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Neuroscience

म्यूलर Glia सेल सक्रियकरण में एक लेजर प्रेरित रेटिना अध-पतन और Zebrafish में मॉडल पुनर्जनन

Published: October 27, 2017 doi: 10.3791/56249
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1,2,3, 1, 1,2
1Department of Ophthalmology, University Hospital of Bern, University of Bern, 2Department of Clinical Research, University of Bern, 3Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

Summary

zebrafish रीढ़ में रेटिना अध कि उत्थान/पुनर्जनन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय पशु मॉडल है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक विधि स्थानीयकृत भीतरी रेटिना को ंयूनतम क्षति के साथ बाहरी रेटिना में खलल डालने चोट प्रेरित करने के लिए । बाद में, हम में रेटिना पुनर्जनन और म्यूलर glia प्रतिक्रिया विवो में निगरानी.

Abstract

teleost और स्तनधारियों के बीच एक आकर्षक अंतर रेटिना neurogenesis और गंभीर क्षति के बाद पुनर्जनन के लिए teleost रेटिना की आजीवन क्षमता है । zebrafish में पुनर्जनन रास्ते की जांच नए अंतर्दृष्टि लाने के लिए स्तनधारियों में रेटिना अपक्षयी रोगों के उपचार के लिए अभिनव रणनीतियों का विकास हो सकता है । इस के साथ साथ, हम एक ५३२ एनएम डायोड लेजर के माध्यम से वयस्क zebrafish में बाहरी रेटिना के लिए एक फोकल घावों की प्रेरण पर ध्यान केंद्रित किया । एक स्थानीयकृत चोट जैविक प्रक्रियाओं है कि रेटिना अध-पतन और नुकसान के क्षेत्र में सीधे उत्थान के दौरान जगह लेने की जांच की अनुमति देता है । गैर इनवेसिव ऑप्टिकल जुटना टोमोग्राफी का उपयोग (अक्टूबर), हम क्षतिग्रस्त क्षेत्र के स्थान को परिभाषित करने और vivo में बाद में पुनर्जनन की निगरानी करने में सक्षम थे । दरअसल, अक्टूबर इमेजिंग उच्च संकल्प, पार zebrafish रेटिना के अनुभागीय छवियों का उत्पादन, जानकारी है जो पहले ही ऊतकीय विश्लेषण के साथ उपलब्ध था प्रदान करते हैं । आदेश में वास्तविक समय OCT से डेटा की पुष्टि करने के लिए, ऊतकीय वर्गों प्रदर्शन किया गया और रेटिना की चोट के प्रेरण immunohistochemistry द्वारा जांच की गई के बाद reअपक्षयी प्रतिक्रिया ।

Introduction

दृष्टि शायद मनुष्य की सबसे आवश्यक भावना है और उसकी हानि का उच्च सामाजिक-आर्थिक प्रभाव पड़ता है । औद्योगिक दुनिया में, रेटिना अपक्षयी रोगों दृष्टि हानि और दृष्टिहीनता वयस्क जनसंख्या1के बीच के बहुमत के लिए खाते । रेटनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी) 20 और ६० की उंर के बीच लोगों में अंधापन के सबसे आम विरासत का कारण है, लगभग १,५००,००० लोगों को दुनिया भर में2,3प्रभावित । यह विरासत में मिली रेटिना विकारों के एक विषम परिवार है photoreceptors (पीआरएस) के प्रगतिशील नुकसान की विशेषता रेटिना वर्णक उपकला के अध-पतन के बाद और, बाद में, gliosis और इनर न्यूरॉन्स की remodeling4. रोग के पाठ्यक्रम के दो पीआर कोशिका प्रकार, आमतौर पर छड़ है, जो मंद प्रकाश में achromatic दृष्टि के लिए जिंमेदार है के साथ शुरू करने के वृद्धिशील नुकसान से समझाया जा सकता है, और शंकु, जो रंग दृष्टि और दृश्य तीक्ष्णता के लिए आवश्यक है5। एक एकल जीन दोष आरपी पैदा करने के लिए पर्याप्त है । अब तक ४५ से अधिक में १३० उत्परिवर्तनों से अधिक जीन रोग के साथ संबद्ध किया गया है6। यह रोग phenotypes बदलती है और एक कारण है कि जीन थेरेपी गैर-सामांयीकरण और इस प्रकार एक जटिल चिकित्सीय दृष्टिकोण है । इसलिए, वहाँ एक तत्काल नए सामान्य चिकित्सकीय दृष्टिकोण विकसित करने के लिए अंधा कर रही रोगों में रेटिना अध कि इलाज के लिए आवश्यक है ।

