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Bioengineering

कुशल पीढ़ी और फीडर का संपादन-CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग मानव अग्नाशय कोशिकाओं से मुक्त IPSCs

Published: November 8, 2017 doi: 10.3791/56260
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2,4
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland, 2Animal Bioscience and Biotechnology Laboratory, ARS, USDA, 3NIH Stem Cell Unit, Bethesda, National Institutes of Health, 4RenOVAte Biosciences Inc

Summary

इस प्रोटोकॉल विस्तार से पदचिह्न-मुक्त प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) में मानव अग्नाशय कोशिकाओं से फीडर मुक्त शर्तों, CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins और संशोधित के लक्षण वर्णन का उपयोग कर संपादन द्वारा पीछा की पीढ़ी का वर्णन एकल सेल क्लोन ।

Abstract

भ्रूण और प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाएं स्वयं को नवीनीकृत और शरीर के कई प्रकार के कोशिका में अंतर कर सकते हैं । pluripotent कोशिकाओं को इस प्रकार reअपक्षयी चिकित्सा में अनुसंधान के लिए प्रतिष्ठित हैं और नेत्र रोगों, मधुमेह, हृदय रोगों, और अन्य विकारों के लिए नैदानिक परीक्षणों में वर्तमान में कर रहे हैं । CRISPR/कैस प्रणाली सहित जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों में हाल ही में अग्रिमों के साथ युग्मित विशेष कोशिका प्रकार में अंतर करने की क्षमता विभिंन अनुप्रयोगों के लिए iPSC के जीनोम सिलाई के लिए अतिरिक्त अवसर प्रदान की है रोग मॉडलिंग सहित, जीन थेरेपी, और भेदभाव के रास्ते पक्षपात, कुछ नाम है । उपलब्ध संपादन प्रौद्योगिकियों के अलावा, CRISPR/Cas9 से स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes साइट-युकेरियोटिक जीनोम के विशेष संपादन के लिए पसंद के एक उपकरण के रूप में उभरा है । CRISPRs आसानी से सुलभ हैं, सस्ती, और अत्यधिक कुशल इंजीनियरिंग लक्षित संपादन में । प्रणाली एक Cas9 nuclease और एक गाइड अनुक्रम की आवश्यकता है (20-मेर) जीनोमिक लक्ष्य के लिए विशिष्ट abutting एक 3-न्यूक्लियोटाइड "NGG" protospacer-संनिकट-आकृति (पाम) Cas9 को लक्षित करने के लिए वांछित जीनोमिक लोकस के साथ, एक सार्वभौमिक Cas9 बाध्यकारी अनुरेखक आरएनए के साथ ( एक साथ एक गाइड आरएनए या sgRNA कहा जाता है) । यहाँ हम फीडर की कुशल पीढ़ी के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल-स्वतंत्र और पदचिह्न-मुक्त iPSC और Cas9 ribonucleoprotein (RNP) परिसरों का उपयोग iPSC के जीनोम संपादन के लिए तरीके का वर्णन प्रस्तुत करते हैं । जीनोम संपादन प्रोटोकॉल प्रभावी है और आसानी से Cas9 प्रोटीन के साथ एक से अधिक लक्ष्य के लिए पूर्व जटिल sgRNAs द्वारा और एक साथ कोशिकाओं में पहुंचाने के लिए मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है । अंत में, हम वांछित संपादन के साथ iPSCs की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए एक सरलीकृत दृष्टिकोण का वर्णन । एक साथ लिया, रेखांकित रणनीतियों के लिए कई गुना अनुप्रयोगों के लिए iPSC की पीढ़ी और संपादन को कारगर बनाने की उंमीद कर रहे हैं ।

Introduction

reprogramming कारकों के व्यक्त द्वारा pluripotent राज्य के लिए मानव दैहिक कोशिकाओं के reprogramming रोग मॉडलिंग, अपक्षयी चिकित्सा, और नशीली दवाओं के विकास में आवेदन के साथ स्टेम सेल अनुसंधान में क्रांति ला दिया है । कई गैर वायरल reprogramming तरीकों reprogramming कारकों और सृजन iPSCs के वितरण के लिए उपलब्ध हैं, लेकिन प्रक्रिया गहन श्रम है और नहीं बहुत कुशल1। वायरल तरीकों, हालांकि कुशल, वायरस एकीकरण और tumorigenicity2,3,4की समस्याओं के साथ जुड़े रहे हैं । इस पांडुलिपि में, हम reprogramming कारकों को वितरित करने और पदचिह्न-मुक्त iPSC लाइनों की स्थापना के लिए cytoplasmic सेंडाइ वायरस के उपयोग की रिपोर्ट है कि उनके जीनोम5में किसी भी वायरल वेक्टर दृश्यों के एकीकरण की कमी है । सेंडाइ वायरस एक आरएनए वायरस है कि सेल कोशिका के बाहर पतला है ~ संक्रमण के बाद 10 मार्ग और बहुतायत में reprogramming कारकों का उत्पादन, तेजी से और कुशल reprogramming6,7के लिए अग्रणी । स्थापित iPSCs तो आसानी से फीडर मुक्त माध्यम से संक्रमण हो सकता है फीडर कोशिकाओं8के रूप में माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) के उपयोग से बचने के लिए ।

इस प्रकाशन में, सेंडाइ वायरस मध्यस्थता reprogramming के अलावा, हम भी संपादन iPSCs, जो अनुसंधान के लिए वांछित आनुवंशिक संशोधनों के साथ असीमित मानव कोशिकाओं की आपूर्ति करने की क्षमता है के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन । हम iPSCs के संशोधन के लिए CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी का इस्तेमाल किया है, जो अब दस्तक सहित आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है ins और नॉकआउट, बड़े पैमाने पर जीनोमिक विलोपन, जीन डिस्कवरी के लिए परित पुस्तकालय स्क्रीनिंग, आनुवंशिक इंजीनियरिंग की कई मॉडल जीवों, और जीन थेरेपी9,10,11. इस तकनीक में स्ट्रेप्टोकोकस pyogenesके परिसरों का गठन शामिल है-व्युत्पंन Cas9 nuclease और 20-मेर गाइड RNAs है कि आधार के माध्यम से लक्ष्य मांयता प्राप्त-जीनोमिक लक्ष्य अनुक्रम से सटे 3 ' न्यूक्लियोटाइड protospacer आसंन के साथ बांधना आकृति (पाम) अनुक्रम । Cas9 nuclease एक डबल असहाय तोड़ लाती है ~ पाम साइट है, जो बाद में गैर द्वारा मुख्य रूप से मरंमत मुताबिक़ अंत में शामिल होने से 3 न्यूक्लियोटाइड (NHEJ) मार्ग सम्मिलन या खुले पढ़ने के फ्रेम में हटाने के लिए अग्रणी, और इस तरह कार्यात्मक 12जीन के नॉकआउट ।

हमारे सुधार प्रोटोकॉल मानव अग्नाशय कोशिकाओं की संस्कृति के लिए विवरण, mitotically निष्क्रिय माउस भ्रूण fibroblasts (MEFs) पर उनके reprogramming के लिए reprogramming के उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए, फीडर मुक्त संस्कृति के बाद अनुकूलन शामिल Matrigel पर, स्थापित iPSCs के लक्षण वर्णन, CRISPR निर्देशित आरएनए डिजाइन और तैयारी, RNP परिसरों के रूप में iPSCs में प्रसव, एकल कोशिका संपादित iPSCs की क्लोनिंग लाइनों उत्पन्न करने के लिए छंटाई, आसान स्क्रीनिंग और संपादन की पहचान, और के लक्षण वर्णन एकल सेल क्लोन । जीनोमिक हटाए गए Cas9 प्रोटीन और दो CRISPR sgRNA RNP परिसरों की शुरूआत से इस अध्ययन में कुशलतापूर्वक उत्पंन किया गया डबल असहाय टूटता (DSBs) और हस्तक्षेप खंड को हटाने के लिए प्रेरित । इस विधि को खुले पढ़ने के फ्रेम में विलोपन पैदा करने के लिए दो गाइड के उपयोग पर कैपिटल, NHEJ की उच्च दक्षता क्लोन की जरूरत है कि कम संख्या के लिए अग्रणी है, और स्वचालित केशिका द्वारा क्लोन के आसान प्रारंभिक स्क्रीनिंग ट्रो इकाई, अंश विश्लेषक । मानव स्टेम सेल आधारित रोग मॉडल उत्पंन करने के लिए इन प्रभावी जीनोम संपादन तरीकों को जल्द ही किसी भी स्टेम सेल प्रयोगशाला में एक मानक और नियमित दृष्टिकोण बन जाएगा । अंत में, सटीक जीनोम संपादन यह स्टेम सेल रोग मॉडलिंग से परे जाना संभव कर देगा और संभावित उत्प्रेरित सेल आधारित चिकित्सा मदद कर सकता है ।

