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Bioengineering

उत्पाद का चयापचय समर्थन, चुंबकीय अनुनाद माइक्रोस्कोपी अधिग्रहण के दौरान मस्तिष्क के ऊतकों में रहने वाले

Published: October 18, 2017 doi: 10.3791/56282
Automatic Translation
1,2, 2,3, 4, 2,3,5, 1,2,6
1Department of Neuroscience, University of Florida, 2McKnight Brain Institute, University of Florida, 3Department of Biomedical Engineering, University of Florida, 4Center for Functionally Integrative Neuroscience, Aarhus University, 5Department of Radiology, University of Florida, 6National High Magnetic Field Laboratory, Florida State University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक विधि है जिसके द्वारा उपयोगकर्ताओं को तीव्र हिप्पोकैम्पस और cortical स्लाइस की व्यवहार्यता चुंबकीय अनुनाद माइक्रोस्कोप डेटा के संग्रह के दौरान बनाए रखने कर सकते है का वर्णन करता है ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल चुंबकीय अनुनाद (श्री) माइक्रोस्कोपी डेटा के संग्रह के दौरान तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा की तैयारी के सामान्य चयापचय कार्यों का समर्थन करने के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का वर्णन करता है. जबकि यह रहने पर श्री संग्रह करने के लिए संभव है, उत्पाद स्तनधारी ऊतक, इस तरह के प्रयोगों परंपरागत रूप से संकल्प सीमा से विवश किया गया है और इस प्रकार ऊतक microstructure visualizing के असमर्थ हैं. इसके विपरीत, श्री प्रोटोकॉल है कि सूक्ष्म छवि संकल्प को प्राप्त किया निश्चित नमूनों के उपयोग की आवश्यकता के लिए स्थिर, लंबी स्कैन समय पर unअपरिवर्तित स्थितियों के लिए समायोजित करने की आवश्यकता है । वर्तमान प्रोटोकॉल पहले उपलब्ध श्री तकनीक है कि जीने की इमेजिंग, सूक्ष्म संकल्प पर स्तनधारी ऊतक नमूनों में सक्षम बनाता है का वर्णन । इस तरह के डेटा को समझने के लिए बहुत महत्व की है कैसे विकृति आधारित विपरीत सूक्ष्म स्तर पर होने वाले परिवर्तनों को प्रभावित ऐसे क्लिनिक में इस्तेमाल किया उन के रूप में macroscopic श्री स्कैन की सामग्री । एक बार इस तरह के एक समझ का एहसास है, अधिक से अधिक संवेदनशीलता और सटीकता के साथ नैदानिक तरीकों विकसित किया जा सकता है, जो सीधे पहले रोग उपचार, और अधिक सटीक चिकित्सा निगरानी और बेहतर रोगी परिणामों के लिए अनुवाद करेंगे ।

जबकि वर्णित पद्धति मस्तिष्क टुकड़ा की तैयारी पर केंद्रित है, प्रोटोकॉल किसी भी उत्पाद ऊतक टुकड़ा दिया है कि परिवर्तन गैस और perfusate तैयार करने के लिए ऊतक विशिष्ट चयापचय की जरूरत को समायोजित कर रहे है के लिए अनुकूल है । प्रोटोकॉल के सफल निष्पादन रहने में परिणाम, तीव्र टुकड़ा की तैयारी है कि अवधि के लिए श्री प्रसार संकेत स्थिरता प्रदर्शन करना चाहिए १५.५ ज । अन्य श्री संगत छिड़काव उपकरणों पर वर्तमान प्रणाली के प्राथमिक लाभ उच्च संकल्प छवियों और ध्यान से निरंतर, निर्बाध प्रवाह प्रदान करने की क्षमता प्राप्त करने के लिए आवश्यक श्री माइक्रोस्कोपी हार्डवेयर के साथ अपनी अनुकूलता है विनियमित perfusate शर्तें । कम नमूना प्रवाह इस डिजाइन के साथ एक विचार के रूप में केवल एक ऊतक टुकड़ा एक समय में imaged किया जा सकता है ।

Introduction

चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) प्रणालियों के रूप में तेजी से कभी उच्च क्षेत्र ताकत, संरचना और रहने वाले ऊतकों की स्थिति के बारे में अधिक जानकारी के लिए प्रगति की है समझदार बन गए हैं । इस तरह के हार्डवेयर अग्रिम के बावजूद, श्री इमेजिंग ऊतकों के सेलुलर संरचनाओं कल्पना करने के लिए पर्याप्त प्रस्तावों पर अभी भी क्लिनिक में उपलब्ध नहीं है । एक परिणाम के रूप में, नैदानिक स्कैन की सामग्री पर विचार करते समय ऊतकों की सेलुलर स्तर की विशेषताओं को आस्थगित किया जाना चाहिए । इस तरह के निष्कर्ष के बराबर मॉडल सिस्टम है जो सीधे देखा जा सकता है में लिया डेटा से बटोरी प्रक्रियाओं के ज्ञान की आवश्यकता है । परंपरागत रूप से, इन मॉडलों में Xenopus laevis oocyte और Aplysia californica L7 ंयूरॉन1,2जैसे जलीय जीवों से कोशिकाएं शामिल हैं । ये उनके असामान्य रूप से बड़े आकार के कारण श्री तरीकों के साथ अवलोकन के लिए उपलब्ध पहली पशु कोशिकाओं के बीच थे: लगभग १००० माइक्रोन और ३०० माइक्रोन व्यास, क्रमशः. हाल ही में, हार्डवेयर डिजाइन में अग्रिम स्तनधारी कोशिकाओं का सबसे बड़ा उदाहरण के लिए अनुमति दी है-α-मोटर ंयूरॉन-तय ऊतक3,4पर श्री माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग कर छवि । हालांकि इन अध्ययनों से स्तनधारी सेलुलर सामग्री के प्रत्यक्ष दृश्य का प्रदर्शन किया श्री का उपयोग कर, निश्चित नमूनों कार्यरत रहते ऊतक से उनके श्री गुण में काफी अलग है और इस तरह एक समकक्ष प्रतिनिधि मॉडल के रूप में सेवा नहीं कर सकते5, 6. इससे भी महत्वपूर्ण बात, जटिल जैविक प्रक्रियाओं के साथ संगीत समारोह में होने वाले श्री विपरीत परिवर्तन देख रहे हैं कि परेशान और इमेजिंग प्रयोग के पाठ्यक्रम पर मापा जा सकता है रहने की आवश्यकता है ।