रेटिना अध: पतन अक्सर पीआर नुकसान शामिल है; इसलिए, पीआर सेल मौत रेटिना7में अपक्षयी प्रक्रियाओं की एक बानगी है । यह पहले से ही प्रदर्शित किया गया है कि पीआर सेल मौत म्यूलर glia सेल (MC) सक्रियण और8जखीरे उत्तेजित करता है । MCs, हड्डीवाला रेटिना में प्रमुख glial कोशिका प्रकार, एक बार रेटिना न्यूरॉन्स के बीच एक "गोंद" से अधिक कुछ नहीं माना जाता था. हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों से पता चला है कि MCs मात्र संरचनात्मक समर्थन से अधिक के रूप में कार्य9। विभिंन कार्यों के अलावा, MCs neurogenesis में भी भाग लेते है और10मरंमत । दरअसल, चूकने रेटिना से diffusible कारकों के जवाब में, MCs काफी glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) अभिव्यक्ति में वृद्धि. इसलिए, GFAP ्र रेटिना चोट और अध11के लिए एक द्वितीयक प्रतिक्रिया के रूप में MC सक्रियण के लिए एक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

हाल ही में, हम फोकल एक लेजर का उपयोग कर चोट के एक उपंयास अनुकूलन विकसित zebrafish (ढाणियो rerio) में रेटिना अध-पतन के लिए प्रेरित करने के लिए । फोकल चोट कुछ जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लाभप्रद है जैसे कि कोशिकाओं के घायल स्थल में प्रवास और घटनाओं है कि रेटिना पुनर्जनन12के दौरान जगह ले के सटीक समय । इसके अलावा, zebrafish क्योंकि अपने दृश्य प्रणाली और अंय रीढ़ के बीच समानता के दृश्य अनुसंधान में महत्वपूर्ण हो गया है । सकल रूपात्मक और मानव और teleost रेटिना प्रदर्शन के ऊतकीय सुविधाओं के कुछ मतभेद । तदनुसार, मानव और zebrafish रेटिना एक ही स्तरित पैटर्न में आयोजित एक ही प्रमुख सेल वर्ग होते हैं, जहां प्रकाश संवेदन photoreceptors बाहरी परत पर कब्जा है, जबकि रेटिना प्रक्षेपण ंयूरॉंस, नाड़ीग्रंथि कोशिकाओं, अंतरतम में रहते है न्यूरॉन परत, लेंस के समीपस्थ. रेटिना न्यूरॉन्स, amacrine, द्विध्रुवी, और क्षैतिज कोशिकाओं, photoreceptor और नाड़ीग्रंथि सेल परतों के बीच में स्थानीयकरण13. इसके अलावा, zebrafish रेटिना शंकु-प्रभुत्व है और इसलिए से मानव रेटिना के करीब है, उदाहरण के लिए, गहन रूप से कुतर रेटिना का अध्ययन किया । teleost और स्तनधारियों के बीच एक दिलचस्प अंतर मछली रेटिना में लगातार neurogenesis और क्षति के बाद रेटिना पुनर्जनन है । zebrafish में, MCs में अंतर कर सकते है और मध्यस्थता पुनर्जनन घायल रेटिना में14,15। चिकन में, MCs कुछ क्षमता भी फिर से सेल चक्र में प्रवेश करने के लिए और अंतर करने के लिए है । वयस्क मछली में रेटिना की चोट के बाद, MCs जनक और स्टेम कोशिकाओं की कुछ विशेषताओं को अपनाने, क्षतिग्रस्त रेटिना ऊतक के लिए पलायन और नए ंयूरॉंस16उत्पादन । जीन अभिव्यक्ति स्तनधारी MCs की रूपरेखा रेटिना progenitors के लिए अप्रत्याशित समानताएं पता चला, और चिकन में MCs की आंतरिक तंत्रिकाजन्य क्षमता के लिए सबूत, कुतर, और यहां तक कि मानव रेटिना17बढ़ रही है । फिर भी, क्यों पक्षियों और स्तनधारियों में अपक्षयी प्रतिक्रिया कम है मछली में मजबूत प्रतिक्रिया के साथ तुलना में अभी तक समझ में नहीं है । इसलिए, zebrafish में अंतर्जात मरंमत तंत्र को समझना स्तनधारियों और मनुष्यों में रेटिना पुनर्जनन उत्तेजक के लिए रणनीतियों का सुझाव हो सकता है । रेटिना अध-पतन के साथ रोगियों के उपचार के लिए एक चिकित्सीय उपकरण के रूप में MCs के अंतर्जात मरंमत तंत्र को रोजगार हमारे समाज के लिए एक उत्कृष्ट प्रभाव होता है ।

साथ ही, हम नेत्र अनुसंधान में अध/पुनर्जनन मॉडल को रोजगार के लिए आवश्यक कदम प्रदान करते हैं । हम neurosensory रेटिना में फोकल क्षति उत्प्रेरण पर पहले ध्यान केंद्रित किया, तो चोट साइट पर विकसित करने की घटनाओं की इमेजिंग पर, और अंत में आसंन MCs की भागीदारी visualizing । जनरल प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत प्रदर्शन करने के लिए आसान है और बाद में रेटिना के मूल्यांकन के लिए संभावनाओं की एक विस्तृत विविधता को खोलता है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > सभी प्रयोगों की दृष्टि और नेत्र विज्ञान (ARVO) में अनुसंधान के लिए एसोसिएशन के नेत्र और विजन अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए बयान का पालन और सरकारी अधिकारियों के संबंधित नियमों का सम्मान.