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Protocol

< p वर्ग = "jove_title" > 1. reprogramming प्रोटोकॉल

  1. पीढ़ी मानव iPSC प्राथमिक मानव अग्नाशय कोशिकाओं से
    1. कोट एक 6-अच्छी तरह से थाली के साथ १.५ मिलीग्राम/एमएल ठंडा कोलेजन और यह ३७ पर जेल के लिए अनुमति दें & #176; ग के लिए 1 ज.
    2. प्लेट जल्दी बीतने Prigrow III मध्यम में मानव प्राथमिक अग्नाशय कोशिकाओं (~ 1-१.५ & #215; 10 5 cells) पर एक कोलेजन लेपित 6-अच्छी तरह से थाली पर दिन-2 प्राप्त करने के लिए लगभग २.५ & #215; 10 5 कोशिकाओं या कम से ६०% के दिन पर अच्छी तरह से प्रभावित transduction (day 0). पहले अध्ययन के लिए, थाली कम से 2-3 कुओं को एक अच्छी तरह से 0 दिन पर वांछित प्रवाह के साथ मिलता है । कक्षों की गणना करने के लिए नियंत्रण के रूप में एक अच्छी तरह से उपयोग करें ।
      3. transduction के दिन पर
    3. (0 दिन), एक अच्छी तरह से transduced होने के लिए एक पानी के स्नान में Prigrow III मध्यम के 1 मिलीलीटर गर्म । फसल एक नियंत्रण से अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर में 10% FBS मध्यम trypsin/EDTA की 1 मिलीलीटर का उपयोग कर के लिए 5 मिनट या जब तक कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सेल गिनती करते हैं । 10% FBS मीडियम बनाने के लिए इसमें DMEM, 10% FBS, 1% L-Glutamine, 1% सोडियम पाइरूवेट और 1% गैर-ज़रूरी अमीनो एसिड्स एड करें ।
    4. गणना और सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की व्यवहार्यता की जांच करें और सेल संख्या और वायरस titer के आधार पर लक्ष्य तक पहुंचने के लिए आवश्यक प्रत्येक वायरस की मात्रा की गणना । का प्रयोग करें संक्रमण की बहुलता (मुि) कोस की = 5, hc-Myc = 5 और hKlf4 = 3 अग्नाशय कोशिकाओं के लिए.
    5. गल में सेंडाइ वेक्टर ट्यूबों का एक सेट-८० & #176; सी बर्फ पर भंडारण और ध्यान से तीन सेंडाइ वेक्टर ट्यूबों के प्रत्येक की गणना की मात्रा को जोड़ने के लिए Prigrow III मध्यम के 1 मिलीलीटर, पूर्व गरम करने के लिए ३७ & #176; C. पिपेट धीरे समाधान मिश्रण करने के लिए । एक में अच्छी तरह से एक 6-अच्छी तरह से थाली सेंडाइ वायरल वैक्टर के साथ transducing के लिए काफी है recelled उत्पंन करने के लिए ।
    6. महाप्राण कोशिकाओं से Prigrow III माध्यम है, और धीरे से कोशिकाओं से युक्त कुओं को reprogramming वायरस मिश्रण जोड़ें । एक ३७ & #176 में रातोंरात कोशिकाओं की मशीन; सी humidified वातावरण के साथ सी मशीन 5% कं 2 .
    7. ध्यान से कोशिकाओं पर वायरस मिश्रण त्यागें और ताजा Prigrow III मध्यम अगले दिन के साथ की जगह, transduction के बाद 24 ज । संस्कृति 5 डी के लिए कोशिकाओं और मध्यम हर वैकल्पिक दिन बदल जाते हैं ।
      8. 5 दिन पर
    8. , तैयार MEFs पर ०.१% जिलेटिन पूर्व लेपित 10 सेमी संस्कृति व्यंजन (१.३ x10 6 कोशिकाओं/ 4 दिन तक T175 कुप्पी में MEFs बढे और फिर 5 दिन तक, कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए ६,००० राड से एक & #947;-कोशिकाओं को बोने से पहले विकिरण स्रोत < सुप वर्ग = "xref" > १३ या वाणिज्यिक MEF स्रोत का उपयोग करें.
      9. 6 दिन पर
    9. , transduced कोशिकाओं को अलग करने के लिए 10 मिनट के लिए सेल टुकड़ी समाधान के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें, प्लेट रॉक अवरोध करनेवाला के साथ Prigrow III मध्यम में MEF व्यंजन पर उन सभी को (5 मिमी शेयर, 10 & #181; एम अंतिम) और एक ३७ में रात भर की मशीन & #176; सी एक humidified atmosphe के साथ मशीन के री 5% कं 2 .
    10. अगले दिन Prigrow III मीडियम को hESC मीडियम में बदल दीजिये. hESC के ५०० मिलीलीटर बनाने के लिए, DMEM/एफ 12, 20% (v/v) नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट (KOSR), 5 एनजी/एमएल bFGF जोड़ें; 1 मिमी l-glutamine; १०० & #181; m यक अमीनो अम्ल और १०० & #181; m 2-mercaptoethanol. मध्यम धीरे से हर दिन अब बदलें ।
    11. कक्ष के झुरमुट या फिर से आयोजित होने वाले कक्षों का संकेत करने वाली कालोनियों के उद्भव के लिए नियमित रूप से प्लेटों का निरीक्षण करते हैं । रूपांतरित कोशिकाओं cobblestone आकृति विज्ञान और बड़े नाभिक और nucleoli के साथ क्लोनी समुच्चय फार्म । मार्क संभावित & #39; iPSC & #39; कालोनियों और विकास के लिए उन्हें नियमित रूप से जांच करें ।
    12. लगभग चार सप्ताह के बाद transduction के रूप में कालोनियों उठा या स्थानांतरण के लिए तैयार हैं, १.३ x 10 6 कोशिकाओं/एकल कालोनियों के हस्तांतरण के लिए पहले के रूप में जिलेटिन पूर्व लेपित थाली चढ़ाना द्वारा 24-अच्छी तरह से MEF प्लेटें तैयार ।
      1. यह विश्लेषण के प्रमाण पत्र पर कमजोर पड़ने कारक के आधार पर Matrigel द्वारा मैट्रिक्स झिल्ली ( जैसे , aliquoting) तैयार करते हैं । DMEM के 25 मिलीलीटर के लिए एक aliquot जोड़ें/एफ-12 कोट करने के लिए चार 6-अच्छी तरह से प्लेटें (1 मिलीलीटर/) और कमरे के तापमान पर गर्मी (आरटी) उपयोग करने से पहले कम से 1 ज । मैन्युअल रूप से 12-24 कालोनियों का उपयोग कर एक बाँझ पिपेट-टिप उन्हें महाप्राण करने के लिए और MEF प्लेट्स पर हस्तांतरण में ५०० & #181; hESC माध्यम के एल.
      2. महाप्राण में मीडिया को धीरे से बाधित करने या कॉलोनियों के अलावा तोड़ने के लिए । इसके अलावा मैट्रिक्स झिल्ली लेपित 24-अच्छी तरह से प्लेटों पर 24-48 कालोनियों उठाओ । झिल्ली लेपित प्लेटों के लिए, 24 घंटे के लिए mTeSR1 (10 & #181; एम रॉक अवरोधक) के साथ पूरक का उपयोग करें और हर दिन बदल जाते हैं । उठा कालोनियों के 6-10 घ के भीतर, वे नए 24-well और/या 12-well & #160 के लिए हस्तांतरित किया जा करने के लिए तैयार हैं, क्लोनल विस्तार के लिए झिल्ली प्लेटें ।
    13. यदि जरूरत हो तो MEFs पर कालोनियों को अलग कर 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase 20 मिनट के लिए, hESC/mTeSR1 के साथ दो बार धोने और & #160 के लिए स्थानांतरण; झिल्ली लेपित 12-या 24-अच्छी तरह से प्लेटें । अगर वहां काफी मजबूत कालोनियों कदम 1.1.12 से मैट्रिक्स झिल्ली पर बढ़ रहे हैं, MEFs पर कालोनियों फ्रीज निर्माता & #39; एस दिशानिर्देश के अनुसार iPSC ठंड मीडिया का उपयोग कर ।
    14. चरण 1.1.12 में झिल्ली पर चढ़ाया मजबूत कालोनियों अलग करें ५०० & #181 का उपयोग कर; dispase के एल के लिए 20 मिनट और प्लेट पर फिर से मैट्रिक्स झिल्ली लेपित 12-अच्छी तरह से प्लेटें. मैन्युअल रूप से किसी भी विभेदित कोशिकाओं या दूषित MEF फीडर कोशिकाओं को परिमार्जन करने के लिए pluripotent क्लोन पर समृद्ध करने के लिए & #160; झिल्ली.
