Summary
현재 프로토콜 있는 사용자가 자기 공명 현미경 데이터의 수집 하는 동안 급성 hippocampal 및 대뇌 피 질의 조각 준비의 유지할 수 있는 방법을 설명 합니다.
Abstract
이 프로토콜의 자기 공명 (MR) 현미경 데이터 수집 중 급성 뇌 슬라이스 준비의 정상적인 신진 대사 기능을 지 원하는 데 필요한 절차를 설명 합니다. 생활, 삭제 포유류 조직에 씨 컬렉션을 수행할 수 있지만, 이러한 실험 해상도 제한에 의해 제한 된 전통적으로 있다 하 고 따라서 조직 미세를 시각화 할 수 있다. 반대로, 미세한 이미지 해상도 달성 한 미스터 프로토콜 긴 검사 시간 동안 정적, 변하지 않는 조건에 대 한 필요성에 맞게 고정된 샘플의 사용을 해야 합니다. 현재 프로토콜 미세한 해상도에서 생활, 포유류 조직 샘플의 이미지를 가능 하 게 첫 번째 사용 가능한 미스터 기법을 설명 합니다. 이러한 데이터는 어떻게 병 리 기반 대비 변화 미세한 수준 영향에서 발생 병원에서 사용 하는 등 거시적인 미스터 검사의 내용 이해에 매우 중요. 일단 이러한 이해, 더 큰 감도 정확도와 진단 방법을 개발할 수 있습니다, 이전 질병 치료, 더 정확한 치료 모니터링 및 향상 된 환자 결과를 직접 번역할 수 있는 실현 된다.
설명된 방법론 뇌 조각 준비에 초점을 맞추고, 하는 동안 프로토콜은 어떤 삭제 조직 조각에 주어진 조직의 대사 요구에 맞게 가스 perfusate 준비 변경. 프로토콜의 성공적인 실행 15.5 h까지 동안 미스터 확산 신호 안정성을 전시 하는 생활, 급성 슬라이스 준비 발생 한다. 다른 미스터 호환 관류 기구에는 현재 시스템의 주요 장점은 높은 해상도 이미지와 신중 하 게와 일정, 중단 흐름을 제공 하는 능력을 달성 하는 데 필요한 미스터 현미경 하드웨어와의 호환성 규제 perfusate 조건입니다. 하나의 조직 조각을 한 번에 몇 군데 있습니다 감소 샘플 처리량이 설계 고려 사항입니다.
Introduction
자기 공명 영상 (MRI) 시스템 꾸준히 진행 하 고 있으므로 적 높은 분야 강점, 구성 및 조직 생활의 상태에 대 한 자세한 내용은 뚜렷한 되고있다. 이러한 하드웨어 발전에도 불구 하 고 직물의 세포질 구조를 시각화 하는 충분 한 해상도에서 이미징 미스터 병원에서 아직 사용할 수 없습니다입니다. 그 결과, 임상 검사의 내용을 고려할 때 조직의 세포 수준 특성을 유추 해야 합니다. 이러한 유추는 직접 관찰 될 수 있는 모델 시스템에서 가져온 데이터에서 얻은 동등한 프로세스의 지식이 필요 합니다. 전통적으로,이 모델 Xenopus laevis oocyte Aplysia californica L7 신경1,2등 수생 생물에서 세포 포함. 이들은 관찰 미스터 방법 그들의 예외적인 큰 크기 때문에 사용할 수 있는 첫 번째 동물 세포 중: 약 1000 μ m 및 300 μ m 직경, 각각. 더 최근에, 하드웨어 디자인에 진보 포유류 세포의 가장 큰 예제 중 하나에 대 한 허용-α-모터 신경-고정된 조직3,4미스터 현미경 검사 법 기술을 사용 하 여 이미지 수를. 이러한 연구 시연 씨를 사용 하 여 포유류 세포 물질의 직접적인 시각화, 고정된 샘플 고용 살아있는 조직에서 그들의 미스터 속성에 크게 차이가 고 동등한 대표 모델5, 따라서 역할 수 없습니다. 6. 더 중요 한 것은, 복잡 한 생물 학적 과정을 콘서트에서 발생 하는 미스터 대비 변화 관찰 불안정 하 고 이미징 실험의 과정을 통해 측정 될 수 있는 생활 샘플을 필요 합니다.