< p class = "jove_title" > 1. पशु

  1. TgBAC (gfap: gfap-GFP) zebrafish १६७ (AB) के बीच 6-9 महीने के तापमान के साथ पानी में मानक शर्तों के तहत तनाव आयु वर्ग २६.५ & #176; C और a 14/10 h light/डार्क साइकिल < सुप class = "xref" > 18 .
  2. सरकारी अधिकारियों द्वारा अनुमोदन के बाद पशु प्रयोगों के लिए शामिल संस्थाओं के पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन करें ।
< p class = "jove_title" > 2. प्रतिवर्ती प्रणालीगत संज्ञाहरण

  1. के स्टॉक समाधान तैयार एथिल 3-aminobenzoate methanesulfonate नमक (tricaine) को भंग करके ४०० मिलीग्राम tricaine पाउडर की ९७.९ मिलीलीटर में टैंक पानी और २.१ मिलीलीटर की 1 मीटर की Tris बफ़र्ड खारा (टीबीएस) । 1 M Tris (ph 9) के साथ ph ७.० को एडजस्ट करें और 4 & #176; C एक महीने तक अंधेरे में स् टोर कर ᱶ ।
    नोट: Tricaine पशु के प्राकृतिक रहने की स्थिति की तरह पानी में तैयार किया जाना चाहिए, अधिमानतः मूल टैंक पानी इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  2. टैंक पानी में स्टॉक समाधान 1:25 पतला और तुरंत उपयोग करें ।
  3. एक 10 सेमी पेट्री संज्ञाहरण समाधान के ५० मिलीलीटर युक्त पकवान में zebrafish जगह जब तक वे मोबाइल और बाहरी उत्तेजनाओं का जवाब नहीं है (लगभग 2-5 मिनट, वजन और उंर के आधार पर) ।
  4. लेजर उपचार के लिए एक कस्टम निर्मित सिलिकॉन पिन धारक को हाथ से प्रत्येक मछली हस्तांतरण (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1a ).
    सावधानी! मछली केवल 10 मिनट तक के लिए टैंक के बाहर anesthetized रह सकता है ।
  5. उपचार और/या इमेजिंग के बाद संज्ञाहरण रिवर्स करने के लिए, टैंक पानी युक्त कंटेनर में zebrafish जगह है ।
  6. वसूली का समर्थन करने के लिए, पानी में आगे और पीछे zebrafish ले जाने से गिल पर ताजा टैंक पानी का एक प्रवाह बनाने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 3. लेजर फोकल चोट पर रेटिना

< p वर्ग = "jove_content" > नोट: एक ५३२ एनएम डायोड लेजर zebrafish के रेटिना पर फोकल प्रकाश क्षति बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है । प्रयोगात्मक सेट लेजर के ऊपर वयस्क zebrafish में एक प्रतिलिपि फोकल रेटिना की चोट की स्थापना में सक्षम बनाता है ।

  1. लेजर के उत्पादन शक्ति सेट: ७० मेगावाट; एरियल व्यास: ५० & #181; एम; पल्स अवधि: १०० ms.
    सावधानी! लेजर लाइट के उपयोग के लिए उपयुक्त व्यक्तिगत संरक्षण और क्षेत्र के लेबलिंग की आवश्यकता है ।
  2. 2% की 1-2 बूंदें उपचार से पहले आंखों में सामयिक hydroxypropylmethylcellulose लागू करते है और एक २.० mm fundus लेजर लेंस का उपयोग करने के लिए लेजर ध्यान रेटिना पर बीम लक्ष्य ।
    सावधानी! hydroxypropylmethylcellulose बूंदें चिपचिपा रहे है और अगर यह गिल पर चला जाता है सांस लेने में समस्याओं का कारण हो सकता है ।
  3. जगह बाईं आंख पर चार लेजर स्पॉट ऑप्टिक तंत्रिका के आसपास और आंतरिक नियंत्रण के रूप में सही, अनुपचारित आंख का उपयोग करें ।
< p class = "jove_title" > 4. में vivo रेटिना आकृतिक