रहने वाले ऊतकों पर श्री माइक्रोस्कोपी अध्ययन की सुविधा के लिए, एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है जो वाणिज्यिक microimaging हार्डवेयर शामिल है7 एक उद्देश्य के लिए इंटरफेस-निर्मित, श्री संगत, में बोर oxygenator और छिड़काव डिवाइस पहले8 वर्णित . इस डिजाइन के अद्वितीय लाभ स्तनधारी ऊतकों में सेलुलर स्तर संकल्प क्षमताओं और ऊतक छिड़काव की साइट पर भंग गैस सामग्री और पीएच पर सटीक नियंत्रण शामिल हैं । इसके अलावा, explant श्री अध्ययन के बहुमत जो छवि अधिग्रहण के दौरान छिड़काव बाधा प्रवाह कलाकृतियों से बचने के विपरीत, इस डिजाइन डेटा संग्रह के दौरान निरंतर छिड़काव के उपयोग का समर्थन करता है जो की शारीरिक हालत में सुधार दिखाया गया है अलग ऊतक9,10। अंत में, अपनी बंद रिकॉर्डिंग चैंबर और स्लाइस-गति कलाकृतियों जो अंयथा लंबी छवि संग्रह के दौरान हो सकता है की संभावना को कम करने में प्रतिधारण हार्डवेयर सहायता ।

जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल तीव्र हिप्पोकैम्पस और cortical स्लाइस के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त प्रक्रियाओं का वर्णन करता है, perfusate चयापचयों पर सटीक नियंत्रण इस प्रणाली के विभिंन प्रकार के ऊतकों और प्रयोगात्मक स्थितियों की एक विस्तृत सरणी को समायोजित करने के लिए सक्षम बनाता है । इस डिज़ाइन की सीमाओं में एक बहु-स्लाइस छिड़काव कक्ष11की तुलना में नमूना प्रवाह में कमी शामिल है; हालांकि, इस सीमा का उपयोग कर भविष्य में दूर किया जा सकता है बहु कुंडल arrays ।

इसके अलावा, जबकि वर्णित प्रणाली दोनों क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर विंयास में कार्यरत किया जा सकता है, मौजूदा प्रोटोकॉल एक खड़ी उंमुख, ६०० मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर में इसके उपयोग की सुविधाएं । किसी भी श्री microimaging अध्ययन में सक्षम प्रणाली-आम तौर पर संकीर्ण बोर (≤ 6 सेमी), उच्च क्षेत्र (≥ ५०० मेगाहर्ट्ज) स्पेक्ट्रोमीटर-oxygenator और छिड़काव उपकरणों को समायोजित करेंगे वर्णित है । हालांकि, इमेजिंग कुंडल, ढाल, जांच प्रणाली, या अंय आवश्यक इमेजिंग हार्डवेयर के लिए परिवर्तन छिड़काव उपकरण और श्री स्कैन मापदंडों को जरूरत परिवर्तन हो सकता है ।

Protocol

< p class = "jove_content" > सभी पशु प्रयोगों का वर्णन राष्ट्रीय अकादमियों में उल्लिखित दिशा-निर्देशों का पालन करना & #39; प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड और समीक्षा की गई और फ्लोरिडा विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित & #39; s संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) । सभी लागू नियमों और विनियमों का पालन करें जब पशु विषय अनुसंधान में संलग्न ।

< p class = "jove_title" > 1. केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के ऊतकों के रखरखाव के लिए Perfusate की तैयारी

  1. ताजा कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (aCSF) बनाते हैं ।
    1. बिकारबोनिट के 2 एल उत्पंन करने के लिए aCSF perfusate, एक 4 एल कुप्पी में डबल आसवन या रिवर्स असमस द्वारा शुद्ध पानी की १,५०० मिलीलीटर बाहर उपाय । कुप्पी में एक चुंबकीय हलचल बार प्लेस और एक हलचल प्लेट का उपयोग कर तरल आंदोलन ।
      2. शुद्ध जल में
    2. , लवण की निम्न मात्रा को भंग: १४.०३ ग्राम (१२० मिमी) सोडियम क्लोराइड, ४.३७ ग्राम (26 मिमी) सोडियम बिकारबोनिट, ०.४१ ग्राम (१.५ मिमी) monobasic पोटेशियम फॉस्फेट, ०.६९ ग्राम (१.४ मिमी) मैग्नीशियम सल्फेट heptahydrate, ०.५९ ग्राम (2 मिमी) कैल्शियम क्लोराइड डाईहाइड्रेट, ०.४५ जी (3 मिमी) पोटेशियम क्लोराइड, और ३.६ जी (10 मिमी) ग्लूकोज.
      नोट: perfusate की रासायनिक सामग्री ऊतक और प्रयोग की वांछित शर्तों के विशिष्ट चयापचय आवश्यकताओं के आधार पर अलग होगा ।
    3. इस घोल को अच्छी तरह मिलाएं जब तक कि सभी लवण घुल न जाए । 2 एल के लिए मात्रा समायोजित अतिरिक्त शुद्ध पानी का उपयोग कर ।
    4. परीक्षण aCSF के परासरणीयता का उपयोग कर एक ठंड बिंदु अवसाद osmometer । सोर्बिटोल का उपयोग करके ३०० mOsm/kg तक समायोजित करें । इसके अलावा ३२४ मिलीग्राम सोर्बिटोल के 2 L से २९९ mOsm/किग्रा aCSF perfusate परासरणीयता से ३०० mOsm/किग्रा (लगभग 1 mOsm प्रति 324mg) में वृद्धि होगी ।
      नोट: aCSF पर संग्रहित किया जा सकता 4 & #176; C एक हवा में तंग, एक अवधि के लिए सील बोतल से अधिक नहीं 24 ज.
< p class = "jove_title" > 2. छिड़काव सिस्टम को सेट करें

