Summary
وتقدم طريقة للتحليل الشامل والمطيافيه من الببتيدات الذاتية في الإنسان السائل الدماغي النخاعي (CSF). عن طريق استخدام الترشيح النهائي الوزن الجزيئي والتحليل الشامل والمطيافيه والكروماتوغرافي وجود قبل تركيبة لاحقة من الببتيد تحديد الاستراتيجيات، كان من الممكن توسيع بيبتيدومي الخدمات القطرية المعروفة تقريبا عشرة إضعاف مقارنة للدراسات السابقة.
Abstract
هذا البروتوكول وصف أسلوب وضع تحديد الببتيدات الذاتية في الإنسان السائل الدماغي النخاعي (CSF). لهذا الغرض، أسلوب المتقدمة سابقا استناداً إلى الترشيح النهائي (موكو) الوزن الجزيئي والتحليل الشامل والمطيافيه كان جنبا إلى جنب مع خطوة ما قبل وجود [هبلك] حاليا مرحلة عكس درجة الحموضة العالية.
إفراز في السائل الدماغي النخاعي هو الطريق الرئيسي لإزالة الجزيئات يلقي بخلايا الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي، العديد من العمليات في الجهاز العصبي المركزي تتجلى في الخدمات القطرية، جعلها سائل تشخيصية قيمة. وقد CSF تركيبة معقدة، تحتوي على البروتينات التي تمتد عبر تركيز يتراوح بين 8-9 من حيث الحجم. بالإضافة إلى البروتينات، كما بينت الدراسات السابقة أن وجود عدد كبير من الببتيدات الذاتية. بينما تدرس على نطاق واسع أقل من البروتينات، وهذه قد تعقد الفائدة المحتملة كالمؤشرات الحيوية.
تم فصل الببتيدات الذاتية من محتوى البروتين السائل النخاعي عن طريق الترشيح موكو. عن طريق إزالة معظم محتوى البروتين من العينة، فمن الممكن زيادة حجم عينة الدراسة، وذلك أيضا المبلغ الإجمالي من الببتيدات الذاتية. وتناول تعقيد الخليط الببتيد فيلتراتيد بما في ذلك مرحلة عكس الخطوة ما قبل وجود [هبلك] (RP) على درجة الحموضة القلوية قبل تحليل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد. تم تجزئة جنبا إلى جنب مع مخطط تسلسل بسيط حيث تم تجميع الكسور 60 إلى 12، يمكن وبالتالي تخفيض استهلاك الوقت تحليل بينما لا يزال إلى حد كبير تجنب شطف المشارك.
وأجرى التعرف الآلي الببتيد باستخدام ثلاثة مختلفة الببتيد/البروتين تحديد البرامج وبعد ذلك الجمع بين النتائج. وكانت مختلف برامج متكاملة بدلاً من أن تكون قابلة للمقارنة مع أقل من 15% الجثث تتداخل بين الثلاثة.
Introduction
المؤشرات الحيوية في السائل الدماغي النخاعي (CSF) هي حاليا تحويل البحوث إلى اضطرابات الأعصاب. في مرض الزهايمر، اضطراب الأعصاب الأكثر شيوعاً، التي تؤثر على ما يزيد على 60 مليون شخص في جميع أنحاء العالم1،2، الثلاثي العلامات البيولوجية تتكون من بيتا اميلويد الببتيد، استقرار microtubule البروتين تاو، فوسفوريلاتيد تاو النموذج ويمكن الكشف عن المرض بحساسية عالية وخصوصية، وقد أدرجت في المعايير التشخيصية للبحث3. في أمراض الأعصاب الأخرى، مثل مرض باركنسون والتصلب المتعدد، وحددت الدراسات البروتين العديد من المرشحين العلامات البيولوجية، بعض التي حاليا قيد التقييم في الدراسات السريرية4،5 ،6.
جنبا إلى جنب مع البروتينات، يتضمن الخدمات القطرية أيضا وفرة من الببتيدات الذاتية7،،من89،10،،من1112. تشكل منتجات انشقاق العديد من البروتينات المشتقة من الدماغ، هذه الببتيدات أيضا تمثل مصدرا مهما محتملاً المرض المؤشرات الحيوية. لزيادة مخزون الببتيدات الذاتية التي تم تحديدها في الخدمات القطرية البشرية وتمكين تحليل السائل الدماغي النخاعي اندوبيبتيدوميك في الدراسات السريرية، ووضعت طريقة إعداد العينة وتحليل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد (مخطط موجز بروتوكول قد أدرج في الشكل 1 ). تطبيق هذا الأسلوب في دراسة أجريت مؤخرا أسفرت عن تحديد هوية حوالي 16,400 الببتيدات الخدمات القطرية الذاتية في عينات السائل الدماغي النخاعي المجمعة من عدة أفراد من التشخيص غير محددة، وتوسيع اندوبيبتيدومي الخدمات القطرية المعروفة عشرة إضعاف13. يمكن استخدام الأسلوب اختيارياً بالاقتران مع نهج الوسم إيسوباريك للقياس الكمي.
إعداد نموذج
المصدر الرئيسي لكتلة البروتين في السائل النخاعي مكونات البلازما (مثل الزلال والمناعية) يمر عبر الدم الدماغ حاجز14،15. وفرة عالية يعوق الكشف عن مكونات العينة منخفض وفيرة، والمستمدة من الدماغ. الببتيدات الذاتية يمكن فصلها بسهولة عن البروتينات عالية وفيرة، مما يسمح لكمية أكبر بكثير من استخراج الببتيد CSF لاستخدامها لتحليل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد، مما يمكن من اكتشاف الببتيدات أقل وفرة.