  1. की इमेजिंग 0 दिन पर, zebrafish रेटिना कल्पना सीधे उन्हें संज्ञाहरण से पुनर्जीवित किए बिना लेजर प्रेरण के बाद । अन्य सभी समय बिंदुओं पर, सामान्य संज्ञाहरण को रोजगार (खंड 2 देखें: प्रतिवर्ती प्रणालीगत संज्ञाहरण). एक कस्टम-मेड सिलिकॉन पिन होल्डर पर मैटीरियल zebrafish की जगह (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > figure 1 b, b .1 ).
  2. इष्टतम छवियां प्राप्त करने के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध hydrogel संपर्क लेंस में कटौती करने के लिए zebrafish आंख फिट (& #216; = ५.२ mm, आर = २.७० mm, केंद्र मोटाई = ०.४ mm) एक छेद पंच के माध्यम से । methylcellulose के साथ लेंस की गुफा की सतह भरें और यह कॉर्निया पर जगह है ।
  3. एक 78D गैर संपर्क भट्ठा लैंप लेंस के साथ अक्टूबर प्रणाली लैस ।
  4. ir + OCT मोड (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ) में अवरक्त (ir) छवि को ध्यान में रखते हुए नेत्रों की fundus की कल्पना करें और & #34 पर क्लिक करके ir चित्र लें; मोल & #34; बटन (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा b ) to information प्रणाली का उपयोग कर रेटिना पर लेजर स्पॉट & #39; s software.
  5. IR + OCT मोड में रेटिना परतों के एक तीन आयामी अनुभाग कल्पना और तस्वीरें क्लिक करके ले लो & #34; मोल & #34; बटन (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा बी ). बाहरी परमाणु परत में चोट की गंभीरता का निरीक्षण (केव) (अनुभाग 3 देखें: रेटिना पर लेजर फोकल चोट) इन छवियों में ।
  6. उपचार के बाद संज्ञाहरण रिवर्स करने के लिए और/या इमेजिंग जगह टैंक पानी युक्त एक कंटेनर में zebrafish ।
  7. वसूली का समर्थन करने के लिए, पानी में आगे और पीछे zebrafish ले जाने से गिल पर ताजा टैंक पानी का एक प्रवाह बनाने के लिए ।
  8. दिन 1, 3, 7, 14 और सप्ताह पर vivo इमेजिंग में कुछ समान प्रदर्शन ।
< p class = "jove_title" > 5. Hematoxylin & #38; Eosin (ज & #38; ड़) सना

  1. Euthanize zebrafish द्वारा डुबकी शीत में (4 & #176; ग) कम से कम 10 मिनट के लिए बर्फ पर संज्ञाहरण समाधान और छोटी घुमावदार enucleate के माध्यम से तुरंत आंखों संदंश ।
  2. 4 & #176 में 4% paraformaldehyde (पीएफए) में फास्फेट बफर खारा (पंजाब) में पूरी आंखों को ठीक; 20 घंटे के लिए सी और फिर निर्जलीकरण एक वर्गीकृत शराब श्रृंखला में नमूनों (5 मिनट के लिए xylene १००% दो बार, 5 मिनट के लिए १००% इथेनॉल दो बार, 3 मिनट और इथेनॉल ७०% 3 mi के लिए ९६% इथेनॉल n एक बार).
    सावधानी! पीएफए आंखों, नाक, और ऊपरी श्वसन ट्रैक करने के लिए परेशान किया जा सकता है । पीएफए एक सुविख्यात मानवी यलो और संदिग्ध जनन खतरा है.
  3. तेल में नमूनों एंबेड, 5 कट & #181; मीटर वर्गों ऑप्टिक तंत्रिका सिर के स्तर पर और उंहें कांच स्लाइड पर माउंट ।
  4. 5 मिनट के लिए ०.१% एसिड hematoxylin समाधान के साथ विखण्डित वर्गों दाग और स्लाइड डुबकी की सूई के बाद आसुत जल में दो बार स्नान हाइड्रोक्लोरिक एसिड मिश्रण में (2 मिलीलीटर 25% एचसीएल में २५० मिलीलीटर आसुत जल) और अमोनिया मिश्रण (2 मिलीलीटर 25% अमोनिया में २५० मिलीलीटर आसुत जल) । hematoxylin के विकास के बाद 3 मिनट के लिए eosin G जलीय समाधान ०.५% के साथ वर्गों दाग के लिए नल का पानी से धुंधला कम 10 min.
  5. एक्रिलिक राल बढ़ते माध्यम में निर्जलित स्लाइड माउंट और प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड का निरीक्षण ।
< p class = "jove_title" > 6. एम सी सक्रियकरण के लिए Immunohistochemistry

