וידאו זה מציג את הליך ליצירת תרביות נוירונים מעובר מאוחר ועכבר מוקדם קליפת המוח לאחר הלידה. תרבויות אלו יכולים לשמש immunocytochemistry, ביוכימיה, electrophysiology, סידן ונתרן הדמיה לספק פלטפורמה ללימוד פיתוח העצבית של חיות טרנסגניות שנושאים מוטציה לאחר הלידה הגן הקטלני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
וידאו זה ידריך אותך בתהליך של יצירת תרביות נוירונים בקליפת המוח של העובר מאוחר ועכבר מוקדם המוח לאחר הלידה. בתרבויות אלה יכולים לשמש עבור מגוון של יישומים, כולל immunocytochemistry, ביוכימיה, electrophysiology, הדמיה סידן, נתרן, חלבון / או RNA בבידוד. בתרבויות אלה גם לספק פלטפורמה ללימוד פיתוח העצבית של חיות טרנסגניות שנושאים מוטציה מאוחר עובריים או לאחר הלידה הגן הקטלני. ההליך הוא יחסית ישר קדימה, דורש קצת ניסיון טכניקה תרבות רקמות לא צריך לקחת יותר מ 2-3 שעות אם אתם מוכנים כראוי. הפרדה קפדנית של הקליפה קליפת המוח מתוך מערכת thalamo-קליפת המוח הסיבים יהיה להפחית את מספר הלא נוירונים תאים לא רצויים. כדי להגדיל את התשואות של תאים עצביים triturate את פיסות הרקמה קליפת המוח בעדינות אחרי שלב הדגירה האנזים. זה הכרחי שכן הוא מונע פגיעה מיותרת תאים מוקדמת מוות של תאים עצביים. מאחר תרבויות נשמרים בהעדר תאים מזין גליה, הם מציעים גם יתרון נוסף של תרבויות גדל מועשר בנוירונים.
פרוטוקול
הכנות לפני יום culturing:
- הכן פתרון לנתח סטרילי (DS).
- הכן NBM/B27 (Mediom Neurobasal עם תוספי B27).
- החיטוי DDH 2 O ו לעקר coversilps זכוכית, במידת הצורך.
- רקמת סמל תרבות מנות או coverslips זכוכית עם פולי-D-ליזין.
Poly-D-ליזין ציפוי:
הכינו יום ל....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודים להצהיר עליהם.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 5-Fluoro-2’-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| נתרן כלוריד | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Vibraslicer | Campden Instruments | ||
| אשלגן כלוריד | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| נתרן פוספט דיבסי | Sigma-Aldrich | S0876 | |
| אשלגן פוספט מונובסי | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D (+)-גלוקוז | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| סוכרוז | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| תוסף B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| מצע Neurobasal (NBM) | Invitrogen | 21103-049 | |
| 2-Amino-5-phosphonopentanoic acid | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| אלבומין בקר | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| מעכב טריפסין | Sigma-Aldrich | T9253 | |
| נתרן הידרוקסיד, תמיסה 1N | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7755 | |
| Bacto Agar | Difco Laboratories | 0140-01 | |
| פפאין | Worthington Biochemical | LS 03126 | |
| מסנן מזרק סטרילי 0.2 μm | Fisher Scientific | DDA02025S0 | |
| כיסויות זכוכית, No1, 12mm | Bellco Glass | 1943-00012 | |
| מצע מינימלי חיוני (MEM) | Invitrogen | 11090-081 | עם מלחים של Earle’s וללא L-glutamine, נדרש לגידול תרביות שאינן נוירונליות |
| פניצילין/סטרפטומייצין | Invitrogen | 15070-063 | עבור תרבית שאינה נוירונלית |
| סרום בקר עוברי | Invitrogen | 16140-071 | נדרש עבור תרביות שאינן נוירונליות |
| בקבוק לתרבית רקמה Nunclon "Triple Flask" | Fisher Scientific | 12-565-25 | לשימוש עבור תרביות שאינן נוירונליות. בקבוקים אלה נוחים מאוד להפקת "conditioned Neurobasal Media/B27", אך ניתן להשתמש בכל בקבוק או צלחית אחרים לתרבית רקמה במקומם. |
| צלחית "Imaging dishes" עם תחתית זכוכית | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | צלחית תרבית 35mm עם תחתית זכוכית, אידיאלית לדימות סידן או נתרן בעת שימוש במערכת דימות הפוכה. אך יקרה! |
הדפסות חוזרות והרשאות