وفي البروتوكول المعروضة هنا، استخدمت الترشيح النهائي (موكو) الوزن الجزيئي لفصل السائل الدماغي النخاعي الببتيدات من الكسر البروتين؛ أسلوب الذي تم استخدامه في السابق عدة دراسات8،،من910،11،،من1216. وأعقب خطوة الترشيح خطوة ما قبل وجود البرنامج العادي [هبلك] دون اتصال يقوم على تدرج مرحلة متنقلة عالية-الأس الهيدروجيني. عن طريق إجراء خطوتين RP [هبلك] جنبا إلى جنب، مع درجة الحموضة ويجري التمييز الرئيسي، نتائج الفرق بين الخطوتين التاليتين في الانتقائية أساسا من الاحتفاظ الببتيد غيرت نتيجة تهمة الببتيد مختلف الدول. التطبيق قبل وجود الببتيد درجة الحموضة العالية قبل LC-MS تحت الظروف الحمضية أثبتت كفاءة في زيادة تحديد الببتيد،من1718، وحتى أن تكون متفوقة لهذا الغرض في البيولوجية المعقدة عينات بالمقارنة مع أكثر فصل متعامد وسائط19، مثل تبادل أيون القط قوية (SCX) والبرنامج العادي20. لتقصير فترة التحليل، تم استخدام مخطط تسلسل، تجمع كل 12th الكسر (مثلاً، الكسور 1, 13, 25 و 37 و 49)، الذي لا يزال إلى حد كبير تجنب شطف المشارك من الببتيدات من مختلف نظراً لارتفاع قوة حل للبرنامج العادي [هبلك] الخطوة الكسور في مرض التصلب العصبي المتعدد LC20،21.
تحديد الببتيد
تحديد الببتيد في الدراسات بيبتيدوميك تختلف عن تلك الدراسات البروتين حيث يمكن تحديد لا انشقاق الإنزيم في البحث عن قاعدة البيانات، ونتيجة لذلك، يتم تحديد أسعار عادة ما تكون أقل من11. وأظهرت دراسة الأخيرة13 أن معدلات تحديد الهوية الذاتية الببتيدات التي تم الحصول عليها مع سيكويست والتميمة إلى حد كبير تحسنت عند تعديل الافتراضي التهديف خوارزمية للبرنامج كل منهما استخدام التهديف التكيفية خوارزمية دورق القهوة، مما يشير إلى أن الخوارزميات التهديف الأمثل الببتيدات الذاتية تختلف من الببتيدات تريبتيك13. حيث تم العثور على الدراسة، وتحديد الهوية استناداً إلى تسلسل حيثياته الببتيد التلقائي باستخدام البرمجيات قمم (BSI) تكون مكملة لمحركات البحث على أساس أخذ بصمات أيون يفتت اثنين، أسفر عن مجموعة أكبر بكثير من تحديد الببتيدات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكول هو موضح أدناه نسخة المكرر من تلك المستخدمة في دراسة سابقة حيث تم تحديد كمية كبيرة من الببتيدات الذاتية في السائل الدماغي النخاعي البشرية15. التحديثات إلى البروتوكول الأصلي تنطوي على تعديلات طفيفة لما قبل المعالجة الكيميائية للخدمات القطرية وكذلك الأمثل للتدرج الذي سيتم استخدامه لتجزئة قبل البرنامج العادي [هبلك] درجة الحموضة العالية دون اتصال.
اعتبارات أخلاقية
جميع الدراسات السويدية المريض ومراقبة المواد أقرتها اللجان الأخلاقية: سانت غوران (الرقم 2005-554-31/3). استخدمت عينات السائل الدماغي النخاعي من "الفوج الخرف أمستردام" والعينات التي تم جمعها في المستشفى الوطني لطب الأعصاب وجراحة الأعصاب، ولندن للبحث مع الحصول على موافقة كتابية من جميع المرضى المشاركة والموافقة عليه من لجان الأخلاقيات الإقليمية. المواد المستخدمة هنا أساسا يتكون من السائل الدماغي النخاعي اليسار أكثر من العينات المتخذة لغرض التشخيص وكان الشطب التي تم تحديدها من قبل إدراجها في دراساتنا. لا توجد إمكانية لتتبع العودة العينة إلى أي الجهات المانحة الفردية أو مجموعة من الجهات المانحة.
1-استخراج الإنسان السائل الدماغي النخاعي (CSF):
- استخراج السائل النخاعي عن طريق البزل القطني (يجب إجراؤها بواسطة أحد أطباء مدربين) باستخدام بروتوكول موحد22.
- إزالة الحطام الخلية وغيرها من المواد غير القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 2,500 س ز لمدة 20 دقيقة.
- فحص عينات السائل الدماغي النخاعي تلون قد تشير إلى تلوث الدم الناتجة عن نزيف ثقب بصريا. تركيز البروتين أعلى بكثير في الدم ووجود البروتياز يؤثر إلى حد كبير النتائج التحليلية.
2-المعالجة المسبقة للخدمات القطرية (1.5 مل حجم العينة، لا التحديد الكمي):
- ذوبان الجليد 1.5 مل من السائل الدماغي النخاعي مختبرين في درجة حرارة الغرفة (RT) ونقل المحتويات إلى أنابيب البولي بروبلين 10 مل وإضافة 80 ميليلتر من 1 م بيكربونات تريثيلامونيوم (برنامج) كعامل التخزين مؤقت.
- إضافة مل 0.65 م 8 جوانيدينيوم هيدروكلوريد (جدنهكل) (تركيز نشط جدنهكل: 2.4 متر) ودوامه بلطف على RT لمدة 10 دقائق.
ملاحظة: عامل تشاوتروبيك، جدنهكل، على حد سواء تؤثر على اللزوجة المذيبات ويتفاعل مع سلسلة ببتيد، الذي ينتج البروتين تتكشف يجري نشاط مؤات23. وهكذا، جدنهكل يذوب المجاميع البروتين ويزيد انتعاش الببتيدات الذاتية من خلال الترشيح اللاحقة. - إضافة 60 ميليلتر من 200 ملم من مائي tris(2-carboxyethyl) هيدروكلوريد الفوسفين (تسيب) (تركيز نشط تسيب: 6 مم) واحتضان في 55 درجة مئوية ح 1 للحد من ديسولفيديس سيستئين.