  1. गर्मी में प्रतिजन पुनर्प्राप्ति बफर (Tris-EDTA + ०.०५% गैर ईओण डिटर्जेंट, पीएच ९.०) 3 मिनट के लिए एक उपयुक्त स्टीमर या 10-15 मिनट के लिए एक माइक्रोवेव में और धोने के लिए 5 के साथ तीन बार टीबीएस के लिए मिन येक.
  2. एक सिलिकॉन कलम के साथ वर्गों सर्कल और जोड़ने १०० & #181; एल समाधान अवरुद्ध (टीबीएस + 10% बकरी सामान्य सीरम + 1% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, पीएच ७.६) कमरे के तापमान पर 1 h.
    3. के लिए एंटी-glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) खरगोश polyclonal एंटीबॉडी और एंटी-glutamine synthetase (जी एस) माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ
  3. दाग, दोनों एक 1:200 कमजोर पड़ने में (४० & #181; L प्रति नमूना). 4 & #176 पर एक humidified चैंबर में स्लाइड मशीन रात भर; सी । धो टीबीएस के साथ तीन बार + ०.१% के बीच 20 5 मिनट के लिए प्रत्येक.
  4. उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दृश्य खत्म । इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल एक बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी ज & #38; एल ग्रीन सेकंडरी एंटीबॉडी फॉर GFAP एण्ड ए गोट एंटी-माउस आईजीजी एच & #38; एल जी के लिए चमकीला लाल, दोनों एक 1:500 कमजोर पड़ने में कमरे के तापमान पर 1 ज.
    5. के लिए
  5. बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड माउंट DAPI और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड का निरीक्षण ।

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Representative Results

वास्तविक समय OCT: रेटिना की मरम्मत में MCs की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए, हम zebrafish रेटिना में नुकसान की एक अच्छी तरह से delineated क्षेत्र उत्प्रेरण एक लेजर चोट मॉडल का इस्तेमाल किया. नुकसान की साइट vivo OCT में पहली बार (दिन 0) के लिए के माध्यम से imaged था चोट (चित्रा 3) के बाद ६० मिनट के भीतर । मछलियों की आंख के प्रकाशिकी की भरपाई के लिए, एक कस्टम मेड कॉन्टेक्ट लेंस कॉर्निया पर रखा गया था । तुरंत लेजर उपचार के बाद, एक फैलाना हाइपर-चिंतनशील संकेत बाहरी रेटिना (तीर) के लिए स्थानीयकृत किया गया था । यह बाहरी plexiform परत (OPL) करने के लिए रेटिना pigmented उपकला (RPE) से बढ़ाया. इसी तरह का एक संकेत भी 1 दिन पर जासूसी किया गया था । 3 दिन के बाद, इस फैलाना संकेत और अधिक संगठित और घने हो गया । यह लगातार बाहरी परमाणु परत (केव) photoreceptor परत में विस्तार में देखा गया था । पहले सप्ताह (7 दिन) के बाद, वहां औसत घाव आकार में एक महत्वपूर्ण कमी थी और केवल एक छोटे हाइपर-चिंतनशील संकेत का पता लगाया गया था । 14 दिन से नवीनतम समय (6 सप्ताह) की जांच बिंदु तक शुरू, लेजर स्पॉट अब IR और OCT छवियों में दिखाई दे रहे थे ।

रेटिना अध: पतन के ऊतकीय आकलन/इस हद तक जांच करने के लिए और रेटिना अध कैनेटीक्स के उत्थान के लिए, ज & #38; ई धुंधला नुकसान प्रेरण (दिवस 0, 1, 3, 7, 14 के बाद अलग समय बिंदुओं पर कार्यरत था और सप्ताह 6) (चित्र 4) । प्रयोगों तीन मछली की तीन आंखों पर प्रदर्शन किया गया । हालांकि, इस पांडुलिपि के लक्ष्य के रूप में कोई सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था विधि का प्रदर्शन है । भीतरी परमाणु परत (आईएनएल) और केव में सूक्ष्म परिवर्तन तुरंत बाद लेजर देखा जा सकता है (जैसे, केव में मामूली सूजन और आईएनएल में कम सेलुलर अंतरिक्ष) लेजर उपचार के बाद ६० मिनट के भीतर । इस अध कि 6 हफ्तों के बाद लेजर चोट के प्रेरण के बाद किया गया था । सुघड़ परिवर्तन पीआरएस के विसंगतता के साथ और केव में और रेटिना अंतरिक्ष में एक गुहा गठन के साथ लगातार 1 दिन के बाद मनाया गया । दरअसल, 1 और 7 दिनों के बीच नुकसान क्षेत्र में केव के भीतर नाभिक का नुकसान हुआ था । अधिकतम पीआर नुकसान 3 दिन पाया गया । 14 दिनों से 6 सप्ताह के लिए शुरू, बाहरी रेटिना अपनी सामान्य आकृति विज्ञान फिर से स्थापित किया था.