    15. के बाद क्लोन का विस्तार 6-8 d पर बढ़ कर & #160; झिल्ली लेपित प्लेटें dissociating द्वारा dispase समाधान के साथ पहले के रूप में और ताजा & #160 पर छोटे सेल समुच्चय चढ़ाना; झिल्ली लेपित 6-या 12-अच्छी तरह से थाली । बदल mTeSR1 मध्यम दै. alkaline फॉस्फेट धुंधला, pluripotency मार्करों के लिए immunostaining (OCT3/4 और NANOG), FACS सतह मार्करों और भेदभाव की परख के pluripotent विश्लेषण द्वारा पुनर्संगठित क्लोनों की विशेषता है । बढ़ो और संस्कृति झिल्ली पर क्लोन CRISPR संपादन सहित सभी परख के लिए प्लेट लेपित जब तक अंय कोटिंग समाधान विशेष रूप से उल्लेख किया है ऊपर समझाया ।
  2. के लक्षण वर्णन मानव iPSCs
    1. alkaline फॉस्फेट धुंधला
      नोट: एक वाणिज्यिक किट यहां प्रयोग किया जाता है । सामग्री तालिका देखें ।
      1. प्लेट ख्यात ह्यूमन iPSCs 24-वेल प्लेट और कल्चर ऑन 4-5 डी फॉर डेली मीडिया चेंज के साथ.
      2. धुंधला प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए, संस्कृति माध्यम महाप्राण और ०.०५% के बीच 20 (PBST) के साथ 1x पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें ।
      3. कोशिकाओं पर किट में फिक्स समाधान के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और आरटी पर 2 से 5 मिनट के लिए महाप्राण ठीक समाधान और फिर PBST के साथ तय कोशिकाओं धो लो । कुएँ को सूखने न दें.
      4. मिश्रण द्वारा नए सिरे से तैयार एपी सब्सट्रेट समाधान के ०.५ मिलीलीटर जोड़ें समाधान A, B और C. गर्मी कोशिकाओं अंधेरे में (पन्नी के साथ या एक अंधेरे कंटेनर में लिपटे) कमरे के तापमान पर 5 से 15 मिनट के लिए.
        नोट: बारीकी से रंग बदलने की निगरानी और जब रंग गैर विशिष्ट धुंधला से बचने के लिए उज्ज्वल बदल जाता है प्रतिक्रिया बंद करो.
      5. एपी सब्सट्रेट समाधान aspirating द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो और दो बार कुओं धो 1x पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ ।
      6. माइक्रोस्कोप के तहत कालोनियों का निरीक्षण और 4x या 10x एक कैमरा के साथ किसी भी उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर आवर्धन पर छवियों पर कब्जा ।
    2. Immunostaining
      1. प्लेट मानव iPSCs 24 में अच्छी तरह से थाली और संस्कृति दैनिक मीडिया परिवर्तन के साथ 4-5 डी के लिए.
      2. वॉश सेल एक बार पंजाबियों के साथ संक्षेप में और पंजाब में 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ 20 मिनट के लिए फिक्स ।
        4. पर पंजाब के साथ 10 मिनट (3x, 10 मिनट) के लिए तीन बार धो
      4. संतृप्त गैर 10% सामांय बकरी या गधा सीरम (एन एस, पशु माध्यमिक एंटीबॉडी पर निर्भर करता है के साथ विशिष्ट साइटों में) पंजाब में आरटी में ४० मिनट के लिए उठाया गया था । केवल intracellular epitopes के लिए, permeabilize.
        5. के लिए (tx/पंजाब) में ०.३% tx-१०० शामिल
      5. वॉश
        6. पर पंजाबियों के साथ 3x5 मिन
      6. OCT4, NANOG, TUJ1, NKX2-5 और SOX17 एंटीबॉडी में 5% एन एस के एक ताजा समाधान में पतला और आरटी पर 2 ज के लिए या रात भर में 4 & #176; C.
        7. RT. पर पंजाबियों के साथ 5 मिनट के लिए 3x धो
      8. कमजोर उपयुक्त माध्यमिक Alexa Fluor ४८८ या ५६८ एंटीबॉडी में 5% एनएस/पंजाब और गर्मी कोशिकाओं के लिए 1 ज पर RT.
      9. 5 मिनट के लिए RT.
        10. पर 3x धो लें
      10. 1 के लिए पंजाब में DAPI के साथ मशीन0 मिनट आरटी पर 5 मिनट के लिए और धो 2x एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए तस्वीरें ले लो ।
    3. प्रतिदीप्ति-आपन कोशिका छँटाई (FACS)
      1. प्लेट मानव iPSCs एक 6-खैर प्लेट और कल्चर में जब तक कालोनियों में ८०% धाराप्रवाह (कम से कम 10 5 कोशिकाओं/sample) दैनिक mTeSR1 माध्यम परिवर्तन के साथ हो ।
        2. प्रयोग के दिन पर
      2. , कोशिकाओं को अलग और एक एकल सेल निलंबन के लिए अलग के रूप में ऊपर समझाया प्रोटोकॉल में । 10% FBS मीडियम से धो लें ।
        3. सतह मार्करों के लिए
      3. , 10% FBS मध्यम की 0.5-1 मिलीलीटर में reसस्पेंड और बर्फ पर रखें.
        4. intracellular मार्करों के लिए
      4. , 4% पीएफए/पंजाबियों और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन के 1 मिलीलीटर में reसस्पेंड । 10% FBS मीडियम से धो लें । ०.१% TX/पंजाब और बर्फ पर 15 मिनट के लिए मशीन में reसस्पेंड । 10% FBS माध्यम से फिर से धो लें । 10% FBS मीडियम की 0.5-1 मिलीलीटर में रिसस्पेंड करें और बर्फ पर रखें ।
      5. Add ५० & #181; l के लिए सेल सस्पेंशन को ५० & #181; एल के 10% FBS मध्यम की सिफारिश की मात्रा से युक्त तर्-1-60, तर्-1-81 या SSEA-4 एंटीबॉडी और 30 मिनट के लिए 1 ज.
        6. के लिए मशीन
      6. 10% FBS.
        7. के साथ दो बार धो १०० & #181 में
      7. reसस्पैंड; 10% FBS मध्यम फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी और 30 min. धोने के लिए 10% FBS और 10% FBS के उचित मात्रा में reसस्पैंड के साथ दो बार के लिए गर्मी युक्त माध्यम के एल । जीवित कोशिकाओं को मृत कोशिकाओं से विभेदित किया जा सकता है propidium आयोडाइड डाई जोड़ा पर & #60; 1 & #181; g/mL प्रक्रिया के दौरान कक्ष apoptosis का अनुमान लगाने के लिए.
    4. त्रि-वंश विभेद
      1. बीज दो 6-अच्छी तरह से प्लेटें 1.5-2 x 10 के साथ 6 iPSCs/अच्छी तरह से mTeSR1 माध्यम में 10 & #181; मी रॉक अवरोधक.
      2. की अनुमति कोशिकाओं 2-3 डी के लिए दैनिक mTeSR1 मध्यम परिवर्तन के साथ विकसित करने के लिए जब तक कुओं 80-90% धाराप्रवाह हैं ।
        3. बाह्यत्वक प्रेरण के लिए
      3. , जोड़ तंत्रिका प्रेरण माध्यम (एनआईएम) के अनुसार निर्माता & #39; s निर्देश 6-वेल प्लेट्स के 2-3 कुओं में.
      4. 2% B27 पूरक ऋण इंसुलिन और 12 & #181 युक्त RPMI करने के लिए माध्यम बदल; मी CHIR99021 के लिए त्वक प्रेरण प्लेटों के 2-3 कुओं में < सुप वर्ग = "xref" > १४ . अगले 24 घंटे के लिए 2% B27 पूरक ऋण इंसुलिन से युक्त केवल RPMI जोड़ें 5 & #181; M IWP4 अगले 24 ज के लिए 2% B27 पूरक ऋण इंसुलिन के साथ RPMI माध्यम से । ७२ ज के बाद, RPMI के साथ मीडिया की जगह 2% B27 पूरक 2-3 d.
        5. में धड़कन cardiomyocytes की पीढ़ी के लिए अग्रणी युक्त अन्तः प्रेरण के लिए
      5. 6-well प्लेट्स के कुओं में माध्यम बदलने के लिए MCDB १३१ पूरक १.५ g/L सोडियम बिकारबोनिट के साथ, 1x Glutamax, 10 mM ग्लूकोज, ०.५% BSA, १०० एनजी/एमएल GDF8, और 5 & #181; एम ऑफ CHIR99021 24 एच के लिए एक ही माध्यम में संस्कृति CHIR99021 के बिना 2-3 d < सुप वर्ग = "xref" > 15 .
      6. सभी तीन वंश के लिए चरण 2 से immunostaining प्रोटोकॉल का पालन करें और प्रासंगिक मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए जांच करें ।
< p class = "jove_title" > 2. मानव iPSC के जीनोम एडिटिंग का उपयोग CRISPR-Cas9