- أضف 35 ميليلتر من 400 مم إيودواسيتاميدي (IAA) (تركيز نشاط الأكاديمية: 4 مم) واحتضان في RT في الظلام لمدة 30 دقيقة الكيلات سيستينيس. إضافة مجموعة الألكيل يضمن أن بقايا السيستين لا يمكن أن تشكل عفويا جسور جديدة الميثيل عند أي نقطة أثناء إعداد عينة اللاحقة.
- إضافة مل 3.25 الماء المتأين الشطب ودوامه بإيجاز تمييع العينة قبل الترشيح موكو، أسفر عن حجم عينة إجمالية 5.5 مل. هذه الخطوة تؤدي إلى تمييع جدنهكل إلى أسفل 1 م كما لوحظ أعلى تركيز في بعض الأحيان تسبب الرشح من المواد البوليمرية من أجهزة تصفية.
3-المعالجة المسبقة للخدمات القطرية (حجم العينة 10 × 150 ميليلتر، وسمها إيسوباريك-التقدير الكمي):
- ذوبان الجليد 150 ميليلتر من السائل الدماغي النخاعي مختبرين من 10 أفراد في الرايت وبعد ذلك نقل المحتويات إلى أنابيب الطرد المركزي الجزئي ملزمة منخفضة الفردية 1.5 مل وإضافة ميليلتر 8 م 1 برنامج كعامل التخزين مؤقت.
- إضافة 65 ميليلتر من 8 م جدنهكل (التركيز النشط جدنهكل: 2.4 متر) ودوامه بلطف على RT لمدة 10 دقائق.
- إضافة 6 ميليلتر من 200 ملم تسيب مائي (تركيز نشط تسيب: 6 مم) والحضانة في 55 درجة مئوية ح 1 للحد من ديسولفيديس سيستئين.
- إضافة 3.5 مم 400 ميليلتر الأكاديمية مائي (تركيز نشاط الأكاديمية: 6 مم) واحتضان RT والظلام لمدة 30 دقيقة الكيلات سيستينيس.
- تحضير الأدوات الوسم isobaric (مثلاً.، "جنبا إلى جنب كتلة العلامة" 10plex كاشف الوسم isobaric). تسمح قنينات كاشف وسمها إيسوباريك للوصول إلى RT قبل فتحها لتفادي ترطيب كاشف لا لزوم لها وإضافة 41 ميليلتر من الصف [هبلك] الاسيتو الانيتريل (AcN) وتذوب بالانفعالات لطيف لمدة 5 دقائق.
- نقل 30 ميليلتر isobaric كاشف وسمها الحل للعينة المناظرة واحتضانها ح 1 في RT تحت الانفعالات لطيف. ويشمل الكاشف الوسم isobaric جماعة دائرة الصحة الوطنية--إستر الذي يتفاعل مع الأمينات الأولية الحالية في الببتيد ن تيرميني فضلا عن بقايا يسين.
- إضافة 8 ميليلتر من هيدروكسيلاميني 5% (هيدروكسيلاميني التركيز النشط: 0.16 في المائة) وهزه بلطف على RT لمدة 20 دقيقة إخماد رد فعل الوسم. حيث يمكن الجمع بين العينات التي توسم بشكل منفصل، تأكد من أن رد فعل الوسم هو مروي. بالإضافة لوفرة مجموعات أمين في شكل هيدروكسيلاميني، الكاشف الوسم isobaric المتبقية مسموح للرد وهكذا يصبح خامل.
- دمج محتويات كل من 10 عينات توسم منفردة في أنبوب البولي بروبلين واحد 15 مل.
- إضافة 6.4 مل الماء المتأين الشطب إلى الجمع بين العينة ودوامه بإيجاز خفض تركيز تزاول من 12% إلى 3% وإلى تركيز جدنهكل جدنهكل إلى أسفل 1 م كأعلى تركيز وقد لوحظ في بعض الأحيان تسبب الرشح من المواد البوليمرية من أجهزة التصفية.
4-الوزن الجزيئي وقف الترشيح
- من أجل إزالة إمكانية تصفية الملوثات، شرط موكو بتحميل 10 مل مائي 1 م جدنهكل، 25 مم برنامج وسينتريفوجينج لمدة 15 دقيقة في 2,500 س ز و RT، تجاهل في التدفق من خلال (قدم).
- تحميل حجم عينة كاملة على التصفية (5 مل غير المسمى CSF (الخطوة 2.5) أو 10 مل المسمى إيسوباريكالي الخدمات القطرية (الخطوة 3، 9)) والطرد المركزي لمغادرة 30 دقيقة في 2,500 س ز و RT، في التدفق من خلال (قدم) في حاوية مجموعة. نتيجة للترشيح أن تفصل الببتيدات والبروتينات الصغيرة أكبر البروتينات وبقايا الحطام خلية. يمكن اعتبار هذه الخطوة بيبتيدوميك يعادل استخدام proteolytic هضم البروتينات لتوليد الببتيدات في تجارب البروتين.
- تحميل مل 5 مم 25 برنامج (مائي) على عوامل التصفية والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 2,500 س ز و RT، بغية زيادة انتعاش الببتيدات.
- دوامة FTs مجتمعة من الخطوتين السابقتين (المجموع 10 مل من غير المسمى أو عينة المسمى إيسوباريكالي 15 مل)، والمضي قدما لتحميض العينة.
5-إزالة التمليح وعينه تنظيف باستخراج المرحلة الصلبة
- أسيديفي العينة التي تمت تصفيتها من الخطوة 4، 4 قبل استخراج المرحلة الصلبة (SPE). ويتم التحميض بغية تحسين التفاعل المذاب (ببتيد) مع المرحلة ثابتة لجمعية مهندسي البترول-الخرطوشة.