रेटिना अध: पतन के दौरान Glial भागीदारी/अलग समय बिंदुओं पर MC सक्रियण का आकलन करने के लिए (दिन 0, 3, 14) रेटिना पुनर्जनन की प्रेरण के बाद, हम Glial सेल मार्करों जी एस के लिए immunohistochemical विश्लेषण प्रदर्शन किया और GFAP (चित्र 5) । प्रयोगों फिर मात्रात्मक विश्लेषण के बिना तीन मछली की तीन आंखों पर प्रदर्शन किया गया । जी एस extracellular ग्लूटामेट के स्तर को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और विशेष रूप से MC सोमा और उसकी प्रक्रियाओं19,20में व्यक्त माना जाता है । GFAP बुढ़ापे के दौरान विनियमित है और जब रेटिना क्षतिग्रस्त या तनाव में है । यह MC अंत में स्थानीयकृत है-पैर और प्रक्रियाओं21। कमजोर GFAP अभिव्यक्ति में भी घायलों के भीतरी भाग में पाया गया था-कंट्रोल रेटिना ्र अन्य glial कोशिका प्रकार, जैसे, astrocytes. पीआर बाहरी खंडों के autofluorescence को भी केव में संकेत प्रदान किए गए लेकिन यह स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित किया जा सकता है । GFAP संकेत दिन में अनियमित था 3 के बाद चोट । इस प्रकार, विश्लेषण 3 दिन में प्रदर्शन के बाद लेजर उपचार GFAP-सकारात्मक MCs केवल रेटिना के केव में चोट साइट के भीतर दिखाया । 14 दिन से, पुनर्जनन काफी हद तक पूरा हो गया था और GFAP संकेत नुकसान क्षेत्र में आधारभूत स्तर को downregulated था । GFAP के विपरीत जीएस एक्सप्रेशन के स्तर में कोई काफी बदलाव नहीं हुआ । हालांकि, वहां चोट के स्थल पर जी एस के एक स्थानीयकृत downregulation गया है हो सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: zebrafish रेटिना की लेजर चोट के प्रेरण के लिए सेटअप और अक्टूबर विश्लेषण के बाद । (क) उपचार से पहले लेसर प्रणाली की व्यवस्था. (A .1) बस लेजर बीम के आवेदन करने से पहले जगह में fundus संपर्क लेंस के साथ सिलिकॉन पिन धारक पर रखा Zebrafish । (ख) इमेजिंग से पहले OCT सिस्टम की व्यवस्था । (ख .1) Zebrafish अक्टूबर के माध्यम से नुकसान साइटों का पता लगाने से पहले 78D भट्ठा लैंप लेंस से पहले रखा इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: IR और OCT छवियां प्राप्त करने के लिए सेटअप । (क) इमेजिंग के दौरान सॉफ्टवेयर विंडो का स्क्रीनशॉट । आईआर और OCT मोड दर्शाया गया है । (ख) छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल पैनल का अवलोकन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: IR (बाएं) और अक्टूबर (सही) अलग समय बिंदुओं पर एक ही आंख में रेटिना के घायल और घायल साइटों की छवियों (दिन 0, 1, 3, 7, 14 और 6 सप्ताह) लेजर प्रेरित रेटिना अध: पतन के बाद. IR छवियों में, एक हरे रंग का डिब्बा रेटिना का हिस्सा है कि विश्लेषण किया जा रहा है और हरी लाइन रेटिना पर अक्टूबर छवियों के स्थान से पता चलता है इंगित करता है । तीर लेजर स्थानों OCT. स्केल बार में हाइपर-चिंतनशील संकेतों के रूप में पता चला की साइटों का संकेत = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ज & #38; घायलों की ई धुंधला और अलग समय अंक (दिन 0, 1, 3, 7, 14 और 6 सप्ताह) में contralateral घायल zebrafish आंख लेजर प्रेरित रेटिना अध: पतन के बाद । जीसी, नाड़ीग्रंथि सेल परत; आईएनएल, भीतरी परमाणु परत; केव, बाहरी परमाणु परत । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: MC सक्रियण का Immunohistochemical पता लगाना. GFAP (हरा) और जी एस (लाल) में दाग और घायल zebrafish रेटिना अलग समय बिंदुओं पर (दिन 0, 3, 14) लेजर प्रेरित रेटिना अध... केव में ग्रीन सिग्नल पीआर ओ के autofluorescence के कारण हैऊतर सेगमेंट । सेल नाभिक DAPI (नीला) के साथ दाग रहे हैं । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