  1. की तैयारी Cas9 प्रोटीन और sgRNA
    1. Aliquot Cas9 में microcentrifuge नलियों बाँझ स्थितियों में प्रोटीन और aliquots पर ट्यूब ठंड द्वारा स्टोर-८० & #176; C.
    2. डिजाइन दो लक्ष्यीकरण गाइड जीन प्रति RNAs एमआईटी (http://www.genome-engineering.org/crispr/) या किसी भी अंय crispr गाइड डिजाइन webtool से सॉफ्टवेयर पर आधारित है । लक्ष्य पहले या जीन के दूसरे एक्सॉन (खुले पढ़ने के फ्रेम के आधार पर) को नॉकआउट उत्पंन करते हैं । दो गाइड चुनें ताकि वे करीब एक साथ कटौती (~ 30-100 बीपी के अलावा) और हम आसानी से स्क्रीनिंग प्राइमरों के एक ही सेट का उपयोग कर हटाने कल्पना कर सकते हैं । उच्च गुणवत्ता स्कोर और ऑफ लक्ष्य साइटों की कम संख्या के आधार पर सॉफ्टवेयर उत्पादन से मार्गदर्शिकाएं चुनें । डिजाइन स्क्रीनिंग प्राइमर कार्यक्रम प्राइमरी ब्लास्ट (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) का उपयोग कर । स्क्रीनिंग प्राइमरों Cas9 कटौती साइटों और पीसीआर उत्पाद का आकार अधिमानतः से कम १०० बीपी होना चाहिए पीसीआर द्वारा आसान प्रवर्धन के लिए 400-700 बीपी के बीच होना चाहिए ।
    3. डिजाइन दो पूरक sgRNA oligo DNAs (लंबाई में 19-22 न्यूक्लियोटाइड गाइड अनुक्रम के आधार पर) प्रत्येक के अंत में एक Bsa1 कटौती साइट के साथ । oligo DNAs को व्यावसायिक रूप से संश्लेषित किया जा सकता है और दोहरे-किनारा डीएनए बनाने के लिए annealed । एनीलिंग के लिए, add 1 & #181; l येक का १०० & #181; M पूछकर, 25 & #181; l का एनीलिंग बफर (10 एमएम Tris, पीएच 7.5-8.0, ५० एमएम NaCl, 1 एमएम EDTA) और 23 & #181; l का पानी । एक thermocycler क्रमादेशित में मशीन ९५ & #176 पर शुरू करने के लिए 2 मिनट के लिए सी और फिर धीरे से ठंडा करने के लिए 25 & #176; c ओवर ४५ min.
    4. क्लोन 2 & #181; एक Bsa1 प्रतिबंध में परिणामी टुकड़ा के एल एंजाइम पच 1 & #181; एल के घर में T7 प्रमोटर पीसीआर 2.1 वेक्टर निर्माता & #39; s प्रोटोकॉल के अनुसार टी-4 डीएनए ligase का उपयोग कर एक Cas9 बाइंडिंग साइट के साथ.
    5. अनुक्रम क्लोन डीएनए टुकड़े और जब निष्ठा की स्थापना की है, इन विट्रो में एक T7 किट का उपयोग करने के लिए एक गाइड RNAs उत्पंन क्लोन टाइप । sgRNAs को एक कमर्शियल किट से शुद्ध करें और RNase-फ्री पानी में elute । आरएनए एकाग्रता की जाँच करें.
  2. अभिकर्मक के hiPSCs
    1. में संस्कृति hiPSCs के रूप में ऊपर वर्णित है जब तक कोशिकाओं 40-50% धाराप्रवाह हैं । mTeSR1
    2. से दो घंटे पहले nucleofection, मीडियम को 10 & #181 युक्त गरम mTeSR1 मीडियम के 2 एमएल के साथ बदलें; एम रॉक अवरोधक ।
    3. एक घंटे बाद, aspirating & #160 द्वारा nucleofected कोशिकाओं के लिए गंतव्य कुओं को तैयार करना; झिल्ली, ऊपर के रूप में तैयार, 12 से अच्छी तरह से थाली और mTeSR1 मध्यम के साथ 10 & #181 के साथ गरम 1 मिलीलीटर की जगह; एम रॉक अवरोधक । ३७ पर रखें & #176; ग के लिए सी.
    4. nucleofection मास्टर मिश्रण (उचित नमूनों पर निर्भर करता है) को जोड़ने के द्वारा प्रत्येक नमूने के लिए तैयार १६.४ & #181; पी 3 प्राथमिक सेल अनुपूरक के; ३.६ & #181; l के पूरक 1 से nucleofector किट; ०.५ & #181; के g लए Cas9 प्रोटीन और ०.५ & #181; क g येक sgRNA का मे 22 & #181; प्रति अभिक्रिया की मात्रा । pMAX GFP वेक्टर को भी nucleofected किया गया था जिसके अनुसार निर्माता & #39; एस कोशिकाओं में सिफारिशों को मोटे तौर पर iPSC अभिकर्मक.
      5. की कुशलता का अनुमान लगाने के लिए
    5. iPSC वेल्स से रॉक अवरोधक युक्त माध्यम aspirating के बाद आरटी पंजाबियों के 2 मिलीलीटर के साथ एक अच्छी तरह से धो लें । फिर महाप्राण पंजाबियों, सेल टुकड़ी समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और ३७ & #176 पर थाली मशीन, 10 मिनट के लिए सी.
    6. mTeSR1 मध्यम के 3 मिलीलीटर में कोशिकाओं reसस्पेंड और धीरे ऊपर और नीचे पिपेट एक एकल सेल निलंबन उत्पन्न करने के लिए । स्थानांतरण असंबद्ध कोशिकाओं को एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब युक्त 5 मिलीलीटर mTeSR1 मध्यम.
    7. सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना और कुल मात्रा की गणना के लिए आवश्यक ०.५ x 10 6 कोशिकाओं/अभिकर्मक । जगह 15-एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में कोशिकाओं की मात्रा वांछित, २०० x जी पर आरटी और महाप्राण supernatant.
      8. में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक
    8. ०.५ x 10 6 कोशिकाओं की प्रत्येक इकाई 22 & #181 में reसस्पेंड; चरण 4 में तैयार अभिकर्मक मास्टर मिक्स के एल. जल्दी से एक nucleocuvette पट्टी की एक अच्छी तरह से केंद्रीय कक्ष में कोशिकाओं हस्तांतरण । nucleofector डिवाइस में स्ट्रिप रखें और प्रोग्राम CB150.
      9. का उपयोग करके nucleofect कक्ष
    9. के बाद nucleofection, शीघ्रता से जोड़ें ८० & #181; L से गरम mTESR1 मध्यम से युक्त 10 & #181; M रॉक अवरोधक nucleofected कोशिकाओं के प्रत्येक कुआं के लिए. धीरे से pipetting ऊपर और नीचे से मिश्रण ।
    10. धीरे से कोशिकाओं के कुओं के लिए पट्टी से स्थानांतरण & #160; झिल्ली पूर्व लेपित 12-खैर प्लेट चरण 3 में तैयार रॉक अवरोधक के साथ mTeSR1 माध्यम से युक्त ।
    11. 1 डी के बाद, रॉक अवरोध करनेवाला के बिना ताजा mTeSR1 माध्यम के लिए बदल जाते हैं । हार्वेस्ट कक्ष 2-3 d एकल-कक्ष सॉर्टिंग के लिए nucleofection के बाद ।
  3. एकल-सेल अलगाव के लक्षित hiPSCs
    1. छंटाई से पहले एक दिन, तैयार ९६-अच्छी तरह से MEF प्लेटें बोने की 10% मध्यम में 2 x 10 6 FBS कोशिकाओं/ लगभग 70-80% क्लोन nucleofection के बाद जीवित और 2-3 MEF प्लेट प्रत्येक संपादन प्रयोग के लिए तैयार किया जा सकता है ।
    2. रात भर की गर्मी के बाद, hESC माध्यम के माध्यम को बदलने के लिए (जैसा कि पहले वर्णित) १०० एनजी के साथ पूरक/एमएल bFGF, 1x SMC4 (अवरोधकों मीडिया के लिए एक कोशिका व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए जोड़ा), और 5 मिलीग्राम/एमएल fibronectin आसंजन को बढ़ावा देने के लिए ।
    3. hiPSCs पर मध्यम की जगह 12-well प्लेट में mTeSR1 से mTeSR1 मध्यम के लिए 1x SMC4 के साथ पूरक एक सेल छंटाई से पहले कम 2 ज ।
    4. महाप्राण को hiPSCs से मध्यम कर दें और पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धीरे से धोएं । Add ५०० & #181; सेल टुकड़ी समाधान के एल एक अच्छी तरह से और में ३७ & #176 पर मशीन, पंजाबियों aspirating के बाद 10 मिनट के लिए सी । एक अच्छी तरह से mTeSR1 (पूरक) के 1 मिलीलीटर जोड़ने के द्वारा एकल सेल निलंबन उत्पन्न और धीरे से कई बार ऊपर और नीचे pipetting.
    5. प्लेस सेल सस्पेंशन एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में और 5 मिनट के लिए २०० x g पर RT. महाप्राण supernatant में और कोशिकाओं को reसस्पैंड mTeSR1 के 1 मिलीलीटर में ।
    6. एकल कोशिकाओं में एक सेल सॉर्टर के साथ बाँझ शर्तों के तहत १०० मिमी नोजल के साथ एक सेल का उपयोग कर सॉर्ट करें ९६ अच्छी तरह से चरण 1 में तैयार प्लेटों में से एक कोशिका के साथ.
      7. छंटाई के बाद चार दिन
    7. , कॉलोनी गठन स्पष्ट किया जाना चाहिए; इस बिंदु पर hESC माध्यम के साथ संस्कृति माध्यम की जगह 1x SMC4.
      8. के साथ पूरक छंटाई के बाद
    8. आठ दिन, hESC माध्यम और संस्कृति के साथ मध्यम बदलें 2 डी.
      9. के लिए
    9. 20 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल collagenase का उपयोग कर अलग कालोनियों और उंहें 24-अच्छी तरह से झिल्ली लेपित प्लेटों रॉक अवरोध करनेवाला के साथ mTeSR1 में स्थानांतरण । एकल सेल क्लोन बढ़ने और डुप्लिकेट या उंहें विस्तार के बाद उनके जीनोमिक डीएनए निकालने चलो । उपयोग जीन विशिष्ट प्राइमरों के लिए पीसीआर द्वारा लक्ष्य डीएनए बढ़ाना ।
    10. के निर्माता & #39; s निर्देश के अनुसार जेल/डाई मिश्रण के माध्यम से उन्हें चलाकर सभी क्लोनों के पीसीआर प्रवर्धित लक्ष्य जीनोमिक क्षेत्र की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए टुकड़ा विश्लेषक किट का उपयोग करें । उपयुक्त सीढ़ी है, जो नमूनों के साथ चलाया जाता है के साथ तुलना करके सॉफ्टवेयर आकार में परिणामी टुकड़ा आकार का अनुमान है । अनुक्रम अपेक्षित & #39; संपादित & #39; क्लोन और संपादन या हटाने की पुष्टि करने के लिए sequencing डेटा का विश्लेषण करें ।
      11. monoallelic और biallelic क्लोन विभेदन के लिए
    11. , पीसीआर और पजेट 1.2 वेक्टर में क्लोन के साथ संपादित अनुक्रम बढ़ाना । sequencing के लिए कम से 8-10 क्लोन भेजें और अनुक्रम की जांच करने के लिए एक या दोनों alleles.
      12. में संपादन की पुष्टि
    12. एक बार सफलतापूर्वक लक्षित iPSC क्लोन genotyping के माध्यम से पहचान की गई है, की पुष्टि करें कि वे pluripotency नहीं खो दिया है या इस प्रक्रिया के माध्यम से गुणसूत्र विषमताओं प्राप्त की जांच ।

