ويقدم بروتوكول microinjection بسيطة وفعالة لتحرير الجينات في أجنة سمك السلور قناة باستخدام نظام كريسبر/Cas9. في هذا البروتوكول، دليل الكشف وكانت ميكروينجيكتيد Cas9 البروتين في صفار البيض الأجنة خلية واحدة. وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول بانقطاع قناة سمك السلور اثنين من الجينات المتصلة بجهاز المناعة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Microinjection كريسبر/Cas9 البروتين في أجنة سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus، لتحرير الجينات
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تم تسلسل الجينوم الكامل من سمك السلور القناة، Ictalurus punctatus،، مما يؤدي إلى المزيد من الفرص لدراسة وظيفة الجينات سلور قناة. وقد استخدمت الجينات بالضربة القاضية لدراسة هذه وظائف الجينات في فيفو. بانتظام مجمع إينتيرسباسيد في البروتين قصيرة المتناوب يكرر/كريسبر المرتبطة 9 (كريسبر/Cas9) نظام أداة قوية تستخدم لتحرير الجينوم تسلسل الحمض النووي لتغيير وظيفة الجينات. بينما كان النهج التقليدي لإدخال مرناً كريسبر/Cas9 في الأجنة خلية مفردة من خلال microinjection، وهذا يمكن أن يكون عملية بطيئة وغير فعالة في سمك السلور. ويرد هنا، بروتوكول مفصل ل microinjection أجنة سمك السلور قناة مع البروتين كريسبر/Cas9. بإيجاز، كانت البيض والحيوانات المنوية إخصاب المجمعة ومصطنعة ثم يقوم. ونقل البويضات المخصبة إلى طبق بتري يحتوي على الحل هولتفريتير. معايرة حجم الحقن وثم دليل استهداف الكشف/Cas9 تم ميكروينجيكتيد عدد القتلى/انترلوكين 1 مستقبلات المحتوية على المجال محول جزيء (تيكام 1) الجينات وملزمة rhamnose يكتين (ربل) الجينات في صفار البيض الأجنة خلية واحدة. خروج المغلوب الجينات كانت ناجحة حيث تم تأكيد إينديلس بتسلسل الحمض النووي. شملت فراميشيفت التعديلات تسلسل البروتين المتوقعة بسبب هذه الطفرات واقتطاع البروتين بسبب codons توقف سابق لأوانه.
المقدمة
Microinjection أسلوب مختبرية شائعة المستخدمة لتسليم كمية صغيرة من مادة مثل الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي، والبروتين، والجزيئات الكبيرة الأخرى في الخلايا أو الأجنة من خلال زجاج شعرية1. Microinjection تتم باستخدام إعداد المعدات الخاصة بما في ذلك من ميكروينجيكتور، ميكرومانيبولاتور، و مجهر2. وقد استخدمت التقنية باحثون وراثيا تعديل العديد من الكائنات الحية من خلال توليد الوراثي والجينات بالضربة القاضية، والعلاج الجيني، بهدف فهم ديناميات المكونات داخل الخلايا3،4 , 5.
سمك السلور قناة (Ictalurus pu....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت هذه التجربة في وحدة بحوث الوراثة السمكية، هاء دبليو شل مركز بحوث مصائد الأسماك، وجامعة أوبورن، بن. بموافقة جميع البروتوكولات التجريبية المستخدمة في هذه التجربة برعاية الحيوان المؤسسية جامعة أوبورن واستخدام اللجنة (الاتحاد الأفريقي-IACUC) قبل الشروع التجربة. يمكن الاطلاع على قائمة بالمعدات واللوازم التي استخدمت في هذه التجربة في "الجدول المواد". فيما يلي خطوات وإجراءات إعداد و microinjection أجنة سمك السلور القناة خلية واحدة كما هو موضح في الشكل 1.
1-الحضنة اختيار الأسهم والتفريخ
- اختر سمك السلور قناة صحية الأسهم الحضنة من سلالة أو الخط الوراثي للفائدة. قناة سمك السلور الذكور والإناث يجب أن يحمل ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لإثبات فعالية البروتوكول microinjection، كانت ميكروينجيكتيد جرناس مصممة لاستهداف قناة سمك السلور مستقبلات عدد القتلى/انترلوكين 1 التي تحتوي على المجال محول جزيء (TICAM1) الجينات وملزمة rhamnose يكتين (ربل) الجينات.