  1. तैयार aCSF perfusate.
    1. Equilibrate aCSF परिवेशी तापमान (~ 23 & #176; ग) के साथ बक ९५% carbogen (९५% O 2 , 5% कं 2 ; 1/16 L/प्रत्यक्ष bubbling के माध्यम से कोई कम 1 ज.
      के लिए नोट: विभिन्न ऊतक प्रकार या वांछित प्रयोगात्मक शर्तों perfusate तापमान या गैस सामग्री के समायोजन की आवश्यकता हो सकती है. perfusate में भंग गैस सामग्री के लिए वांछित शर्तों आपूर्ति गैस के व्यक्तिगत घटकों के प्रतिशत सांद्रता अलग करके ठीक नियंत्रित किया जा सकता (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ).
    2. एक बार aCSF आवश्यक तापमान और carbogen संतृप्ति तक पहुंचता है, की पुष्टि करें कि पीएच शारीरिक रेंज में है (७.३-७.४) । बुलबुला गैस के लिए जारी रखें सीधे perfusate जलाशय में (1/16 L/प्रयोग के पाठ्यक्रम में आदेश उचित भंग ऑक्सीजन सामग्री और पीएच की स्थिति स्वस्थ ऊतक चयापचय के लिए अनुकूल बनाए रखने के लिए ।
  2. प्रधानमन्त्री द छिड़काव लाइंस.
    1. सिकुड़नेवाला माइक्रो-तैयार aCSF (३०० mOsm, पीएच ७.३-७.४, लगातार डाला) में पंप से जुड़े प्रवेश ट्यूब जलमग्न ।
    2. दर्रा oxygenator डिवाइस (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ) और छिड़काव लाइनों के माध्यम से दोनों चुंबक बोर और ढाल का तार ढेर (ऊपर से नीचे) और जांच विधानसभा तक कुंडल अलग सेट. किसी भी aCSF प्रवाह को पकड़ने के लिए एक चोंच के ऊपर oxygenator को लटकाएं.
      ध्यान दें: एमआरआई प्रणाली के डिजाइन पर निर्भर करता है, छिड़काव लाइनों के लिए चुंबक बोर और ढाल कुंडल या जांच शरीर आधार के माध्यम से aCSF के साथ प्रणाली भड़काने से पहले पारित किया जा करने की आवश्यकता हो सकती है । पुष्टि करें कि छिड़काव लाइन स्थान जांच शरीर या जांच के संमिलन के विधानसभा के साथ हस्तक्षेप नहीं होगा भड़काना प्रक्रिया शुरू करने से पहले बोर में ।
    3. की पुष्टि करें प्रवाह दर (2 एमएल/मिनट) चयनित है और पंप पर स्विचन द्वारा छिड़काव लाइनों भरना शुरू करते हैं ।
    4. उल्टे खाली, में लाइन बुलबुला जाल इतना है कि aCSF अंदर समाहित हवा विस्थापन होगा.
    5. कनेक्ट the oxygenator & #39; एस गैस पोर्ट carbogen के एक दूसरे स्रोत के लिए (या तो एक कई गुना या एक माध्यमिक carbogen सिलेंडर) और 1/16L/min.
      6. की एक प्रवाह दर निर्धारित
    6. पुष्टि करते है कि carbogen के ऊपर बह रहा है oxygenator & #39; एस गैस-विनिमय झिल्ली पानी में oxygenator के शीर्ष पर निकास बंदरगाह डूबा द्वारा ।
    7. एक बार aCSF छिड़काव कक्ष से टपकाव का पता चला है, मैनुअल आंदोलन द्वारा बहिर्वाह लाइनों से किसी भी दिखाई गैस बुलबुले शुद्ध करना ।
    8. पुष्टि oxygenator छिड़काव कक्ष से बहने aCSF में ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड को मर्ज करके ठीक से काम कर रहा है.
      नोट: ऑक्सीजन मीटर पर पढ़ने की आपूर्ति की गैस के भीतर निहित ऑक्सीजन का प्रतिशत अनुमानित करना चाहिए ।
< p class = "jove_title" > 3. टिशू वडा

  1. इच्छामृत्यु
    1. एक संज्ञाहरण मशीन के प्रेरण कक्ष में एक चूहा (१२५-१५० जी) और 4 मिनट के लिए 1 L/मिनट की दर से एक ऑक्सीजन वाहक गैस में 4% isoflurane को बेनकाब ।
    2. बेहोश चूहे को संज्ञाहरण कक्ष से हटा दें ।
    3. लापरवाह स्थिति में चूहा रखकर एक लेकन पलटा परीक्षण करते हैं. किसी भी आंदोलनों के लिए जाँच करें & #8212; सिर टर्निंग, लेग लिफ्टिंग, स्पाइन ठोके, आदि & #8212; संकेत है कि पशु अपने पेट पर बदल रहा है ।
    4. एक कपास झाड़ू का उपयोग कर पशु के खुले आंख को छूने से एक आँख पलक सजगता परीक्षण प्रदर्शन करते हैं । किसी भी प्रतिक्रिया के लिए जाँच करें & #8212; ढक्कन बंद करने, मांसपेशी हिल, आदि इस संवेदी इनपुट के लिए & #8212;
    5. अंतिम रूप से, चूहा के पंजे के बीच त्वचा को चुटकी द्वारा एक अंग वापस पलटा परीक्षण प्रदर्शन & #39; s फैलाया वापस पैर चिमटी या hemostats का उपयोग कर । पैर के फ्लेक्स के लिए जांच करें ।
      नोट: एक सकारात्मक सजगता परीक्षा परिणाम के मामले में, इच्छामृत्यु के साथ आगे बढ़ना नहीं है ।
      6. घटना में
    6. है कि किसी भी तीन पलटा परीक्षणों में से एक प्रतिक्रिया बटोरता है, तुरंत संज्ञाहरण चैंबर को चूहे वापसी और 4% isoflurane के लिए जोखिम के एक अतिरिक्त 2 मिनट के लिए अनुमति देते हैं ।
    7. सभी तीन सजगता परीक्षण पर उनकी संपूर्णता में प्रदर्शन करते हैं । आवश्यक के रूप में 2 मिनट संज्ञाहरण जोखिम दोहराएँ और केवल एक बार सभी तीन सजगता परीक्षण के लिए प्रतिक्रिया का एक पूर्ण अभाव में देखा गया है.
    8. Euthanize चूहा वाया गिलोटिन decapitation.
  2. मस्तिष्क लकीर
    1. निकालो मूषक मस्तिष्क सकल विच्छेदन द्वारा । प्रवण स्थिति में सिर के साथ शुरू करो । कैंची का प्रयोग, गर्दन के पीछे से त्वचा के माध्यम से rostrally काट नाक और खोपड़ी का पर्दाफाश ।
    2. एक कुंद जांच के साथ खोपड़ी की सतह से कोमल ऊतकों को हटा दें ।
      3. caudal छोर से काम करने
    3. , cranium का प्रयोग rongeurs के पश्चकपाल, पार्श्विका, और ललाट की हड्डियों को हटा दें.
    4. माइक्रो कैंची के साथ अनुदैर्ध्य विदर के साथ काटने और वापस दोनों गोलार्द्धों से परत छीलने द्वारा बाडी reमुकर ।
    5. सिर को लापरवाह स्थिति में मोड़कर खोपड़ी से मस्तिष्क को हटा दें और ventral ओर कपाल नसों को विच्छेद कर लें.
  3. स्लाइस आइसोलेशन
    1. मस्तिष्क को प्रवण स्थिति में वापस लाने और हिप्पोकैंपस caudal करने के लिए अनुप्रस्थ करने के लिए सभी ऊतकों और विदर को निकाल कर rostral युक्त केंद्रीय भाग को अलग करें । अनुप्रस्थ विमान के साथ दो कटौती बनाओ ( यानी राज्याभिषेक स्लाइसें) एक सीधे धार रेजर के साथ ।
    2. प्रत्यय मस्तिष्क & #39; s caudal-एक vibratome काटने स्नान cyanoacrylate गोंद का उपयोग कर के केंद्र के लिए सबसे विमान ।
    3. बर्फ ठंड जोड़ें, vibratome काटने स्नान करने के लिए carbogen bubbled aCSF और जगह नायलॉन प्रतिधारण हार्डवेयर अंदर.
    4. कट ३०० & #956; मी थिक स्लाइसेस प्रति गोलार्द्ध 3 से 4 प्रयोग करने योग्य स्लाइस की तैयारी प्राप्त करने के लिए (6 से 8 कुल).
    5. एक गोलार्द्ध से एक हिप्पोकैंपस या cortical अनुभाग अलग और टुकड़ा ट्रिम कर दीजिए ताकि यह microcoil के भीतर फिट बैठता है & #39; एस 5 मिमी व्यास ऊतक अच्छी तरह से.
< p class = "jove_title" > 4. नमूना पोजीशनिंग और छिड़काव प्रणाली विधानसभा