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Representative Results

इस प्रकाशन में, हम मानव अग्नाशय कोशिकाओं एकीकरण या पदचिह्न से मुक्त सेंडाइ वायरस वैक्टर का उपयोग करने से iPSC की पीढ़ी के लिए एक सरल लेकिन कुशल प्रोटोकॉल का पालन किया है । चित्र 1a इस reprogramming प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है । मानव अग्नाशय कोशिकाओं वाणिज्यिक खरीदा, Prigrow III मध्यम और सेंडाइ वायरस के साथ transduced में संस्कृति के रूप में ऊपर समझाया गया । Transduced धुरी अग्नाशय कोशिकाओं के आकार का कोई रूपात्मक परिवर्तन के लिए नहीं दिखा था ~ 5 दिन 0 दिन पर सेंडाइ वायरस transduction के बाद, लेकिन फिर बड़ा नाभिक और nucleoli के साथ गोल हो जाते हैं । कुछ प्रारंभिक कालोनियों एक सप्ताह के बाद transduction देखा गया था लेकिन वे नहीं उठाया, हमारे अनुभव के रूप में, इन कालोनियों जल्दी अलग और आम तौर पर कर रहे है ' जल्दी आंशिक रूप से recelled कोशिकाओं ' है कि मजबूत कालोनियों की स्थापना नहीं है । लगभग 10-15 दिनों के बाद transduction, छोटे उज्ज्वल कालोनियों मनाया गया और विकास के बाद उठाया (आंकड़ा 1b, ऊपर सही) थे । मानव iPSC कालोनियों कॉम्पैक्ट, कसकर स्पष्ट किनारों के साथ पैक कर रहे हैं (' के रूप में पूरी तरह से कोशिकाओं को माना जाता है ') (चित्र 1b, दिन 23 नीचे मध्य) और ' आंशिक रूप से कोशिकाओं ' कॉलोनी में अंतराल के साथ ढीला कर रहे हैं दिन 23 नीचे दाएं) । फिर से कार्यक्रम अग्नाशय सेल कालोनियों 18 दिन पर बढ़ रहे थे (आंकड़ा 1b, नीचे छोड़ दिया) और काफी बड़ी दिन 23 (आंकड़ा 1b, नीचे मध्य) द्वारा मैंयुअल रूप से उठाया जा रहे थे । दिन 30-40 (चित्रा 2a, वाम) द्वारा फीडर मुक्त iPSC पाने के लिए उठा के बाद कालोनियों झिल्ली लेपित प्लेटों पर चढ़ाया गया । इन ' मजबूत ' फीडर मुक्त कालोनियों के कुछ विस्तार और alkaline फॉस्फेट, pluripotency और फीडर मुक्त शर्तों में सतह मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए विशेषता थे । सभी परीक्षण क्लोन alkaline फॉस्फेट के लिए सकारात्मक थे के रूप में वे परख (चित्रा 2a, सही) के बाद चमकदार लाल कर दिया । pluripotency मार्करों OCT4, NANOG, SSEA4, तर्-1-60 और तर्-1-81 भी उच्च immunostaining या FACS विश्लेषण (चित्र बी और चित्रा 3) द्वारा सभी क्लोन में व्यक्त किया जा करने के लिए मनाया गया ।