रेटिना पुनर्जनन/zebrafish में अध कि cytotoxin-मध्यस्थ सेल मौत22, यांत्रिक चोट23, और थर्मल चोट24के रूप में विभिन्न दृष्टिकोण से जांच की गई है । हम एक ५३२ एनएम डायोड लेजर zebrafish रेटिना को नुकसान कार्यरत हैं । इस प्रकार, हमारे मॉडल कई लाभ प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, हम तेजी से बाहरी रेटिना में स्थानीयकृत चोट के एक अच्छी तरह से परिभाषित क्षेत्र बनाया, विशेष रूप से पीआरएस परत में. इसके अलावा, इस प्रयोगात्मक सेट अप क्षति के बड़े क्षेत्रों का उत्पादन करने के लिए अंय जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन संशोधित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, हानिकारक है Bruch झिल्ली धमनियां neovascularization प्रेरित करने के द्वारा । वहाँ न्यूनतम संपार्श्विक क्षति और अपक्षयी प्रतिक्रिया के समय ठीक है और reproducibly संग्राहक किया जा सकता है ।

समय के साथ phenotypical परिवर्तन का पालन करने के लिए, हम हीडलबर्ग Spectralis प्रणाली और हीडलबर्ग नेत्र एक्सप्लोरर सॉफ्टवेयर कार्यरत हैं । इस प्रकार, fundus IR इमेजिंग zebrafish में विशेष रूप से उपयोगी हो पाया गया । fundus autofluorescence (वायुसेना), जो लेजर स्पॉट और आसपास के क्षेत्र के बीच कम विपरीत से पता चलता है के विपरीत, क्षतिग्रस्त साइटों आईआर इमेजिंग द्वारा स्थानीयकरण करने के लिए आसान कर रहे हैं । इससे हम बदलाव का पता लगाने और वीवो मेंपुनर्जनन की निगरानी कर सकते हैं, जो वायुसेना मोड के साथ संभव नहीं होगा । जैसा कि पहले25रिपोर्ट, OCT zebrafish रेटिना में अपक्षयी/अपक्षयी प्रक्रियाओं की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारे मॉडल में, रेटिना लेजर चोट केव में एक हाइपर-चिंतनशील बैंड के रूप में पता लगाया गया था (चित्रा 3), जो स्तनधारियों में सूचित किया गया है के समान है26. पुनर्जनन के दौरान, हाइपर चिंतनशील संकेत कमी आई जब तक यह पूरी तरह से 14 दिन में गायब हो गया ।

अक्टूबर छवियों लेजर घावों के भीतर देखा रूपात्मक परिवर्तन (चित्रा 4) के साथ संबंधित थे. फैलाना हाइपर-अक्टूबर छवियां (दिवस 0) में चिंतनशील संकेत लेजर उपचार के बाद 1 घंटे के भीतर zebrafish euthanized के आईएनएल में देखा के बाद लेजर परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है । सूक्ष्म और अच्छी तरह से delineated हाइपर-चिंतनशील संकेत 3 दिन में पता चला रॉड हानि के कारण केव में गुहा गठन करने के लिए मेल खाती है । 14 दिन से शुरू, दोनों अक्टूबर और ऊतकीय विश्लेषण की पुष्टि करते है कि बाहरी रेटिना फिर से अपनी सामांय आकृति विज्ञान स्थापित किया था ।

वर्तमान अध्ययन में, हम भी रेटिना पुनर्जनन (चित्रा 5) के दौरान MC प्रतिक्रिया का मूल्यांकन किया. कई समूहों को पहले से ही glial कोशिकाओं के सक्रियकरण की जांच की है, विशेष रूप से MCs की, क्षति के लिए एक प्रारंभिक अपक्षयी प्रतिक्रिया के रूप में । अधिक विशेष रूप से, उंहोंने सुझाव दिया कि pathophysiological MC सक्रियण MCs प्रेरित करने के लिए स्टेम सेल विशेषताओं को अपनाने, नए कार्य कोशिका प्रकार है कि रेटिना27के क्षतिग्रस्त क्षेत्रों में एकीकृत किया जा सकता है की एक अंतर्जात स्रोत प्रदान कर सकते हैं । के रूप में की उंमीद है, हमने पाया है कि रेटिना लेजर चोट GFAP के ऊपर से संकेत के रूप में एम सी सक्रियण उत्तेजित । दरअसल, वृद्धि हुई GFAP अभिव्यक्ति उल्लेखनीय 3 दिनों के बाद चोट का पता चला था और नुकसान क्षेत्र के लिए प्रतिबंधित किया गया था । 14 दिन से शुरू होकर पुनर्जनन काफी हद तक पूरा हो गया था और GFAP सिग्नल को नुकसान के क्षेत्र में आधारभूत स्तर पर downregulated गया था । इस प्रकार, हम प्रदर्शन किया है कि MCs रेटिना पुनर्गठन में एक सक्रिय भूमिका निभाते हैं, और संभावित पुनर्जनन, चोट के बाद ।