  1. कुंडल वडा
    1. भर द म०crocoil & #39; स टिशू चैम्बर विथ oxygenated aCSF vibratome & #39; एस कटिंग बाथ प्रयोग एक ट्रान्सफर पिपेट.
    2. छंटनी मस्तिष्क नमूना ले और एक विदारक गुंजाइश का उपयोग microcoil पर (eg. पिरामिड सेल परत) ब्याज के क्षेत्र की स्थिति.
    3. डालें ऊतक प्रतिधारण डिवाइस (नायलॉन जाल नायलॉन वॉशर करने के लिए चिपका शुद्ध) इमेजिंग प्रयोग भर में नमूना स्थिति बनाए रखने के लिए.
      नोट: तीव्र प्रकाश के लिए जोखिम को कम करने के लिए नमूना पोजीशनिंग प्रक्रिया के माध्यम से जल्दी से आगे बढ़ें । एक अंतरण पिपेट.
      4. का उपयोग कर आवश्यकतानुसार अतिरिक्त oxygenated aCSF प्रदान करना
  2. कोडांतरण इन-बोर oxygenator, microcoil और जांच
    1. सुरक्षित को संशोधित microcoil assembly (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ) एक टेबल दबाना और इन-बोर oxygenator डिवाइस को सम्मिलित करके चिपकाना acetal समर्थन कुंडल के शीर्ष पर छेद में खूंटी ।
    2. छिड़काव चैंबर को microcoil & #39 पर रखकर छिड़काव प्रणाली को सील; एस ऊतक अच्छी तरह से और दो एक साथ एक लघु केबल टाई का उपयोग कर चिंच ।
    3. तार कटर का उपयोग केबल टाई से अतिरिक्त लंबाई ट्रिम कर दीजिए.
      नोट: पर सफल सील, perfusate बहिर्वाह लाइनों के माध्यम से बाहर निकलते हुए देखा जाना चाहिए और कोई रिसाव छिड़काव चैंबर के सिलिकॉन सील के आसपास स्पष्ट किया जाना चाहिए । असेंबली जांच करने से पहले इन शर्तों की पुष्टि करने के लिए विफलता इमेजिंग हार्डवेयर के लिए गंभीर क्षति हो सकती है ।
    4. एक बार aCSF अपशिष्ट जलाशय में टपकता देखा जा सकता है, microcoil और oxygenator ले और इमेजिंग जांच शरीर के शीर्ष करने के लिए विधानसभा संलग्न ।
    5. ग्रेडिएंट स्टैक असेंबली पर स्लाइड करें और ग्रैडिएंट को जांच के शीर्ष पर सीट । संबंधित प्लेसमेंट और कुंडल, oxygenator और जांच हार्डवेयर घटकों के उचित कनेक्शन का ब्यौरा तस्वीरें प्रदान की गई है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 4 ).
< p class = "jove_title" > 5. श्री छवि संग्रह का प्रदर्शन