- للحصول على نموذج غير المسمى (حجم 10 مل): إضافة ميليلتر 550 1% حامض Trifluoroacetic (تفا)-الحجم الإجمالي للعينة: 10.55 مل مع 0.05% تفا.
- للحصول على نموذج إيسوباريك المسمى (حجم 15 مل): إضافة 20 مل 0.1% تفا أسيديفي وانخفاض تركيز تزاول من 3% إلى 1%-الحجم الإجمالي للعينة: 30 مل مع 0.066% تفا.
ملاحظة: تفا هو أيضا إضافة لوظيفتها ككاشف أيون الأقران، مما يحسن الإبقاء على الببتيدات لا نفسها قادرة على التفاعل مسعور قوية بما فيه الكفاية مع مواد التعبئة الخرطوشة جمعية مهندسي البترول الإبقاء على. - إذا كان الرقم الهيدروجيني > 3, تيتراتي العينة مع حمض الفوسفوريك 20% حتى يصبح pH عينة < 3.
- شرط خراطيش جمعية مهندسي البترول بإضافة 1 مل من 84% تزاول، 0.1% حمض الفورميك (اتحاد كرة القدم)، وتجاهل قدم كرر مرة واحدة. مطلوب تكييف خرطوشة مرشح لإزالة المواد غير المرغوب فيها التي خلاف ذلك الوت جنبا إلى جنب مع الببتيدات في الخطوات اللاحقة؛ علاوة على ذلك، تكييف نفاذية زيادات في عامل التصفية.
- حجته خرطوشة جمعية مهندسي البترول بإضافة 1 مل من 0.1% تفا، تجاهل تكرار قدم مرة واحدة. التأكد من أن عامل التصفية لم تجف بعد آخر خطوة الموازنة-الحفاظ على وحدة تخزين صغيرة على رأس عامل التصفية. يتم تنفيذ الموازنة لتصفية خرطوشة بغية إعداد عامل التصفية للاحتفاظ الببتيدات بإزالة مادة مسعور (الاسيتو الانيتريل) ترك من الخطوة تكييف.
- تحميل حجم العينة كاملة (10.55 مل لعينات غير المسمى أو 30 مل لعينات المسمى إيسوباريكالي)، في عدة أجزاء، إذا لزم الأمر، واسمحوا متر تشغيل في النفايات. ضمان أن الخرطوشة لا تجف بين عينة تحميل طلقة أو بعد أن تم تحميل حجم العينة الأخيرة-الحفاظ على وحدة تخزين صغيرة على رأس عامل التصفية.
- تمرير 1 مل من 0.1% تفا على المرشحات لإزالة الأملاح والمواد الكاشفة وتجاهل تكرار قدم مرة واحدة. ضمان أن الخرطوشة لم تجف بعد كل خطوة الغسيل--الحفاظ على كمية صغيرة من السائل على رأس الخرطوشة.
- مكان 1.5 مل ملزمة منخفضة مايكرو الطرد المركزي أنابيب تحت الخرطوشة والوتي العينة بتمرير 1 مل من 84% تزاول، 0.1% فا على الخرطوشة.
- إزالة المذيبات من العينة دي المملحة بالتبخر في أجهزة الطرد مركزي فراغ تشغيل دون تدفئة نشطة حتى الجاف، تخزين في-80 درجة مئوية أو الشروع فورا بوجود درجة الحموضة العالية.
6-حاليا درجة الحموضة العالية "عكس المرحلة [هبلك] عينة تجزئة"
-
إعداد مراحل النقالة المائية العالية-الأس الهيدروجيني (تتضمن):
ج: المخزن المؤقت تتضمن المياه النقية
تتضمن المخزن المؤقت ب: 84% تزاول
تتضمن المخزن المؤقت جيم: 25 مم NH4أوه
تتضمن تحميل المخزن المؤقت: 2.5 مم NH4أوه، 2% تزاول
ملاحظة: تتضمن تحميل المخزن المؤقت كالمخزن الحل ونماذج النقل - إعادة حل العينة في المخزن المؤقت 16 "تتضمن تحميل" ميليلتر من الانفعالات لطيف لمدة 20 دقيقة
- تحميل 15 ميليلتر العينة على نظام [هبلك] مع جامع كسر داخلية للوحات 96-الآبار العميقة تكوينها وفقا باتث et al. 20 مع تعديلات طفيفة. يجزئ في تدفق 100 ميليلتر/دقيقة على عمود فصل مستقرة الأس الهيدروجيني (C18 3.5 ميكرومتر، 2.1 ملم × 250 ملم) وجمع جزء واحد كل دقيقة عبر تدرج خطي 60 دقيقة.
- استخدام النقاط الزمنية التدرج التالي: t = 0 دقيقة، ب = % 1، ج = 10%؛ t = 4 دقيقة، ب = % 1، ج = 10%، جمع الكسر ابدأ؛ t = 76 دقيقة، ب = 70%، ج = 10%؛ نهاية الكسر جمع؛ t = 76.5 دقيقة، ب = 85%، ج = 10%؛ t = 80 دقيقة، ب = 85%، ج = 10%؛ t = 80.5 دقيقة، ب = % 1، ج = 10% و t = 90 دقيقة، ب = % 1، ج = 10%.
- جمع كسور متكررة في 12 بئرا في نمط دائري، وهكذا وصل الكسور متباعدة قبل 12 دقيقة، أسفر عن كسور 12، كل منها يحتوي على 6 أجزاء فرعية متسلسلة.
- إزالة المذيبات من العينات باستخدام الطرد المركزي فراغ في الرايت و 3000 دورة في الدقيقة حتى الجاف، وتخزين العينات في-80 درجة مئوية قبل تحليل LC-مرض التصلب العصبي المتعدد.