ये परिणाम प्रदर्शित करता है कि मानव iPSC अग्नाशय कोशिकाओं से उत्पंन कालोनियों फीडर मुक्त शर्तों में pluripotency मार्करों व्यक्त की । बाह्यत्वक, त्वक और अन्तः: pluripotency भी मानव iPSC के तीन रोगाणु परतों को निर्देशित विभेद द्वारा मूल्यांकन किया गया था । झिल्ली पर क्लोन TUJ1 सकारात्मक ंयूरॉंस को विभेदित (बाह्यत्वक), NKX2-5-सकारात्मक धड़कन cardiomyocytes (त्वक) और SOX17-सकारात्मक endodermal कोशिकाओं (चित्र 3 बी) ।

पूरी तरह से लक्षण वर्णन के बाद, 3 मजबूत, फीडर मुक्त iPSC क्लोनिंग लाइनों जीनोम संपादन अध्ययन के लिए चुना गया । समाप्त होता है पर BsaI कट साइटों के साथ दो गाइड प्रत्येक जीन के लिए डिजाइन के पास एक साथ काट (यानी, n से कम ~ १०० bp) थे । प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध चित्रा 4में दिखाया गया है । इस विलोपन लक्ष्य जीन के लिए इस्तेमाल की रणनीति हमें आसानी से एक जीन के पहले या दूसरे एक्सॉन के एक हिस्से को नष्ट करने की अनुमति दी । यह रणनीति बहुत कुशल थी और हम हर प्रयास में संपादित क्लोन अलग कर सकता है । गाइड BsaI में क्लोन किया गया वेक्टर पचा लिया और इन विट्रो में ऊपर वर्णित के रूप में लिखित । हम nucleofected मार्गदर्शिकाएं (RNAs) और Cas9 प्रोटीन के रूप में त्वरित और प्रभावी संपादन के लिए RNP परिसरों । हम भी कोशिकाओं की वसूली के रूप में MEFs पर एक कोशिकाओं के रूप में हल कोशिकाओं झिल्ली लेपित प्लेटों पर अकेले हल कक्षों की तुलना में अधिक है । जीनोमिक डीएनए सभी क्लोनों से अलग किया गया था, लक्ष्य भाग पीसीआर द्वारा परिलक्षित और नियंत्रण की तुलना में लक्ष्य टुकड़े के आकार में परिवर्तन के लिए स्क्रीन करने के लिए टुकड़ा विश्लेषक पर हल किया गया था । टुकड़ा आकार ' संपादित ' क्लोन (चित्रा 4, नीचे) का पता लगाने के लिए नमूनों के साथ चलाने के सीढ़ी की तुलना में था । इस क्लोन की मेड स्क्रीनिंग आसान के रूप में हम & #62 के माध्यम से जा सकते हैं; एक थाली में ९० क्लोन और परिणाम ± 3 बीपी की सटीकता के साथ प्राप्त किए गए । चयनित क्लोन तो जंगली प्रकार की पुष्टि और रूपांतरित क्लोन अनुक्रम थे । Wildtype क्लोनों हटाने या कुर्सियां के अलावा नहीं था, जबकि रूपांतरित क्लोन Wildtype की तुलना में या तो इसके अलावा या अनुक्रम में विलोपन था । विलोपन या अनुक्रमण में इसके अलावा दिखा क्लोन का विस्तार किया गया और क्लोनिंग प्रति पजेट 1.2 वैक्टर में monoallelic और biallelic क्लोनों की पहचान करने के लिए कम से 8-10 के sequencing कालोनियों के अनुसार । Monoallelic क्लोन कुर्सियां नष्ट कर दिया था या एक एलील में जोड़ा और अंय अनछुए और wildtype एलील के समान था । Biallelic क्लोन दोनों alleles में हटा दिया था । मोटे तौर पर ३०० क्लोन सभी लक्ष्य जीन है, जो लगभग 9 monoallelic विलोपन क्लोन और 3 प्रत्येक मामले में biallelic विलोपन क्लोन के लिए जांच की गई । यह मोटे तौर पर एक 3-monoallelic क्लोन की तुलना में biallelic क्लोन की पीढ़ी की आवृत्ति में कमी गुना से मेल खाती है । विविधता हटाने के भीतर amplicons अपूर्ण और असंगत NHEJ की मरंमत प्रतिबिंबित । जीन की अभिव्यक्ति अंत में लक्ष्य कोशिकाओं से आरएनए निकालने और आरटी-पीसीआर प्रदर्शन द्वारा पुष्टि की थी ।

Figure 1
चित्रा 1: मानव अग्नाशय कोशिकाओं के फीडर के लिए reprogramming-मुक्त pluripotent कोशिकाओं (iPSC). (क) मानव अग्नाशय कोशिकाओं से iPSC की पीढ़ी के लिए एक योजनाबद्ध प्रोटोकॉल दिखाया गया है. अग्नाशय कोशिकाओं कोलेजन लेपित प्लेटों पर बड़े हो गए थे और फिर मानव सेंडाइ वायरस वैक्टर के साथ transduction के बाद MEFs को हस्तांतरित । इसके बाद पूरी तरह से रिhESC्ड कालोनियों में तबादले कर दिए गए और उनकी विशेषता को पहचाना गया । (B) सेंडाइ वायरस transduction के बाद रूपात्मक बदलता है । transduction से पहले, अग्नाशय कोशिकाओं ठेठ धुरी की तरह आकृति विज्ञान (ऊपर छोड़ दिया, 0 दिन) दिखाते हैं । छोटी, तंग कालोनियों 12 दिन तक MEFs पर दिखाई देते हैं, मानव pluripotent सेल कालोनियों जैसी । आम तौर पर पूरी तरह से reiPSCed मानव कॉलोनियों बहुत स्पष्ट सीमाएं है और दिन 23-30 द्वारा उठाया जा सकता है । 23 दिन में एक असंबद्ध कॉलोनी नीचे दाईं ओर दिखाया गया है । सभी छवियों 100X आवर्धन पर कब्जा कर लिया (10x उद्देश्य और 10x ऐपिस) थे । स्केल बार = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: मानव iPSC के लक्षण वर्णन । (क) iPSC कॉलोनी के एक ठेठ चरण विपरीत छवि और फीडर मुक्त स्थितियों में संस्कृति के बाद (40X, 4x उद्देश्य और 10x ऐपिस; वाम) अग्नाशय कोशिकाओं के सेंडाइ वायरस reprogramming के बाद । क्षारीय फॉस्फेट सना लाल iPSC कॉलोनी दाईं ओर है । क्षारीय फॉस्फेट धुंधला के लिए, iPSC कालोनियों तय कर रहे थे और किट से सब्सट्रेट समाधान के अलावा के बाद लाल दाग । चित्र 40X पर कब्जा कर लिया गया । (B) pluripotency मार्करों के लिए Immunostaining NANOG, और OCT3/4 फीडर में मुक्त मानव अग्नाशय कोशिका-व्युत्पंन iPSCs । DAPI एक नियंत्रण के रूप में नाभिक नीला दाग के लिए इस्तेमाल किया गया था । सभी चित्र 100X आवर्धन पर ले जाया गया । स्केल बार = १०० सभी छवियों में µm । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: pluripotency और iPSC के विभेदक क्षमता का लक्षण वर्णन । (क) सतह मार्करों के FACS विश्लेषण SSEA4, तर्-1-60 और तर्-1-81 फीडर में मुक्त iPSCs. कोशिकाओं को एकल सेल निलंबन के लिए असंबद्ध थे और सतह मार्करों के लिए दाग SSEA-4, तर्-1-60 और तर्-1-81 । बैंगनी पीक में iPSC नेगेटिव (एंटीबॉडी कंट्रोल) कोशिकाएं होती हैं और अग्नाशय के iPSC को हरी चोटी के रूप में कल्पना की जा सकती है । (ख) रोगाणु परत मार्कर जीन की Immunofluorescent इमेजिंग । मार्करों की अभिव्यक्ति TUJ1 बाह्यत्वक (हरा), NKX2-5 त्वक (लाल) और SOX17 अन्तः (लाल) कोशिकाओं में अग्नाशय iPSC का निर्देशन विभेद के बाद. इसी पर नियंत्रण परमाणु दाग DAPI नीला है. सभी चित्र 100X आवर्धन पर ले जाया गया । स्केल बार्स = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: CRISPR/Cas9 विलोपन रणनीति के योजनाबद्ध । एक sgRNA जोड़ी (लाल के रूप में चिह्नित) अंत में BsaI कटौती साइटों के साथ डिजाइन किया गया था (एफ और आर के रूप में दिखाया गया है) अधिमानतः पहले एक्सॉन, annealed, BsaI में क्लोन पचा संशोधित सदिश (पीसीआर 2.1, BsaI साइट पर प्रकाश डाला ग्रे), अनुक्रम और इन विट्रो में अनुवादित । वेक्टर के रेखांकित अनुक्रम BsaI पाचन के बाद नष्ट कर दिया भाग से पता चलता है । स्क्रीनिंग प्राइमरों की स्थिति नीले रंग में संकेत दिया है । Cas9 और गाईड RNAs को जीनोमिक विलोपन के लिए एक परिसर के रूप में फीडर-फ्री iPSC में nucleofected गया । iPSCs तो एक सेल ९६ पर हल-अच्छी तरह से MEF प्लेटों थे, संस्कृति, झिल्ली को हस्तांतरित, विस्तारित और टुकड़ा विश्लेषक द्वारा जांच की । विश्लेषक पर नमूने चलाने के लिए, झिल्ली पर Cas9 और गाइड transfected क्लोन के जीनोमिक DNAs निकाले गए थे और संभावित ' संपादित ' क्लोन (नीचे मध्य) के लिए चयन करने के लिए विश्लेषक में जेल/डाई मिश्रण के माध्यम से पारित कर दिया । प्रासंगिक सीढ़ी मार्कर, WT और संभावित संपादित क्लोन चिह्नित कर रहे हैं । जीन की अभिव्यक्ति आरएनए निकालने और क्यू-पीसीआर के साथ विश्लेषण की पुष्टि की थी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