생활 조직에 미스터 현미경 연구를 촉진 하기 위하여 프로토콜 상업 microimaging 하드웨어7 하는 목적, 미스터 호환, 구멍에서 oxygenator 관류 장치 앞에서 설명한8 인터페이스를 포함 하 여은 . 이 디자인의 독특한 장점을 포유류 조직 및 녹은 가스 콘텐츠 및 조직 관류의 사이트에서 pH 정밀 제어에 세포 수준의 해상도 기능을 포함합니다. 또한, 관류 흐름 유물을 피하기 위해 이미지 수집 동안 인터럽트는 explant 미스터 연구의 대부분과 달리이 디자인의 생리 적인 상태를 개선 하기 위해 표시 되었습니다 데이터 수집 하는 동안 지속적인 관류를 사용 하 여 지원 절연 조직9,10. 마지막으로, 모션 아티팩트는 동안 발생할 수 있는 가능성을 줄이는 닫힌된 녹음 실과 슬라이스 고정 하드웨어 원조는 이미지 컬렉션을 연장.
현재 프로토콜 급성 hippocampal 및 대뇌 피 질의 조각으로 사용 하기 위해 적절 한 절차를 설명 합니다, 하는 동안 perfusate 대사 산물 정밀 하 게 제어 다양 한 다양 한 조직 유형 및 실험 조건에 맞게이 시스템을 수 있습니다. 멀티 슬라이스 관류 챔버11; 비교 샘플 처리량에서 감소를 포함 하는이 디자인의 한계 그러나,이 제한 미래에 멀티 코일 배열을 사용 하 여 극복할 수 있습니다.
또한, 설명된 시스템 수평 또는 수직 구성에서 채택 될 수 있다, 하는 동안 현재 프로토콜 세로 방향된, 600 MHz 분석기 사용을 갖추고 있습니다. 미스터 microimaging 연구의 모든 시스템-일반적으로 좁은 구멍 (≤6 cm), 높은 분야 (≥500 m h z) 분석기-설명 oxygenator 및 살포 장비를 수용할 것입니다. 그러나, 이미징 코일, 그라데이션, 프로브 시스템 변경, 또는 다른 필수 이미징 하드웨어 고용 관류 장비와 미스터 스캔 매개 변수를 변경 해야 수 있습니다.
Protocol
설명 하는 모든 동물 실험 과학의 국가 아카데미에 명시 된 지침에 따라 ' 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드 및 검토 하 고 프로 리 다의 대학에 의해 승인 했다 ' s 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC) 모든 적용 가능한 규칙 및 규정을 준수 하는 동물 주제 연구에 종사 하는 때.
1. 유지 보수의 중앙 신경 조직에 대 한 Perfusate의 준비
- 신선한 인공 척수 (실제) 확인.
- 생성 중 탄산염 버퍼 실제 perfusate의 2 리터, 물 4 L 플라스 크에 의해 두 배 증 류 법 또는 역삼 투 정화의 1500 mL 측정
- . 플라스 크에 자석 저 어 바 하 고 저 어 접시를 사용 하 여 액체를 선동.
- 순화 된 물으로 분해 다음 양의 소금: 염화 나트륨 14.03 g (120 m m), 4.37 g (26mm) 나트륨 중 탄산염, 0.41 g (1.5 m m) 이수소 칼륨 인산 염, 0.69 g (1.4 m m) 황산 마그네슘 heptahydrate, 0.59 g (2mm) 칼슘 이 염화 수화물, 0.45 g (3mm) 칼륨 염화 물, 그리고 3.6 g (10 mM) 포도 당.