تيكام 1
تسلسل الحمض النووي من ناقلات من مستعمرات فردية من منتجات PCR المجمعة، المستنسخة كشف الطفرات إينديل التي يسببها في الجينات تيكام 1. وكان معدل الطفرات 79% في الأفراد 24 تم تحليلها. وترد أمثلة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقدم بروتوكول مفصل ل microinjection أجنة سمك السلور قناة لتحقيق الضربة القاضية الجينات. الحقن بالبروتين كريسبر/Cas9 في صفار البيض هي أبسط بكثير ويوفر الوقت ولا تتطلب تدريبا مكثفا بالمقارنة مع ميكروينجيكتينج بلاستوديسك الجنين خلية واحدة، وهي تقنية شائعة لمعظم نقل الجينات والجينات التحرير مع الأسماك 30 , 42-البروتوكول الحالي أثبتت نجاحها في حمل إينديلس في قناة سمك السلور الجينات 1 تيكام وربل. هذه إجراءات موثوق بها وفعالة إرساء الأساس لتوليد الجينات مستقبلا بالضربة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن أي تعارض في المصالح.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا البحث بجائزة NIFA وزارة الزراعة عام 2015-67015-23488 لمخروط روجر. يشكر المؤلفون الدكتور رونالد فيلبس عن وصف لمعايير اختيار الأسهم الحضنة في شريط الفيديو. الأسود أحمد وكريم خليل يود أن يشكر مكتب التربية والثقافة المصرية في واشنطن العاصمة لتمويل أبحاث الدكتوراه.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Reproboost مركز زرع | التكنولوجيا الحيوية | هرمون إفراز هرمون اللوتين التناظرية (LHRHa) لتحريض الإباضة في إناث سمك السلور | |
| TRICAINE-S | Western Chemical. Inc. | لتخدير أسماك الحضنة أثناء حقن الهرمونات وتجريد البيض. | |
| الفينول الأحمر | سيجما ألدريتش | P0290 | 0.5٪ ، |
| مجهر ستيريو | أوليمبوس | 213709 | لتصور البيض أثناء الحقن المجهري |
| حاقن دقيق | ASI-Applied Scientific Instrumentation ؛ | نموذج MPPI-3 | لتسليم مادة الحقن في الأجنة |
| Micromanipulator | ASI-Applied Scientific Instrumentation | نموذج MM33 | لعقد والتحكم في حركة إبرة الحقن. |
| Eppendorf Microloader | Eppendorf | 5242956.003 | لتحميل محلول الحقن في إبر الحقن المجهري. |
| مجتذب إبرة عمودي | ديفيد كوبف إنسترومنتس | موديل 720 | لسحب إبر الحقن المجهري |
| Cas9 بروتين | PNA Bio Inc. | CP01 | بروتين Cas9 المؤتلف من العقدية بيروجينات. |
| توسيع نظام High FidelityPLUS PCR | Roche Diagnostics ، الولايات المتحدة الأمريكية | لاستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل وتضخيم قوالب الحمض النووي في تحضير gRNA | |
| الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات | فيشر Scientific | 1 مم القطر الخارجي (OD) ، لصنع إبر الحقن المجهري. | |
| طبق بتري | VWR | 25384-302 | لحمل الأجنة أثناء الحقن المجهري. |
| Crisco | The J.M. Smucker Company | سمن نباتي لطلاء أحواض التفريخ وأطباق بتري. | |
| حل هولتفريتر | محلي الصنع | 59 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.67 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.4 ملي هيدروكلوريد الصوديوم 3 ، 0.76 ملي كالساكلوريد 2 ، 1.67 ملي ملي كلوريد المغنيسيوم 4 لاحتضان الأجنة المحقونة الدقيقة حتى الفقس. | |
| مضاد دوكسيسيكلين هيكلات USP (أحادي الهيدرات) | الحيوي 690904 الطبي ليتكو | إلى محلول هولتفريتر إلى 10 جزء في المليون لمنع الالتهابات البكتيرية. |
المراجع
- Hammer, R. E., et al. Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection. Nature. 315, 680-683 (1985).
- Komarova, Y., Peloquin, J., Borisy, G. Components of a microinjection system. , Cold Spring Harb. Protoc. 935-939 (2011).
- Du, S. J., et al.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