iPSCs के लिए मानव दैहिक कोशिकाओं की reprogramming बुनियादी जीव विज्ञान अनुसंधान, व्यक्तिगत चिकित्सा, रोग मॉडलिंग, दवा विकास और अपक्षयी चिकित्सा के क्षेत्र के लिए एक प्रमुख बढ़ावा प्रदान की है16। मानव iPSC पीढ़ी के कई मौजूदा और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तरीकों को कम reprogramming दक्षता के साथ मेजबान जीनोम या episomal वैक्टर में एकीकरण के जोखिम के साथ वायरस के उपयोग की आवश्यकता है । यहां, हम सेंडाइ-वायरस के साथ मानव अग्नाशय कोशिकाओं से फीडर मुक्त iPSCs पैदा करने के लिए एक कुशल विधि मौजूद है, जो ' के लिए पदचिह्न ' मुक्त और कुशल reprogramming । परिणामस्वरूप मानव iPSCs वायरल transgenes से मुक्त कर रहे हैं, pluripotency बनाए रखने, और अज्ञात exogenous कारकों के उपयोग से बचें । फीडर में iPSCs की पीढ़ी-मुक्त शर्तों कम reprogramming दक्षता है, तो हम फीडर कोशिकाओं पर प्राथमिक अग्नाशय कोशिकाओं reprogrammed और फिर फीडर के लिए कालोनियों ले जाया-विस्तार, संस्कृति और लक्षण वर्णन के लिए मुक्त झिल्ली । इन तकनीकों का फ्यूजन स्थिर, विश्वसनीय और अधिक कुशल iPSC प्रोग्रामिंग प्रदान करता है ।

हम भी इस विधि के साथ मानव fibroblasts और अंय प्राथमिक कोशिकाओं से iPSCs उत्पंन, जो पता चलता है कि सेंडाइ-वायरस कोशिकाओं की विस्तृत विविधता reprogram करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं: प्राथमिक कोशिकाओं के इष्टतम प्रवाह के लिए एक की जरूरत के रूप में बहुत कम या बहुत अधिक कोशिकाओं reprogramming दक्षता प्रभावों reprogrammed; प्राथमिक कक्षों का एक पूर्व गद्यांश जब कक्ष अभी भी इष्टतम रूप से विभाजित हैं; सावधान अनुमापन के वायरल वैक्टर कि ंयूनतम सेल apoptosis में परिणाम और एक उच्च क्षमता आसान मजबूत कालोनियों के लेने के लिए अग्रणी; 10-15 मार्ग पर पीसीआर द्वारा सेंडाइ वेक्टर transgene अभिव्यक्ति की हानि की पुष्टि करने के लिए सुनिश्चित करें कि iPSCs ' पदचिह्न मुक्त ' हैं; और, झिल्ली पर iPSC की संस्कृति के लिए सख्त बाँझ शर्तों ।

हम iPSC जीनोम को संपादित करने के लिए CRISPR जीनोम संशोधन के एक सुविधाजनक और कुशल विधि का इस्तेमाल किया । इस तकनीक को Cas9 प्रोटीन और sgRNA, RNP परिसरों को पहचान और पूरक डीएनए दृश्यों से सट को जोड़ती है । यह आसानी से बस 20 बीपी गाइड आरएनए बदल कर एक जीनोमिक अनुक्रम लक्ष्य अनुकूलित किया जा सकता है । हमारे विधि मानव iPSCs के कुशल और प्रतिलिपि संपादन के लिए एक आसान प्रोटोकॉल प्रदान करता है के रूप में वे और अधिक श्रम गहन, transduce के लिए मुश्किल है, और अंय कोशिकाओं से बनाए रखने के लिए महंगा है । हम प्रत्येक लक्ष्य जीन इतना है कि स्क्रीनिंग प्राइमरों का एक सेट संपादित क्लोन स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए कम से अधिक दो आसंन लेकिन गैर अतिव्यापी गाइड डिजाइन । इसके अलावा, दो गाइड का उपयोग ~ 30-100 बीपी के अलावा एक बड़े विलोपन, जो आसानी से प्रारंभिक स्क्रीनिंग के दौरान visualized किया जा सकता है और प्रोटीन की कमी सुनिश्चित करता है बनाता है । गाइड HEK में परीक्षण किया जा सकता है-२९३ कोशिकाओं शुरू में iPSC में परख शुरू करने से पहले क्षमता का अनुमान है । साथ ही, यह iPSC में रिएजेंट की दिनचर्या अभिकर्मक के लिए पैरामीटर्स स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है । pMAXGFP प्लाज्मिड का प्रयोग, & #62 की अभिकर्मक क्षमताएं; ८०% और iPSCs में 3-10% की जीन लक्ष्यीकरण/विघ्न क्षमताएं नियमित रूप से हासिल की जाती हैं । हमारे प्रोटोकॉल में कोशिकाओं में Cas9 RNP परिसरों के प्रत्यक्ष वितरण तेजी से कार्रवाई और तेजी से कारोबार प्रदान करता है और लक्षित संशोधन की उच्च दरों को बनाए रखता है । हमारे दृष्टिकोण एकल सेल गाइड और Cas9 प्रोटीन के बाद nucleofection छंटाई रोजगार, मिश्रित iPSC जनसंख्या में जीन लक्ष्यीकरण की एक महत्वपूर्ण बाधा पर काबू पाने और कोशिकाओं के clonality सुनिश्चित करने । यह ' उपन्यास ' समग्र दृष्टिकोण सीधा, मल्टीप्लेक्स के लिए आसान है, केवल कुछ ही हफ्तों में लेता है और किसी भी एंटीबायोटिक चयन की आवश्यकता नहीं है । हम एक सेल लाइन या iPSCs में CRISPRs द्वारा क्रमिक रूप से हटाने शुरू द्वारा दक्षता में किसी भी नुकसान का निरीक्षण नहीं किया है, हालांकि कैरयोटाइप विश्लेषण के लिए इस तरह के मामलों में किया जा करने के लिए जीनोमिक स्थिरता सुनिश्चित करने की जरूरत है । क्लोन pluripotency मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए भी जाँच की जानी चाहिए. हालांकि, इस प्रकाशन का ध्यान केंद्रित नहीं, इस प्रोटोकॉल सह हो सकता है अभिकर्मक कॉकटेल17,18में मरंमत टेम्पलेट सहित द्वारा सटीक आनुवंशिक संशोधन प्रेरित करने के लिए चुना है ।

