频将指导您完成从小鼠晚期胚胎及早期出生后脑组织中制备皮层神经元培养物的全过程。此类培养物可用于多种实验应用，包括免疫细胞化学、生物化学分析、电生理记录、钙离子与钠离子成像，以及蛋白质和/或RNA的提取。此外，这些培养体系还可为研究携带晚期胚胎期或出生后致死性基因突变的转基因动物的神经元发育提供平台。该实验流程相对简便，但需具备一定的组织培养技术经验；若准备充分，整个操作通常不超过两至三小时。在分离过程中仔细去除丘脑-皮层纤维束，有助于减少非神经元细胞的污染。在酶消化步骤后，应轻柔吹打皮层组织碎片以提高神经元细胞的得率。此步骤至关重要，因其可避免对细胞造成不必要的机械损伤，并防止神经元过早死亡。由于这些培养物在无胶质细胞饲养层的条件下维持，因而还可获得神经元高度富集的培养体系，具有额外优势。 关键词：皮层神经元培养，小鼠脑组织，晚期胚胎期，出生后早期，免疫细胞化学，生物化学，电生理学，钙成像，钠成像，蛋白质提取，RNA提取，基因突变，神经元发育，酶消化，吹打解离，非神经元细胞，胶质细胞饲养层

方案

培养前的准备工作：

• 配制无菌解剖液（DS）。
• 配制NBM/B27（含B27添加剂的Neurobasal培养基）。
• 如需要，对ddH₂O进行高压灭菌，并对玻璃盖玻片进行灭菌处理。
• 用多聚-D-赖氨酸包被组织培养皿或玻璃盖玻片。

多聚-D-赖氨酸包被：

在无菌条件下，于培养前一天进行准备。

• 将一份10X多聚赖氨酸（PDL）解冻并置于冰上。
• 在1 ml PDL中加入9 ml无菌超滤水，充分混匀（配制成1X）。
• 按以下方式在室温下用1X PDL过夜包被表面：
  • 玻璃盖玻片（Bellco Glass, Inc. 货号# 1943-00012）：每张盖玻片75 µl
     或
  • 24孔培养板：每孔300 µl
     或
  • 35 mm培养皿：每皿1 ml
• 用无菌水冲洗5次（使用无菌巴斯德吸管吸取液体）。
• 去除水分，直至表面完全干燥。

培养步骤（在层流罩内的无菌条件下进行）

1. 用超级胶水将琼脂块粘附到切片机（Vibraslicer，Campden I....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-氟-2’-脱氧尿苷	Sigma-Aldrich	F0503
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9625
振动切片机	Campden Instruments
氯化钾	Sigma-Aldrich	P4504
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S0876
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P7280
B27 添加剂	Invitrogen	17504-044
Neurobasal 培养基 (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-氨基-5-磷酰戊酸	Sigma-Aldrich	A5282
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7030
胰蛋白酶抑制剂	Sigma-Aldrich	T9253
氢氧化钠，1N 溶液	Fisher Scientific	SS266-1
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C7755
细菌培养用琼脂	Difco Laboratories	0140-01
木瓜蛋白酶	Worthington Biochemical	LS 03126
无菌 0.2 μm 注射器滤器	Fisher Scientific	DDA02025S0
玻璃盖玻片，No1，12 mm	Bellco Glass	1943-00012
最低必需培养基 (MEM)	Invitrogen	11090-081	含 Earle’s 盐，不含 L-谷氨酰胺，用于非神经元细胞培养
青霉素/链霉素	Invitrogen	15070-063	用于非神经元细胞培养
胎牛血清	Invitrogen	16140-071	非神经元细胞培养所需
Nunclon "三联培养瓶" 组织培养瓶	Fisher Scientific	12-565-25	用于非神经元细胞培养。在制备 "条件化 Neurobasal 培养基/B27" 时非常方便，但也可使用其他组织培养瓶或培养皿替代。
玻璃底 "成像培养皿"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	玻璃底 35 mm 培养皿，适用于倒置显微镜系统下的钙离子或钠离子成像，但价格较高！