참고:는 perfusate의 화학 내용을 조직과 실험의 원하는 조건 특정 신진 대사 요구 사항에 따라 달라 집니다. - 모든 염 해산 할 때까지이 솔루션을 철저 하 게 혼합. 2 l 추가 순화 된 물을 사용 하 여 볼륨을 조정 합니다.
- 실제 어는 점 우울증 osmometer를 사용 하 여의 osmolality를 테스트 합니다. 300 조정 mOsm/kg sorbitol을 사용 하 여. 299 mOsm/kg 실제 perfusate의 2 l 324 mg sorbitol의 추가 300 mOsm/kg (324 밀리 그램 당 약 1 mOsm) osmolality 늘어난다.
참고:는 실제 24 h. 초과 하지 기간에 대 한 밀폐, 밀봉 된 병에 4 ° C에서 저장 될 수 있다
2. 설정를 관류 시스템
- 준비 실제 perfusate.
- 평형 온도 (~ 23 ° C) 이상 1 헤에 대 한 직접 버블링을 통해 95 %carbogen (95% O 2, 5% CO 2, 1/16 L/min)와 가스 동안에 실제
참고: 다른 조직 유형 또는 원하는 실험 조건 perfusate 온도 또는 가스 내용을 조정을 해야 합니다. 녹은 가스 콘텐츠는 perfusate에 대 한 원하는 조건을 정확 하 게 공급 가스 ( 그림 1)의 개별 구성 요소의 백분율 농도 변화 하 여 제어할 수 있습니다. - 는 실제에 필요한 온도 및 carbogen 채도, 도달 pH 생리 범위 (7.3-7.4)에 제공 하는지 확인 합니다. 계속 거품 가스 perfusate 저수지 (1/16 L/min)에 직접 실험의 과정을 통해 적절 한 녹은 산소 함유량과 pH 조건 건강 한 조직 대사에 도움이 유지.
- 평형 온도 (~ 23 ° C) 이상 1 헤에 대 한 직접 버블링을 통해 95 %carbogen (95% O 2, 5% CO 2, 1/16 L/min)와 가스 동안에 실제
- 관류 라인 프라임.
- 입구 튜브 준비 실제 (300 mOsm, pH 7.3-7.4, 지속적으로 기름)에 연동 마이크로 펌프에 연결 하는 Submerge.
- 패스는 oxygenator 장치 ( 그림 2)와 둘 다를 통해 관류 라인 자석 구멍 그리고 그라데이션 코일 스택 (위에서 아래로) 프로브 어셈블리까지 옆으로 코일을 설정. 어떤 실제 폐수를 잡으려고 비 커 위에 oxygenator 꽉.
참고: MRI 시스템 디자인 따라 관류 라인 실제 시스템과 못쓰게 이전 기본 자석 구멍 및 그라데이션 코일 또는 프로브 본체 통해 전달 되도록 할 수 있습니다. 그 관류 라인 배치 프로브 본체 또는 못쓰게 절차를 시작 하기 전에 구멍에 프로브 삽입의 어셈블리 간섭 하지 것입니다 확인. - 의도 유량 (2 mL/min) 선택 확인 하 고 펌프에 의해 관류 라인을 작성 시작.
- 실제 공기 안에 포함 된 치환 됩니다 있도록 빈, 인라인 거품 트랩 반전.
- 는 oxygenator 연결 ' s 포트 carbogen (는 매니폴드 또는 보조 carbogen 실린더)의 두 번째 소스에 가스와 1/16 L/분의 유량을 설정
- 그 carbogen는 oxygenator 통해 흐르는 확인 ' s 가스 교환 막 물으로는 oxygenator 위에 배기 포트를 담거 서.