7-LC مرض التصلب العصبي المتعدد
-
إعداد مراحل النقالة المائية:
المخزن المؤقت ج: فا 0.1%
المخزن المؤقت 0.1% فا، تزاول 84%
تحميل المخزن المؤقت: 0.05% تفا، 2% تزاول
ملاحظة: تحميل المخزن المؤقت كحل النقل والمخزن المؤقت للعينة والمرحلة المتنقلة للمضخة تحميل. - إعادة حل كل من الكسور 12 بإضافة ميليلتر 6 تحميل المخزن المؤقت وتهز في RT لمدة 20 دقيقة
- تحميل 5 ميليلتر عينة في [هبلك] نانو-تدفق، العاملة في فخ تكوين العمود (العمود فخ: 75 سم مكم x 2، ج18، 100 حجم مسام، 3 حجم الجسيمات ميكرومتر؛ عمود فصل: C18, ميكرومتر 75 × 500 مم، 100 حجم مسام، وحجم الجسيمات 2 ميكرومتر ، والقيام بفصل الببتيد بمعدل تدفق 150 nL/دقيقة باستخدام التدرج التالي: t = 0 دقيقة، ب = 2%؛ t = 10 دقيقة، ب = 2%؛ t = 11 دقيقة، ب = 7%؛ t = 100 دقيقة، ب = 26 في المائة؛ t = 170 دقيقة، ب = 45 في المائة؛ t = 175 دقيقة، ب = 80 في المائة؛ t = 181 دقيقة، ب = 2%، و t = 210 دقيقة، ب = 2%.
-
أداء مرض التصلب العصبي المتعدد على الهجين عالية الدقة مطياف كتلة متصلة [هبلك] عبر واجهة نانو-دليل الاستدامة الاقتصادية. تسجيل الأطياف مسح كامل في وضع مرض التصلب العصبي المتعدد في إعداد قرار 120 ألف (2.0e5 AGC المستهدفة) على مدى نطاق m/z 350-1,400.
- تعمل مطياف كتلة في اقتناء البيانات تعتمد على وضع، حدد MS/مرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف من أعلى قمم الأكثر كثافة عشرة مع m/z > 150 وداخلها كثافة النطاق 1.0e4-1.0e5 لتحليل أيون يفتت. عزل أيونات السلائف باستخدام نافذة عزلة الرباعي من 1 m/z، وحقن أقصى وقت 100 مللي ثانية والعدسة RF 60%.
- تطبيق الاستبعاد دينامية مع وقت استبعاد من 15 ثانية وتسامح m/z ± 10 أجزاء من المليون. إجراء تجزئة في الخلية الانفصال (HCD) الطاقة أعلى الاصطدام وسجل MS/MS المقتنيات في أوربيتراب في إعداد قرار 000 50 دولار (القيمة المستهدفة AGC 5.0e4).
8-الببتيد تحديد الهوية
-
لتحديد الببتيد يقدم.raw-الملفات الناتجة من التحليل الشامل والمطيافيه إلى محرك بحث البروتيوميات تطبيق الإعدادات التالية:
ملاحظة: في أعمالنا السابقة دراسة15، ثلاثة محركات البحث؛ واستخدمت v2.4 التميمة و HT سيكويست v7.5 قمم بالتوازي واستخدمت الإعدادات المحددة هنا لجميع محركات البحث الثلاث، ما لم يحدد خلاف ذلك. معظم الإعدادات القابلة للتعديل عالمية لتحديد الببتيد/البروتين وينبغي أن تكون الإعدادات المناظرة في أي محرك بحث معين.
طيف محدد:
السلائف دقيقة الشامل: 350 دا
ماكس. السلائف الشامل: دا 5,000
نوع المسح الضوئي: كامل
عتبة إشارة/الضوضاء: 1.5
تسلسل قاعدة بيانات البحث
قاعدة البيانات: UniProt_SwissProt [version2015_11]
التصنيف: الإنسان العاقل
إنزيم: لا شيء
ماكس. غاب عن الانشقاقات: 0
صك (التميمة فقط): فخ ESI
أدنى طول الببتيد (سيكويسثت فقط): 6
ماكس. طول الببتيد (سيكويسثت فقط): 144
السلائف التسامح الشامل: 15 صفحة في الدقيقة
تجزئة التسامح الشامل: دا 0.05
التعديلات ثابتة: Carbamidomethyl (C)؛ [إذا كان المسمى] TMT10plex (N-المدة)
التعديلات الديناميكية: أكسدة (م)؛ [إذا كان المسمى] TMT10plex (K)
ببتيد-الطيف تطابق أداة التحقق من الصحة (PSM)
دورق القهوة (التميمة و HT سيكويست فقط) أو شرك الانصهار (قمم فقط)
استهداف فرانكلين روزفلت: 0.01
التحقق من الصحة على أساس: q-القيمة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
طبق الطريقة الموضحة هنا وتقييمها في الدراسات الثلاث قبل الأخذ بنموذج ما قبل وجود (الجدول 1). أول دراسة استخدمت LC حاليا لاكتشاف الكسور الخدمات القطرية على استخدام لوحة هدف وأدت إلى 730 الببتيدات الذاتية المحددة11. استخدمت في الدراسات التالية اثنين، وسمها إيسوباريك. أساسا في تحكم حالة دراسة لتحديد وتوصيف المؤشرات الحيوية المحتملة في السائل الدماغي النخاعي اندوبيبتيدومي والبروتين في نفس الوقت24، واستخدمت في وسم isobaric الدراسة الثانية لرصد آثار العلاج الحية في من مثبط γ-سيكريتاسي على التعبير الببتيد في الخدمات القطرية على مدى 36 ح16. وحددت في دراسة القضية/مراقبة الببتيدات الذاتية 437، 64 التي غيرت إلى حد كبير في تركيز بين الأفراد مع الإعلان وضوابط صحية. الثالث، دراسة المعاملة، حددت 1798 الببتيدات الذاتية، ويمكن أن يتبين 11 الببتيدات رصد الاستجابة للعلاج.