अंत में, लेजर प्रेरित रेटिना अध कि पुनर्जनन/मॉडल zebrafish रेटिना के लिए तेजी से और फोकल क्षति का उत्पादन करने के लिए एक बहुमुखी उपकरण है और निम्नलिखित पुनर्जनन गैर इनवेसिव अक्टूबर इमेजिंग द्वारा visualized किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, हम दिखाने में सक्षम थे कि लेजर रेटिना अध-पतन MC सक्रियण के साथ है और कि आगामी gliosis पुनर्जनन पर उलट है । हालांकि, शामिल किए गए कक्ष प्रकारों (उदा., microglia, मैक्रोफेज) और मार्ग की विस्तृत जांच की जानी चाहिए । महत्वपूर्ण संशोधनों की जरूरत हो सकती है, विशेष रूप से MCs के लाइव ट्रैकिंग के लिए बेहतर समझते है कि वे कैसे अपक्षयी प्रक्रिया के दौरान व्यवहार (जैसे, आईएनएल में अपने मूल स्थान से बाहरी रेटिना में प्रवास, विशेष रूप से पीआरएस परत में) और पीआर कोशिकाओं के प्रति उनके विभेद । वैकल्पिक रूप से, प्रकाश नुकसान प्रतिमान के लिए दोनों रॉड और शंकु पीआरएस28के व्यापक और लगातार नुकसान पैदा किया जा सकता है । हालांकि, वर्णित मॉडल का लाभ एक और अधिक परिभाषित चोट क्षेत्र है जहां एक चूकने photoreceptors और सक्रिय MCs के बीच स्थानीय बातचीत का अध्ययन कर सकते हैं ।

सामांय में, हम मानते है कि मॉडल को बेहतर संवेदी रेटिना में अपक्षयी/अपक्षयी प्रक्रियाओं को समझने में मदद मिलेगी और स्तनधारी प्रणाली के साथ इन घटनाओं की तुलना सक्षम हो सकता है । यह भी सहज प्रतिरक्षा प्रणाली और neuroactive पदार्थों के प्रभाव के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है । भविष्य में, एक इन परिणामों का उपयोग करने के लिए चूकने वाले मानव दृश्य प्रणाली को संशोधित करने में सक्षम हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम धंयवाद मार्टिन Zinkernagel, एमडी, पीएचडी और मरियम Reisenhofer, उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मॉडल और फेडरिका Bisignani की स्थापना पर उसे वैज्ञानिक इनपुट के लिए पीएचडी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acid hematoxylin solution Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 2852
Albumin Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland A07030
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 5470
Dako Pen Dako, Glostrup, Danmark S2002
DAPI mounting medium Vector Labs, Burlingame, CA, USA H-1200
Eosin G aqueous solution 0.5% Carl Roth, Arlesheim, Switzerland X883.2
Ethanol Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 2860
Ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland ED
Eukitt Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 3989
Goat anti-rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 488 Life Technologies, Zug, Switzerland A11008
Goat anti-mouse IgG H&L Alexa Fluor® 594 Life Technologies, Zug, Switzerland A11020
Goat normal serum Dako, Glostrup, Danmark X0907
Hydrogel contact lens Johnson & Johnson AG, Zug, Switzerland n.a. 1-Day Acuvue Moist
Hydroxypropylmethylcellulose 2% OmniVision, Neuhausen, Switzerland n.a. Methocel 2%
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland A5040 Tricaine, MS-222
Visulas 532s Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Germany n.a. 532 nm laser
Mouse anti-GS monoclonal antibody Millipore, Billerica, MA, USA MAB302
HRA + OCT Imaging System Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany n.a. Spectralis
Heidelberg Eye Explorer Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany n.a. Version 1.9.10.0
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5368
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5368
Rabbit anti-GFAP polyclonal antibody Invitrogen, Waltham, MA, USA 180063
Silicone pin holder Huco Vision AG Switzerland n.a. Cut by hand from silicone pin mat of the sterilization tray accordingly.
Slit lamp BM900 Haag-Streit AG, Koeniz, Switzerland n.a.
Slit lamp adapter Iridex Corp., Mountain View, CA, USA n.a.
Superfrost Plus glass slides Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany 10149870
TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain KIT, Karlsruhe, Germany 15204 http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3
Tris buffered saline (TBS) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5912
Tween 20 Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P1379
78D non-contact slit lamp lens Volk Optical, Mentor, OH, USA V78C
Xylene Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 534056
Ocular fundus laser lens Ocular Instruments, Bellevue, WA, USA OFA2-0
2100 Retriever Aptum Biologics Ltd., Southampton, United Kingdom R2100-EU Steamer

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References

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म्यूलर Glia सेल सक्रियकरण में एक लेजर प्रेरित रेटिना अध-पतन और Zebrafish में मॉडल पुनर्जनन
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Conedera, F. M., Arendt, P., Trepp, C., Tschopp, M., Enzmann, V. Müller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish. J. Vis. Exp. (128), e56249, doi:10.3791/56249 (2017).

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