  1. चुंबक में इकट्ठे जांच डालने
    1. जगह जांच शरीर के करीब निकटता में स्पेक्ट्रोमीटर बोर खोलने के लिए चुंबक के नीचे है ।
    2. चुंबक के शीर्ष पर बोर खोलने के माध्यम से छिड़काव लाइनों की अतिरिक्त लंबाई वापस लेना ।
    3. एक बार उपलब्ध निर्बल के सभी छिड़काव लाइनों से लिया गया है, चुंबक के आधार पर बोर में जांच शरीर अग्रिम जबकि एक साथ बोर के ऊपर से छिड़काव लाइनों से अधिक निर्बल को हटाने ।
    4. धागे की जांच के आधार पर दो शिकंजा हासिल करने के इसी स्लॉट में परत ढेर ।
    5. आगे बढ़ने से पहले, जांचें कि छिड़काव लाइनें नहीं चुटकी ली गई थी या अपशिष्ट जलाशय में पुष्टि aCSF बहिर्वाह द्वारा जांच प्रविष्टि के दौरान गुत्थी ।
      नोट: विफलता perfusate बहिर्वाह पुष्टि करने के लिए छिड़काव लाइनों और जोखिम श्री इमेजिंग हार्डवेयर को भयावह क्षति के लिए स्थाई क्षति में परिणाम कर सकते हैं ।
      6. घटना में
    6. कोई perfusate अपशिष्ट जलाशय में वापसी की रेखा से बाहर निकलते देखा है, जांच शरीर को हटाने और पुष्टि करते है कि perfusate प्रवाह reinsertion के प्रयास से पहले reहती है । इकट्ठे छिड़काव प्रणाली और इमेजिंग स्पेक्ट्रोमीटर का एक योजनाबद्ध लेआउट पहले बताया गया है < सुप class = "xref" > 8 .
  2. पिर जांच शरीर
    1. । बहिर्वाह और बहिर्वाह पानी लाइनों ढाल मिर्च से देते हैं ।
    2. ढाल मिर्च के लिए पंप पर बारी और पानी के तापमान की स्थापना की पुष्टि (19 & #176; C).
    3. एक नली दबाना का उपयोग कर जांच शरीर को एयर चिल यूनिट से हवा की नली देते हैं ।
    4. को एयर चिल यूनिट पर फ्लो घुंडी बारी & #34; 1 & #34; वरून.
      5. जांच करने वाले शव को thermocouple तार से
    5. लगायेंगे ।
    6. जांच पर रेडियो आवृत्ति (आरएफ) इनपुट/आउटपुट करने के लिए preamp से समाक्षीय केबल देते हैं शरीर & #39; s प्रोटॉन (H) channel.
    7. विद्युत केबल ग्रैडिएंट एम्पलीफायरों से जांच शरीर के लिए अनुलग्न करें ।
      8. आरएफ कैबिनेट के अंदर
    8. , B0 क्षतिपूर्ति इकाई के लिए सत्ता पर बारी, सभी तीन ढाल एम्पलीफायरों (एक्स, वाई, जेड), और मास्टर इकाई.
  3. तैयारी स्पेक्ट्रोमीटर
    1. कंसोल पर चर तापमान समायोजन मॉड्यूल का उपयोग कर बोर तापमान निर्धारित किया है ।
    2. मैच (प्रतिबाधा) और धुन (आवृत्ति) आरएफ सर्किट जांच के भीतर चर कैपेसिटर का समायोजन करके. यह जांच शरीर के आधार पर छड़ी जोड़ तोड़ से पूरा किया है ।
    3. के लिए वर्तमान सेटिंग्स समायोजित करें स्पेक्ट्रोमीटर & #39; एस के लिए नमूना पर चुंबकीय क्षेत्र एकरूपता को अधिकतम करने के लिए परत कुंडल.
  4. शुरू छवि संग्रह
    1. चुंबक बोर के भीतर अपने नमूने के स्थानिक स्थिति निर्धारित करने के लिए पायलट छवियों को इकट्ठा । एक दो आयामी ग्रैडिएंट प्रतिध्वनि के लिए विशिष्ट पैरामीटर निंनानुसार है (TR/TE = 100/4 ms, औसत = 1, नाड़ी कोण = 30 o , समय = 6 सेकंड, मैट्रिक्स = ६४ x ६४, दृश्य के क्षेत्र = ०.३ x ०.३ cm, संकल्प = ४७ x ४७ & #956; m).
    2. उचित स्कैन ज्यामिति और ऊतक स्थिति अगर लागू की पुष्टि करने के क्रम में प्रसार-भारित पायलटों को इकट्ठा । एक दो आयामी प्रसार-भारित पायलट स्कैन के लिए विशिष्ट मापदंडों के रूप में इस प्रकार है (TR/ते = 2000/11.6 ms, समय = ४.३ min, & #916; = 6 ms, & #948; = 1 ms, औसत = 1, b = १२०० (१८६० प्रभावी) s/mm 2 , मैट्रिक्स = ६४ x ६४, दृश्य के क्षेत्र = ०.२ x ०.२ सेमी , संकल्प = 31 & #956; m).
    3. तीव्र टुकड़ा तैयारी की स्थिरता विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए एक प्रसार भारित समय श्रृंखला इकट्ठा । एक दो आयामी प्रसार भारित छवि के लिए विशिष्ट मापदंडों निंनानुसार हैं (TR/TE = 2000/11.6 ms, समय = १.५ ज, & #916; = 6 ms, & #948; = 1 ms, फलां = ४२, b = १२०० s/mm 2 , मैट्रिक्स = ६४ x ६४, फील्ड ऑफ़ व्यू = ०.२ x ०.२ cm, संकल्प = 31 & #956; m). नोट: किसी दिए गए सिस्टम में निस्र्पक स्थिरता इस तरह के श्री इसके विपरीत कार्यरत (जैसे T1, टी 2, प्रसार, संवेदनशीलता), शारीरिक गड़बड़ी अध्ययन किया, और यूनिट समय प्रति श्री संकेत परिवर्तन के रूप में कारकों के आधार पर वर्णित प्रोटोकॉल से भिन्न होगा से परिणामी गड़बड़ी.

Representative Results

Perfusate तयारी

के सफल रोजगार पर में बोर ऑक्सीजन डिवाइस, आपूर्ति की carbogen में मौजूद गैसों aCSF perfusate के भीतर १००% संतृप्ति की स्थिति तक पहुंच जाएगा । यह आपूर्ति की गैस की ऑक्सीजन एकाग्रता अलग और छिड़काव चैंबर के भीतर aCSF perfusate में भंग ऑक्सीजन सामग्री में परिवर्तन को मापने के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है एक ऑक्सीजन मीटर (चित्रा 1)8का उपयोग कर । हेनरी कानून के अनुसार, भंग गैस है कि एक तरल नमूना के साथ संतुलन में है की राशि सीधे है कि गैस के आंशिक दबाव के लिए आनुपातिक प्रदान की है कि तापमान लगातार12रहता है । इस ज्ञान और परिशुद्धता गैस मानकों का उपयोग करना, यह एक aCSF नमूना के भीतर निहित के रूप में वर्णित ऑक्सीजन भंग की मात्रा को यों तो संभव है । इस ऑक्सीजन मीटर जांच द्वारा प्राप्त की है संतृप्त समाधानों का उपयोग (सीधे aCSF के 1 ज या अधिक के लिए bubbled) ज्ञात संरचना के atmosphere को उजागर किया जा रहा है: carbogen जैसे उच्च ऑक्सीजन एकाग्रता के साथ एक गैस (९५% हे2) और कम ऑक्सीजन के साथ एक और एकाग्रता जैसे नाइट्रोजन (0% O2) । इसके बाद, माप ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड की नोक एक नमूना में विलय द्वारा लिया जा सकता है । पुष्टि है कि में बोर oxygenator ठीक से काम कर रहा है छिड़काव से प्रवाह को मापने के द्वारा अच्छी तरह से प्राप्त किया जा सकता है । ऑक्सीजन मीटर से मापा ऑक्सीजन की आपूर्ति गैस में वितरित प्रतिशत एकाग्रता से मेल खाना चाहिए के रूप में भंग प्रतिशत । यदि मापा मूल्यों की आपूर्ति गैस में उन से कम कर रहे हैं, यह एक हार्डवेयर विफलता है कि ऊतक टुकड़ा में चयापचय कमी का कारण बन सकता सुझाव है ।