في الدراسة الرابعة، ويهدف إلى زيادة العدد الببتيدات الخدمات القطرية المحددة، لا سيما لتحديد الببتيدات أقل وفرة. ولذلك أدرج تجزئة قبل الببتيد التي تتضمن-RP اللوني واستخدمت حجم عينة السائل الدماغي النخاعي أكبر إذ، أسفرت عن تحديد هوية الببتيدات 16,395. في هذه الدراسة، تم إجراء لا وسم إيسوباريك. بالإضافة إلى وجود عينة، استخدمت أحدث دراسة تعريف ببتيد مجتمعة النهج، بينما قد أنجز بحث قاعدة بيانات واحد فقط في الدراسات الثلاث الأولى، التي لبعض الحسابات مدى لعدد أكبر من الببتيدات حددت. مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق محركات البحث الفردية (التميمة، سيكويست HT أو قمم) من الدراسة الأخيرة تشير إلى أن الخوارزميات المستخدمة إلى حد ما التكميلية منذ كمية صغيرة نسبيا، وأقل من 15 في المائة (2440)، من الببتيدات حددت من قبل جميع محركات البحث الثلاث (الشكل 2). علاوة على ذلك، دي نوفو-تسلسل البحث قمم المحرك أكثر كفاءة في تحديد الببتيدات الذاتية، ولكن أكثر من الببتيدات 5,400 أن لا قد حددت إلا إذا كانت قمم المستخدمة (الشكل 2). إمكانات تطبيق العديد من محركات البحث على نفس المواد مسائل اختبار متعددة، وهذا قد عولجت بإجراء اختبار لتحديد صحة13. قد أتيحت البيانات MS/MS الأولية المكتسبة، فضلا عن جميع النتائج التي تم الحصول عليها في عمليات البحث عن البروتين من المحاكمة الأخيرة في مستودع البيانات فخر عن طريق بروتيوميكستشانجي مع معرف PXD004863.
رقم 1: مخطط بروتوكول تصور الخطوات الرئيسية للأسلوب- إضافة جدنهكل استخراج السائل الدماغي النخاعي بالثقب القطني متبوعاً بالطرد المركزي لإزالة المواد غير القابلة للذوبان، 2) للعينة أن تنأى بالمجاميع البروتين الببتيد، زيادة انتعاش الببتيدات الذاتية؛ الحد والالكله سيستين ديسولفيديس؛ وضع العلامات إيسوباريك للقياس الكمي الببتيد (اختياري) 3) الوزن الجزيئي الترشيح لفصل الببتيدات الذاتية من البروتينات، 4) استخراج المرحلة الصلبة لإزالة الأملاح والملوثات الأخرى القطبية، 5) روبية [هبلك] قبل تجزئة، القلوية المرحلة المتنقلة التدرج والتسلسل لكل جزءال 12، 6) التدرج المرحلة المتنقلة RP [هبلك]-MS/MS، الحمضية، تشغيل كل جزء متسلسلة تباعا، 7) تحديد الببتيد يقوم بإرسال بيانات MS/MS من كافة المجريات تحليل 12 وأجرى عينة واحدة لمحركات البحث، وفي وقت لاحق تم مقارنة معرفات الببتيد وخلاصة الببتيد فريدة كافة معرفات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| موجز الدراسة | الحديد وسمها (y/n) | RP تتضمن تجزئة (y/n) | حجم المقابلة للخدمات القطرية لمرض التصلب العصبي المتعدد-تحليل (ميليلتر) | عدد من الببتيدات التي تم تحديدها | التعليق | مرجع |
| الاستكشافية تحليل بيبتيدومي CSF | n | n | 500 | 730 | دون اتصال استخدام LC الهدف إعداد واستخدام--مرض التصلب العصبي المتعدد؛ تقييم المرشحات موكو | 4 |
| مقارنة كمية من الببتيدات الخدمات القطرية؛ 8 السيطرة + عينات من 08:00 م | y | n | 200 | 437 | مرض التصلب العصبي المتعدد [هبلك]-دليل الاستدامة الاقتصادية؛ بيبتيدوميك المشتركة والبروتوكول البروتين | 25 |
| إعلان غاما سيكريتاسي المانع معاملة الدراسة | y | n | 300 | 1798 | مرض التصلب العصبي المتعدد [هبلك]-دليل الاستدامة الاقتصادية؛ الخدمات القطرية المستخرجة في ست نقاط زمنية بعد العلاج | 17 |
| توسيع بيبتيدومي CSF | n | y | 750-1000 | 18.031 | مرض التصلب العصبي المتعدد [هبلك]-دليل الاستدامة الاقتصادية؛ مجموعة من برامج التعريف الببتيد | 15 |
الجدول 1: مجموعة من الدراسات الحديثة التي يقوم بها هذا الفريق الذي ينطبق على الترشيح الوزن الجزيئي والتحليل الشامل والمطيافيه للتعرف على الببتيدات الذاتية في الإنسان السائل الدماغي النخاعي.