अंत में, हमारे अनुभव के आधार पर, iPSC संपादन प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं: गाइड के तर्कसंगत डिजाइन को कम करने या पूरी तरह से "बीज क्षेत्र में विशेष रूप से लक्ष्य उत्परिवर्तनों से बचने" या पाम आकृति के करीब संशोधित किया जा रहा है; RNPs के वितरण को सुनिश्चित करने के लिए iPSCs में nucleofection कुशलता का अनुकूलन; तैयार गाइड की गुणवत्ता की जांच; गाइड और Cas9 प्रोटीन सांद्रता के अनुमापन और इन विट्रो जैव रासायनिक क्लीवेज परख या के रूप में मानव cellssuch में HEK कोशिकाओं है कि संस्कृति के लिए आसान कर रहे है के रूप में इस लेख में वर्णित द्वारा अपनी गतिविधि को मांय और transfect; जल्दी बीतने iPSCs का उपयोग करें कि विकास के लॉग चरण में है और पहुंच ~ ५०% प्रवाह; कोशिकाओं के अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए एकल कोशिका छंटाई के बाद कोमल माध्यम से कोशिकाओं की सावधान हैंडलिंग में परिवर्तन ।

हमें विश्वास है कि उपर्युक्त प्रोटोकॉल पर्याप्त विस्तार में delineated एक प्रतिलिपि फैशन में पैदा करने और संपादन iPSC के लिए एक रूपरेखा के साथ पाठकों को लैस करेगा ।

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Disclosures

बीटी जीर्णोद्धार का एक संस्थापक सदस्य है-विज्ञान इंक

Acknowledgments

लैब में काम डॉ अंजलि नंदी को postdoctoral फैलोशिप अनुदान, और मैरीलैंड स्टेम सेल रिसर्च फंड से बीटी (TEDCO) के लिए खोजपूर्ण अनुदान द्वारा समर्थित था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sendai viral vectors - CytoTune-iPS 2.0 Kit Invitrogen A16517 Thaw on ice; S No: 1
Trypsin EDTA Gibco Life Tech 25300-054 0.05%, 100 ml; S No: 2
Rock inhibitor (Y-27632) Milipore SCM075 Use 10 μM; S No: 3
DMEM/F-12 medium Invitrogen 11330-032 S No: 4
Serum replacement (KSR) Gibco 10828028 S No: 5
DMEM Invitrogen 11960069 1X; S No: 6
Fetal bovine serum Thermo Scientific SH30071.03 Aliquot; S No: 7
L-glutamine (Glutamax, 100X), liquid Thermo Scientific 35050061 1/100; S No: 8
Non-Essential Amino Acids Gibco 11140-050 1/100; S No: 9
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 55 mM, 1/1,000; S No: 10
Hausser Hemacytometers Hausser Scientific 02-671-54 S No: 11
0.1% Gelatin Solution STEMCELL Technologies 7903 Incubate at 37º C for 1 hour; S No: 12
SSEA-4 antibody Santacruz sc-21704 1/100; S No: 13
TRA-1-81 antibody Cell Signaling 4745S 1/200; S No: 14
OCT4 antibody Santa Cruz sc-5279 1/1,000; S No: 15
Collagen I, Rat Tail Life Technologies A10483-01 Keep cold; S No: 16
Alexa Fluor fluorescent 488/ 568 (secondary antibodies) Invitrogen A21202/A10042 1/2,000; S No: 17
DPBS Hyclone SH30028LS 1X; S No: 18
100-mm tissue culture dish Falcon 353003 S No: 20
96-well tissue culture plate Falcon 353078 S No: 21
6-well tissue culture plate Falcon 353046 S No: 22
Dissecting scope  Nikon SMZ745 S No: 23
Picking hood NuAire NU-301 S No: 24
15 ml Centrifuge Tube Greiner Bio-One 188271 S No: 25
50 ml Centrifuge Tube Greiner Bio-One 227261 S No: 26
Sodium pyruvate Invitrogen 11360 S No: 28
β-mercaptoethanol Sigma M7522 S No: 29
Prigrow III medium ABM TM003 S No: 31
Countess™ Cell Counter Invitrogen C10227 S No: 32
Faxitron X-ray system Faxitron CellRad S No: 33
Accutase Innovative cell Technologies AT-104 S No: 34
Collagenase Life Technologies 17104019 1mg/ml stock; S No: 35
Dispase STEMCELL Technologies 7923 S No: 36
hESC qualified matrigel BD Biosciences 354277 To dilute, use cold DMEM/F-12; S No: 37
bFGF R & D 233-FB Stock 10 ug/ml; S No: 38
Paraformaldehyde EMS 15710 4% stock in PBS; S No: 39
TRA-1-60 Santa Cruz sc-21705 1/100; S No: 40
NANOG ReproCELL RCAB0004P-F 1/100; S No: 41
Tween 20 Sigma P9416-100ML S No: 42
Alkaline Phosphatase kit Stemgent 00-0055 S No: 43
Cas9 protein PNA Bio CP01-50 Thaw and aliquot; S No: 44
Goat or donkey serum Sigma D9663/G9023 S No: 45
Triton X-100 Sigma X100-100ML S No: 46
DAPI Thermo Scientific D1306 S No: 47
Tris Sigma 9285-100ML S No: 48
NaCL Sigma S7653-250G S No: 49
EDTA Sigma BP2482-500 S No: 50
T4 DNA ligase NEB M0202T S No: 51
Mega Shortscript T7 kit Thermo Scientific AM1354 S No: 52
Mega Clear kit Thermo Scientific AM1908 S No: 53
SMC4 BD Biosciences 354357 S No: 54
Fibronectin STEMCELL Technologies 7159 S No: 55
CloneJET cloning kit Thermo Scientific K1232 S No: 56
Fragment analyzerTM Advanced Analytical S No: 57
mTeSR1 medium kit STEMCELL Technologies 5850 Warm to room temperature; S No: 58
Freezing medium mFreSR™ STEMCELL Technologies 5855 S No: 59
Freezing medium CryoStor® STEMCELL Technologies 7930 S No: 60
MEFs Globalstem GSC-6301G S No: 61
L-glutamine Invitrogen 25030081 S No: 62
Human pancreatic cells ABM T0159 S No: 63
STEMdiff™ Neural Induction Medium Stemcell Technologies 5835 S No: 64
RPMI Thermofisher 11875-093 S No: 65
2% B27-insulin Thermofisher A1895601 S No: 66
CHIR99021 Stemcell Technologies 72052 S No: 67
IWP4 Stemcell Technologies 72552 S No: 68
2% B27 Thermofisher 17504044 S No: 69
MCDB 131 Life Technologies 10372019 S No: 70
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S8761-100ML S No: 71
Glucose Sigma-Aldrich G8270-100G S No: 72
BSA Proliant 68700 S No: 73
GDF8 Pepro-Tech 120-00 S No: 74
TUJ1 antibody EMD Milipore AB9354 S No: 75
NKX2-5 antibody Santa Cruz Sc-14033 S No: 76
SOX17 antibody R & D systems AF1924 S No: 77
Propidium iodide Thermo Scientific P3566 S No: 78
Amaxa 4D-nucleofector™ Lonza AAF-1002 S No: 79
FACSAria II (cell sorter) BD biosciences SORP UV S No: 80

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References

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इंजीनियरिंग १२९ अंक प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) reprogramming सेंडाइ वायरस CRISPR/Cas9 पदचिह्न-मुक्त iPSCs nucleofection
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Nandal, A., Mallon, B., Telugu, B.… More

Nandal, A., Mallon, B., Telugu, B. P. Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System. J. Vis. Exp. (129), e56260, doi:10.3791/56260 (2017).

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