नमूना प्रकटन और व्यवहार

तीव्र स्लाइस की तैयारी है कि पर्याप्त छिड़काव प्राप्त करने के लिए आवश्यक चयापचयों की आपूर्ति और चयापचय अपशिष्ट दूर ले जल्दी ही रिश्तेदार स्थिरता की स्थिति तक पहुंचने । उस बिंदु से, तीव्र स्लाइसें बाहरी गड़बड़ी के अधीन किया जा सकता है और इन परिवर्तनों को अपनी प्रतिक्रियाओं वैज्ञानिक अध्ययन के लिए मापा जा सकता है । श्री प्रयोगों के लिए, समय के साथ ब्याज के संकेत ट्रैकिंग एक सामान्य रूप से इस्तेमाल किया अभ्यास तीव्र टुकड़ा तैयारी13के सापेक्ष स्थिरता प्रदर्शित करने के लिए है. प्रसार भारित संकेत विशेष रूप से एक ऊतक के पानी की गतिशीलता में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है, सामग्री, और वितरण, के रूप में कोरोनरी स्ट्रोक में infarcts का पता लगाने के लिए इस विपरीत तंत्र के उपयोग की सराहना की जा सकती है14,15. छिड़काव शर्तों की एक किस्म के तहत बनाए रखा तीव्र cortical स्लाइस में समय पर सामान्यीकृत प्रसार संकेत प्लॉटिंग ऊतक अलगाव प्राप्त किया है (चित्रा 5) के बाद अपेक्षाकृत स्थिरता (2 ± 3% से अधिक १५.५ ज) प्रदर्शित करता है. प्रसार संकेत स्थिरता छिड़काव शर्तों (आंतरायिक या निरंतर) या एमआरआई स्कैन लंबाई (कम [4 मिनट] या लंबी [१.५ एच])8की परवाह किए बिना बनाए रखा गया था । यदि स्लाइस समय के साथ संकेत स्थिरता प्रदर्शित नहीं करते हैं, जैसे कि तेज प्रसार संकेत वृद्धि प्रांतस्था है कि छिड़काव प्राप्त नहीं किया था में मनाया, यह इष्टतम प्रयोगात्मक शर्तों के सुझाव है । गड़बड़ी प्रयोगों से पहले टुकड़ा की तैयारी में स्थिर संकेत शर्तों की पुष्टि करने का प्रयास नहीं किया जाना चाहिए ।

संकेत स्थिरता के अलावा, सही नमूना पोजीशनिंग छवि संग्रह के समय की पुष्टि की जानी चाहिए । हालांकि नमूना स्थिति विदारक माइक्रोस्कोप पर ऊतक प्लेसमेंट के दौरान नियंत्रित किया जाता है, नमूना स्थिति में बदलाव छिड़काव तंत्र के विधानसभा के दौरान हो सकता है, या तार या जांच चुंबक में प्रविष्टि से पहले किसी न किसी से निपटने के कारण । उचित हिप्पोकैम्पस स्थान की पुष्टि कम (2 मिनट), प्रसार कंट्रास्ट (चित्रा 6) के साथ पायलट स्कैन इकट्ठा करके प्राप्त किया जा सकता है । क्योंकि पिरामिडीय कोशिका परत सन्निकट हिप्पोकैम्पस laminae की तुलना में भार फैलाना अधिक संवेदनशील है, इस संरचना को प्रसार-भारित छवियों में एक गहरा बैंड के रूप में दिखाई देगा. इस विशेषता सुविधा प्रदर्शित नहीं setups ऑफ़-सेंटर नमूने होते है और संभावना को दोहराया जा करने की आवश्यकता होगी ।