رقم 2: رسم تخطيطي متداخل مقارنة نتائج تحديد الهوية الببتيد تم الحصول عليها من كل من محركات البحث الثلاثة التميمة وسيكويست HT وقمم. وحددت مجموعة الببتيدات الذاتية 16,395. دي نوفو-تسلسل القمم محرك البحث المحددة 10,967 الببتيدات الذاتية؛ محركات البحث القائم على أخذ بصمات الأصابع يفتت أيون التميمة و HT سيكويست حددت الببتيدات الذاتية 8118 و 7304 على التوالي. تحديد توافق الآراء بين جميع محركات البحث الثلاثة بلغ 2440 الببتيدات الذاتية، أو 14.8 في المائة. كان هناك تداخل هوية كبيرة نسبيا بين التميمة و HT سيكويست، يناظر 70% من تلك التعريفات الببتيد مجتمعة. قمم وكان تعريف صغيرة نسبيا تتداخل مع التميمة و HT سيكويست؛ 20.5 18.9 في المائة وفي المائة على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأخذ بخطوة ما قبل وجود RP [هبلك] درجة الحموضة العالية لبروتوكول المتقدمة سابقا لانتعاش الببتيدات الذاتية بالوزن الجزيئي أولترافيلتريشن11 تخفيض تعقيد العينة النسبي ومما يسمح لإضعاف أكبر حجم عينة الدراسة. هذا، بدوره، زيادة تركيز مجموعة فرعية الببتيدات موجودة في كل جزء وبالتالي تحسين فرص الكشف عن انخفاض الببتيدات وفيرة.
قبل تنفيذ استراتيجية لتحديد هوية الببتيدات الذاتية التي استخدمت ثلاثة برامج البروتين في نفس الوقت، كان من الممكن توسيع اندوبيبتيدومي الخدمات القطرية المعروفة أكثر من الوقت. وحددت مجموعة الببتيدات الذاتية 16,395 في محاكمة أولى في مادة عينة السائل الدماغي النخاعي مجمعة. وكان من بين الجثث عدد كبير من الببتيدات الذاتية المستمدة من البروتينات التي تمت الإشارة سابقا في سياق اضطرابات الأعصاب. ويجري حاليا تقييم عديدة الببتيدات المحددة في الدراسات المذكورة أعلاه كالمؤشرات الحيوية في المختبر. تنطوي هذه العملية على عدة خطوات، بما في ذلك تحقق هويات الببتيدات النتوءات السائل الدماغي النخاعي مع نظائرها الاصطناعية المسمى مع النظائر المشعة الثقيلة، إنشاء فحوصات والمطيافيه الشامل المستهدف، تقييم الاستقرار الببتيد أثناء التخزين و تجميد أذاب دورات، وتحليل الأفواج سريرية مختلفة.
تم إجراء تعديلات على البروتوكول الأصلي بغية تجنب الأخذ بالملوثات (خطوات 2.5 و 3.5) نتيجة لتركيز عال من جدنهكل في العينة خلال موكو-الترشيح. استكمالا لما قبل وجود التدرج (الخطوة 6.3.1)، يتم استخدام القدرات المطول، وخطي متدرجة.
الأسباب الرئيسية للخسائر أكثر في البروتوكول هنا وصف يمكن أن يعزى إلى RP الكروماتوغرافي خطوتين، فضلا عن الترشيح موكو وجمعية مهندسي البترول عينة تنظيف خطوة.
في جملة الببتيد من الصعب تجنب الخسائر الناجمة عن التفاعل مع موكو-التصفية، أو الإبقاء عليه، أثناء تنقية البروتينات ويمكن أن تكون مصدرا لتباين العينة.
كذلك تنشأ انتقائية الخسائر المحتمل في الخطوات RP الكروماتوغرافي. ولما hydrophobicity الببتيد تعتمد على درجة الحموضة، أداء اثنين RP الكروماتوغرافي خطوات متعاقبة في ارتفاع وانخفاض درجة الحموضة، على التوالي، قد يؤدي إلى خسائر لمجموعة فرعية الببتيدات التي أيضا ماء في إيه ناين الأس الهيدروجيني الإبقاء على العمود والمثل الثاني ماء جداً في دي ثري درجة الحموضة الإبقاء على مجموعة فرعية.
مقارنة بالأساليب المستخدمة سابقا العمالة قبل وجود قد أدى إلى زيادة الوقت في تحديد هوية الببتيدات الذاتية. قد سمح للكشف عن نجاح عدد كبير من الببتيدات مجهولة سابقا وهو أداة قيمة في دراسة واستكشاف بيبتيدومي CSF، وربما غيرها العينات البيولوجية المعقدة، فضلا عن ذلك.
جنبا إلى جنب مع وسمها isobaric متعدد البروتوكول يهدف إلى مواصلة تطبيقها لتحديد المرشحين العلامات البيولوجية لمختلف اضطرابات الأعصاب في الأنسجة السائل الدماغي النخاعي والدم والدماغ.
يساهم الانتعاش متفاوتة في خطوات إعداد نموذج التباين التحليلي للتحليل البروتينات السائل الدماغي النخاعي والببتيدات عن طريق "أداء" LC-السيدة isobaric وسمها الببتيدات في مرحلة مبكرة في انخفاض إعداد نموذج تأثير مثل هذه التباين إلى حد كبير. بالمقارنة مع عينة سبق الإبلاغ عنها إعداد البروتوكولات، تنفيذ المرحلة عكس درجة الحموضة العالية الببتيد قبل وجود زيادة العدد الببتيدات التي تم تحديدها بمعامل 5. تحديد الببتيدات الذاتية من مرض التصلب العصبي المتعدد ومرض التصلب العصبي المتعدد-البيانات تحسن كبير عند الجمع بين الببتيد مختلفة تحديد البرامج، تستخدم خوارزميات بحث مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لم يبلغ أي من المصالح المتنافسة، مالية أو غيرها، بين المؤلفين.
Acknowledgments
جزيل الشكر باتث فاقد أحبابه وزملائه لتقديم المشورة في إعداد أسلوب تجزئة قبل.
هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من مجلس البحوث السويدية ولستروم ومؤسسة Sjöblom، البندقية وبيرتل ستون مؤسسة ستيفتيلسي، ومؤسسة بيرجوال ماغنوس، مؤسسة Åhlén، الزيميرفوندين، Demensförbundet، ستيفتيلسين Tjänarinnor جاملا كنوت ومؤسسة والنبرغ أليس، فريموراريستيفتيلسين، و Götalandsregionen FoU-فنادق.