Figure 1
चित्रा 1: आपूर्ति की गैस में प्रतिशत ओ2 सामग्री के एक समारोह के रूप में aCSF perfusate के ऑक्सीजन सामग्री भंग. Carbogen ऑक्सीजन के चर सांद्रता युक्त मिश्रण (९५%, ६०%, और 19%) एक आपूर्ति गैस के रूप में कार्यरत हैं । प्रतिशत भंग ऑक्सीजन रीडिंग तो छिड़काव से अच्छी तरह से लिया और दो ज्ञात नियंत्रण की तुलना में कर रहे हैं: एक perfusate जलाशय सीधे carbogen के साथ bubbled (९५% हे2), और एक perfusate जलाशय वायुमंडलीय परिस्थितियों से अवगत कराया (23% हे2 ). प्रत्येक मामले में, ऊतक छिड़काव के स्थल पर प्रतिशत ऑक्सीजन संतृप्ति का उपयोग किया carbogen मिश्रण के भीतर हे2 एकाग्रता के १००% दृष्टिकोण । त्रुटि पट्टियां नमूना means के मानक विचलन के बराबर हैं । चित्रा मूल अनुच्छेद8से अनुमति के साथ reproduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: में oxygenator और छिड़काव चैंबर बोर के योजनाबद्ध ड्राइंग । यह आरेख इन महत्वपूर्ण डिवाइसों के फ़ंक्शन के लिए ज़िंमेदार विस्तृत डिज़ाइन तत्वों को दिखाता है । एक बुलबुला जाल के माध्यम से पंप किया गया है कि ताजा perfusate एक 10 मिमी एनएमआर ट्यूब के शीर्ष के माध्यम से oxygenator में प्रवेश करती है । ऐसा करने में, यह एक उच्च गैस पारगंय सिलिकॉन टयूबिंग (नीला खंड) है कि एक खुले समाप्त, 5 मिमी एनएमआर अंदर नेस्टेड ट्यूब के आसपास कुंडलित है में संक्रमण । Carbogen 5 मिमी ट्यूब के शीर्ष के माध्यम से आपूर्ति की गैस खुले समाप्त नीचे के माध्यम से चैंबर में प्रवेश करती है और 10 mm ट्यूब कैप में एक वेंट छेद के माध्यम से oxygenator बाहर निकलने से पहले coiled सिलिकॉन टयूबिंग से अधिक गुजरता है । इस जोखिम के दौरान, सिलिकॉन ट्यूब के माध्यम से बह perfusate आपूर्ति की गैस के मिश्रण के रासायनिक घटकों के साथ संतृप्त हो जाता है । oxygenator से बाहर निकलने पर, perfusate एक अपशिष्ट संग्रह जलाशय के लिए अग्रणी वापसी लाइन में प्रवेश करने से पहले छिड़काव कक्ष में सीधे गुजरता है । अंय इस डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण घटक acetal समर्थन खूंटी जो oxygenator संशोधित आरएफ microcoil, एक सिलिकॉन वॉशर (लाल अंगूठी) जो oxygenator छिड़काव चैंबर के बीच तरल तंग सील रूपों के ऊपर खड़ी खड़ा करने की अनुमति देता शामिल है और microcoil ऊतक अच्छी तरह से, और केबल टाई पायदान जो एक केबल इस प्रतिवर्ती मुहर फार्म का इस्तेमाल टाई के स्थान को समायोजित करता है । यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और मूल अनुच्छेद8से अनुमति के साथ reproduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: microcoil विधानसभा जो करने के लिए इंटरफ़ेस परमिट में संशोधन-oxygenator बोर । दो खांचे ३.० मिमी x १.५ मिमी (काले तीर) विधानसभा के पक्ष में काट रहे थे कि एक केबल छिड़काव चैंबर सील इस्तेमाल टाई की चौड़ाई समायोजित । एक चैनल (15 मिमी x 3 मिमी x 4 मिमी) कुंडल का पिछला चेहरा भर पेड़ों जोड़ता है. दो नायलॉन स्थान चैनल के पक्ष में रखा (लाल तीर) केबल टाई सिर जो सीलिंग प्रक्रिया को आसान बनाता है के लिए एक पकड़ने के रूप में कार्य करते हैं । एक छेद (2 मिमी x 14 मिमी) ड्रिल्ड कुंडल विधानसभा के शीर्ष (पीला आगमनओ) oxygenator को सुरक्षित करने के लिए acetal का समर्थन करने के लिए मिलती है । यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और मूल अनुच्छेद8से अनुमति के साथ reproduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: तस्वीर असेंबल संबंधित नियुक्ति और microcoil, oxygenator, और जांच घटकों के उचित विधानसभा का ब्यौरा । इन छवियों में बोर oxygenator और microperfusion डिवाइस के प्रमुख हार्डवेयर घटक सुविधा और उदाहरण देकर स्पष्ट करना कि कैसे एक दूसरे के साथ अलग भागों इंटरफेस । (क) विस्फोट-देखने के सभी घटकों के सापेक्ष नियुक्ति से पहले ऊतक अच्छी तरह से या जांच शरीर के विधानसभा सील करने के लिए फोटो । देखभाल के लिए भागों के सापेक्ष स्थान सही प्रदर्शन लिया गया है; हालांकि, छिड़काव रेखाओं का एक अनुभाग इस श्रृंखला में वापस दुगुना कर दिया गया है ताकि सभी घटक छवि फ़्रेम के भीतर फ़िट हो जाएं । (1 = जांच सिर, 2 = microcoil विधानसभा, 3 = नायलॉन ऊतक प्रतिधारण अंगूठी, 4 = छिड़काव अच्छी तरह से, 5 = केबल टाई, 6 = में बोर oxygenator, 7 = ढाल कुंडल, 8 = बुलबुला जाल) । (ख) निम्नलिखित कुंडल और oxygenator विधानसभा घटक. इस छवि में, नायलॉन प्रतिधारण अंगूठी है microcoil ऊतक के भीतर रखा गया है अच्छी तरह से एक नमूना सुरक्षित । oxygenator के आधार पर acetal समर्थन खूंटी microcoil के शीर्ष पर इसी छेद में सुरक्षित किया गया है । छिड़काव के खुले अंत पर सिलिकॉन गैसकेट अच्छी तरह से ऊतक पर रखा गया है, और एक केबल टाई इन घटकों के आसपास कड़ा किया गया है छिड़काव चैंबर सील । अन्त में microcoil का आधार जांच विभागाध्यक्ष के ऊपर से जुड़ा हुआ है । (ग) घटक जांच विधानसभा के बाद । पिछले पैनल में, केबल टाई से अधिक लंबाई microcoil के साथ फ्लश छंटनी की गई है । ढाल का तार ढेर तो ध्यान से जांच की ओर सिलेंडर आगे बढ़ रहा है जबकि अतिरिक्त छिड़काव लाइनों, oxygenator, और इसके खोखले केंद्र के माध्यम से microcoil के माध्यम से पारित करने की स्थिति में गिरावट है । एक बार ढाल जांच सिर से जुड़े होते हैं, वे जगह में ढाल के लड़ी पिरोया आधार पर जांच पर सुरक्षा कॉलर पंगा लेना द्वारा आयोजित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: superfused एक्यूट cortical स्लाइस में प्रसार संकेत स्थिरता । (क) चार तीव्र superfusion मानदंड भिंन करने के लिए अधीन स्लाइस में सामान्यीकृत प्रसार संकेत मूल्यों २१.५ एच के बाद इच्छामृत्यु की अवधि के लिए समय पर साजिश रची है । स्लाइस १५.५ ज की अवधि के लिए अपने प्रारंभिक प्रसार संकेत माप के ± 5% के भीतर रहने की परवाह किए बिना कि superfusion सतत या आंतरायिक और श्री स्कैन लंबाई के स्वतंत्र है (१.५ ज या 4 मिनट) । formaldehyde से ली गई सिग्नल रिकॉर्डिंग-फिक्स्ड प्रांतस्था सकारात्मक नियंत्रण (n = 1) के रूप में स्थिर ऊतक नमूनों की स्थैतिक, अपरिवर्तनीय प्रकृति के कारण स्थिरता के लिए सेवा करते हैं । इसके विपरीत, प्रसार संकेत superfusion समर्थन (n = 1) के एक जीवित टुकड़ा अनुपस्थित में मापा चयापचय की कमी के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है । विभिन्न superfusion परीक्षणों के प्रयोग पैरामीटर निम्नानुसार हैं: सतत (superfusion पर हमेशा, स्कैन प्रति समय = १.५ ज), आंतरायिक (स्कैन के बीच 10 मिनट के अंतराल के लिए superfusion पर, स्कैन प्रति समय = १.५ ज), लंबे अंतराल, लंबे समय तक स्कैन (superfusion पर स्कैन के दौरान, लेकिन स्कैन के बीच 10 मिनट के लिए रोका गया, स्कैनिंग प्रति समय = १.५ ज), लंबे अंतराल, लघु स्कैन (स्कैन के बीच १.५ h अंतराल के लिए superfusion पर, स्कैन प्रति समय = 4 मिनट). (ख ) पैनल (ए) से चार रहते स्लाइस superfusion प्रयोगों के समूह का मतलब दिखा डेटा का विश्लेषण किया. समूहीकृत, superfused cortical स्लाइस से प्रसार संकेत प्रोफ़ाइल समय के साथ थोड़ा बदलाव दर्शाती है (2 ± 3% से अधिक १५.५ ज) जबकि गैर perfused नियंत्रण (n = 1) प्रदर्शन नाटकीय संकेत अस्थिरता जल्दी प्रयोग में (15% द्वारा ६.५ ज) । यह आंकड़ा संशोधित किया गया है और मूल अनुच्छेद8से अनुमति के साथ reproduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: पायलट इमेजिंग के दौरान हिप्पोकैम्पस स्लाइस प्लेसमेंट की पुष्टि. एक विस्तारित श्री माइक्रोस्कोपी सत्र चलाने से पहले, नमूना के सही स्थान ऐसे स्कैनर समय और महंगी perfusate additives के रूप में संसाधनों को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है बर्बाद नहीं कर रहे हैं. हिप्पोकैंपस के CA1 क्षेत्र में पिरामिडीय कोशिका परत तेज (४.३ मिनट) में visualized किया जा सकता है, कम संकल्प (31 माइक्रोन x 31 माइक्रोन में विमान) पायलट स्कैन करने के लिए ब्याज की ऊतक माइक्रो-कुंडल के संबंध में सही ढंग से रखा गया है सुनिश्चित करने के लिए. स्कैन पैरामीटर दोनों छवियों के लिए आम इस प्रकार हैं: TR/TE = 2000/11.6 ms, Δ = 6 ms, Δ = 1 ms, औसत = 1 । (A) b = 0 (२२७ प्रभावी) s/mm2. इस प्रारंभिक स्कैन में, परत pyramidale सिर्फ एक ग्रे, विकर्ण है कुंडल उत्तेजना प्रोफ़ाइल में केंद्रित बैंड के रूप में ही दिखाई है । (b) b = १,२०० (१,८६० प्रभावी) s/2. अधिक प्रसार भार में, interlamellar विपरीत बढ़ाता है के रूप में पिरामिड कोशिका परत आसंन laminae में ऊतकों से गहरा हो जाता है (ऊपर: परत oriens; नीचे: परत radiatum) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

वर्तमान प्रोटोकॉल तीव्र मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी के मानक चयापचय रखरखाव चुंबकीय अनुनाद माइक्रोस्कोपी के दौर से गुजर के लिए आवश्यक प्रक्रियाओं का वर्णन करता है । इस प्रक्रिया को केवल वर्तमान में उपलब्ध है कि समाधान कोशिकाओं को हल करने में सक्षम संकल्प पर श्री के साथ रहने वाले स्तनधारी ऊतकों के दृश्य की अनुमति देता है विधि है । जबकि perfusate शर्तों वर्णित केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के ऊतकों के लिए विशेष रूप से सिलवाया रहे हैं, प्रोटोकॉल व्यापक रूप से perfusate और गैस घटकों के समायोजन के माध्यम से ऊतक तैयार रहने के रूप में अच्छी तरह से छिड़काव प्रवाह दर के किसी भी तरीके से अनुकूलनीय है और तापमान ।

सबसे आम समस्याओं को वर्णित प्रक्रियाओं के दौरान सामना करने की संभावना metabolite आपूर्ति में विफलताओं से संबंधित शामिल हैं । कैल्शियम लवण की वर्षण बिकारबोनिट बफ़रिंग सिस्टम में विफलताओं का एक परिणाम के रूप में गैसीय कमी के दौरान aCSF के अंदर हो सकता है । ऐसी हाला छिड़काव लाइनों को रोकना और गंभीर हार्डवेयर क्षति में परिणाम कर सकते हैं । यदि नमक हाला perfusate निंनलिखित जांच विधानसभा में मनाया जाता है, सिकुड़नेवाला पंप बंद करके तुरंत छिड़काव प्रवाह संघर्ष । perfusate में पर्याप्त सोडियम बिकारबोनिट स्तरों (४.३७ g/2 L) की उपस्थिति की पुष्टि करें, सह2 स्तर (आपूर्ति गैस में ५.०%), और जलाशय और oxygenator दोनों में carbogen गैस का प्रवाह (1/16 l/ अंत में, पुष्टि पीएच स्तर शारीरिक रेंज (७.३-७.४) में स्थिर रहे हैं । घटना में है कि ऑक्सीजन गैस और पीएच स्तर अभी भी उचित रूप से विनियमित नहीं कर रहे हैं, गैस विनिमय झिल्ली प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए ।

स्लाइस का इरादा प्रयोगात्मक समय-पाठ्यक्रम पर संकेत स्थिरता प्रदर्शित नहीं करते हैं, तो सही रासायनिक घटक aCSF मिश्रण में मौजूद हैं कि पुष्टि करें और सही परासरणीयता (३०० mOsm) और पीएच (७.३-७.४) बनाए रखा जाता है कि. इसके अलावा, यह सुनिश्चित carbogen गैस perfusate जलाशय और oxygenator को 1/16 L/मिनट पर आपूर्ति की जा रही है । इन चरणों perfusate शर्तों को सही नहीं है, तो गैस के प्रतिस्थापन-विनिमय झिल्ली की सलाह दी है । यदि perfusate शर्तों के निवारण के बाद ऊतक स्थिरता प्राप्त नहीं है, ऊतक फसल और छिड़काव आवेदन के बीच समय अंतराल को कम करने पर ध्यान देने के साथ सर्जिकल प्रोटोकॉल के शोधन पर विचार करें ।

Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

इस कार्य के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01) (S10RR031637), और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (सहकारी समझौता सं. DMR-११५७४९०) के माध्यम से राष्ट्रीय उच्च चुंबकीय क्षेत्र प्रयोगशाला (NHMFL) उंनत चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग और स्पेक्ट्रोस्कोपी (AMRIS) की सुविधा पर और राज्य के फ्लोरिडा के ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusate Preparation
Osmette A Precision Systems Inc. 5002 freezing point depression osmometer
Stir Plate Type 1000 Barnstead/Thermodyne SPA1025B magnetic stir plate with heating element
Accumet Basic pH Meter Fisher Scientific AB15 pH Meter
pH Probe Fisher Scientific 13-620-AP61 probe for pH measurement
Oxygen Meter Microelectrodes Inc. OM-4 meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates
Oxygen Electrode Microelectrodes Inc. MI-730 microprobe for the oxygen meter
Scale Denver Instrument Co. A-160 microscale for weighing chemical components
Name Company Catalog Number Comments
Slice Preparation
Lancer Vibratome Ted Pella Inc. Series 1000 vibratory tissue slicer
Disecting Microscope Carl Zeiss Inc. OPMI 1-FC tabletop, binocular disecting microscope
Name Company Catalog Number Comments
Perfusion System
Masterflex L/S Cole-Parmer 7523-50 peristaltic micro perfusion pump
Oxygen Regulators x 2 Victor Medical VMG-05LY device for regulating gas flow
e-sized carbogen cylinders x 2 Airgas gas tanks containing carbogen gas
in-bore oxygenator developed in house device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate
Name Company Catalog Number Comments
MR Imaging Hardware
Micro Surface Coil (200mm dia., modified) Bruker Biospin B6371/0001 four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil
Micro 5 probe body Bruker Biospin Z3395 microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer
Micro 5 gradient coils Bruker Biospin M81111 gradient coil stack used with micro 5 probe body
600 MHz Spectrometer Oxford Instruments superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation
Imaging Console Bruker Biospin Avance III support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation
Air Blower Bruker Biospin BCU-II, -80/60 Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore
Gradient Chiller Thermo Scientific Neslab Merlin M33 Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils

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References

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Flint, J. J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition. J. Vis. Exp. (128), e56282, doi:10.3791/56282 (2017).

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