وكانت المتلقية الرئيسية لتمويل هذا المشروع بلينو كاي، هنريك زعتربيرج ويوهان جوبوم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Triethylammonium bicarbonate | Fluka, Sigma-Aldrich | 17902-100ML | TEAB |
| 8 M Guanidinium hydrochloride | Sigma-Aldrich | G7294-100ML | GdnHCl |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Pierce | 20490 | TCEP |
| Iodoacetamide | SIGMA | I1149-5G | IAA |
| Hydroxylamine 50% (w/w) | Sigma-Aldrich | 457804-50ML | |
| Acetonitrile, Far UV, HPLC gradient grade | Sigma-Aldrich | 271004-2L | AcN |
| Formic acid | Fluka, Sigma-Aldrich | 56302-1mL-F | FA |
| Triflouroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508-10AMP | TFA |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 30501-1L-1M | NH4OH |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-30 membrane | Merck Millipore | UFC903024 | MWCO-filter |
| Sep-Pak C18, 100 mg | Waters | WAT023590 | SPE-column |
| Resprep 12-port SPE Manifold | Restek | 26077 | Vacuum manifold |
| TMT10plex Isobaric Label Reagent Set | Thermo Fisher Scientific | 90110 | TMT10plex |
| UltiMate 3000 RSLCnano LC System | Dionex | 5200.0356 | Online sample separation |
| Ultimate 3000 RPLC Rapid Separation Binary System | Dionex | IQLAAAGABHFAPBMBEZ | Offline high-pH fractionation |
| Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | Mass spectrometer for sample analysis |
| Proteome Discoverer 2.0 | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGABSFAKJMAUH | Proteomics search platform |
| Mascot v2.4 | Matrix Science | - | Proteomics search engine |
| Sequest HT | Thermo | - | Proteomics search engine |
| PEAKS v7.5 | Bioinformatic Solutions Inc.) | - | Proteomics search engine |
| Acclaim PepMap 100, 75 µm x 2 cm, C18, 100 Å pore size, 3 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164535 | Trap column (nano HPLC) |
| Acclaim PepMap C18, 75 µm x 500 mm, 100Å pore size, 2 µm particle size | Thermo Fisher Scientific | 164942 | Separation Column (nano HPLC) |
| Savant SpeedVac High Capacity Concentrators | Thermo Fisher Scientific | SC210A-230 | SpeedVac/Vacuum concentrator |
| XBridge Peptide BEH C18 Column, 130Å, 3.5 µm, 2.1 mm X 250 mm | Waters | 186003566 | Separation Column (micro HPLC) |
References
- Wimo, A., et al. The worldwide costs of dementia 2015 and comparisons with 2010. Alzheimers Dement. 13 (1), 1-7 (2017).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer's disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Dubois, B., et al. Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria. Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).
- Olsson, B., et al. CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 15 (7), 673-684 (2016).
- Spellman, D. S., et al. Development and evaluation of a multiplexed mass spectrometry based assay for measuring candidate peptide biomarkers in Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) CSF. Proteomics Clin Appl. 9 (7-8), 715-731 (2015).
- Höglund, K., et al. Alzheimer's disease—Recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria. Clin Chim Acta. 449, 3-8 (2015).
- Stark, M., Danielsson, O., Griffiths, W. J., Jornvall, H., Johansson, J. Peptide repertoire of human cerebrospinal fluid: novel proteolytic fragments of neuroendocrine proteins. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. 754 (2), 357-367 (2001).
- Yuan, X., Desiderio, D. M. Human cerebrospinal fluid peptidomics. J Mass Spectrom. 40 (2), 176-181 (2005).
- Berven, F. S., et al. Pre-analytical influence on the low molecular weight cerebrospinal fluid proteome. Proteomics Clin Appl. 1 (7), 699-711 (2007).
- Zougman, A., et al. Integrated analysis of the cerebrospinal fluid peptidome and proteome. J Proteome Res. 7 (1), 386-399 (2008).
- Holtta, M., et al. Peptidome analysis of cerebrospinal fluid by LC-MALDI MS. PLoS One. 7 (8), e42555 (2012).
- Holtta, M., et al. An integrated workflow for multiplex CSF proteomics and peptidomics-identification of candidate cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2015).
- Hansson, K. T., et al. Expanding the cerebrospinal fluid endopeptidome. Proteomics. 17 (5), (2017).
- Guldbrandsen, A., et al. In-depth characterization of the cerebrospinal fluid (CSF) proteome displayed through the CSF proteome resource (CSF-PR). Mol Cell Proteomics. 13 (11), 3152-3163 (2014).
- Kroksveen, A. C., Opsahl, J. A., Aye, T. T., Ulvik, R. J., Berven, F. S. Proteomics of human cerebrospinal fluid: discovery and verification of biomarker candidates in neurodegenerative diseases using quantitative proteomics. J Proteomics. 74 (4), 371-388 (2011).
- Hölttä, M., et al. A single dose of the γ-secretase inhibitor semagacestat alters the cerebrospinal fluid peptidome in humans. Alzheimers Res Ther. 8 (1), 11 (2016).
- Cao, Z., Tang, H. Y., Wang, H., Liu, Q., Speicher, D. W. Systematic Comparison of Fractionation Methods for In-depth Analysis of Plasma Proteomes. J Proteome Res. 11 (6), 3090-3100 (2012).
- Chiu, C. W., Chang, C. L., Chen, S. F. Evaluation of peptide fractionation strategies used in proteome analysis. J Sep Sci. 35 (23), 3293-3301 (2012).
- Gilar, M., Olivova, P., Daly, A. E., Gebler, J. C. Orthogonality of separation in two-dimensional liquid chromatography. Anal Chem. 77 (19), 6426-6434 (2005).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains. J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).
- Hölttä, M., et al. An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease. J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).