- 실제 관류 상공에서 떨어지는 감지 되 면 일단 모든 보이는 가스 거품에서에서 깨끗이 유입 라인 수동 동요에 의해.
- 는 oxygenator 산소 전극 관류 상공에서 흐르는 실제에서 잠수 하 여 제대로 작동 확인.
참고: 산소 미터에 읽기 제공 된 가스 내에 포함 된 산소의 비율이 비슷해야.
3. 조직 준비
- 안락사
- 장소 4 분 대 1 L/min의 속도로 가스 마 취 기계와 산소 캐리어에 4 %isoflurane 폭로의 유도 챔버로 쥐 (125-150 g)
- 마 취 약 실에서 의식이 쥐 제거.
- 부정사 위치에 쥐를 두어서 righting 반사 테스트를 수행 합니다. 모든 움직임에 대 한 확인 — 머리도, 다리 운동, 척추 중 유연, 등 — 동물의 뱃속에도 지표.
- 면봉을 사용 하 여 동물의 오픈 눈으로 눈 깜박임 반사 테스트를 수행 합니다. 어떤 응답에 대 한 확인 — 폐쇄, 근육 경련, 등 뚜껑 —이 감각 입력에.
- 마지막으로, 수행을 쥐의 발가락 사이 피부를 곤란 하 게 하 여 반사 테스트 사지 철회할 ' s hemostats 또는 핀셋을 사용 하 여 다시 다리를 뻗은. 다리의 굴곡에 대 한 확인
참고: 경우 긍정적인 재귀 테스트 결과, 안락사를 진행 하지 마십시오. - 3 반사 테스트 중 하나라도 응답을 elicits, 그 쥐를 마 취 약 실에 즉시 반환 하 고 4 %isoflurane 노출의 추가 2 분 동안 허용.
- 전체에서에 모든 3 개의 반사 테스트를 수행합니다. 필요에 따라 2 분 마 취 노출을 반복 하 고 모든 3 재귀 테스트 응답의 완전 한 부족은 관찰 한 번만 진행.
- 단두대 잘린 통해 쥐를 안락사.
- 뇌 절제술
- 심한 해 부에 의해 쥐 뇌를 제거. 경향이 위치에 머리와 함께 시작 합니다. 가 위를 사용 하 여 rostrally 코에는 목의 뒤쪽에서 피부를 통해 잘라내어 두개골 노출.
- 무딘 프로브 두개골의 표면에서 부드러운 조직 제거.
- 꼬리 끝에서 작업 제거 후 두, 정수 리, 정면 뼈 rongeurs를 사용 하 여 두개골의.
- 마이크로 위는 fissure 따라 절단 하 고 두 반구에서 레이어를 다시 박 리 하 여 경질을 철회.
- 부정사 위치로 머리를 선회 하 고 복 부 측에 두개골 신경을 severing 하 여 두개골에서 뇌를 제거.
- 슬라이스 격리
- 경향이 위치에 두뇌를 반환 하 고 모든 조직을 가로 균열에 꼬리는 fimbria rostral 제거 하 여 해 마를 포함 하는 중앙 부분을 분리. 직선형 면도기와 가로 평면 (즉 코로나 조각) 두 컷 확인.
- 두뇌 부착 ' cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 vibratome 절단 목욕의 센터에 s 꼬리 대부분 비행기.
- Carbogen 부풀어 실제 vibratome 절단 목욕 하 고 내부 나일론 보존 하드웨어, 얼음 처럼 차가운 추가.
- 반구 (총 6-8) 당 3 ~ 4 사용 가능한 슬라이스 준비를 잘라 300 μ m 두꺼운 조각.
- 해 마 나 대뇌 피 질의 섹션 1 개 반구에서 분리 하 고는 microcoil 안에 맞도록 조각 트림 ' s 5 m m 직경 조직을 잘.
4. 위치 및 관류 시스템 어셈블리
- 채우기 mi 준비 코일crocoil '는 vibratome에서 산소 실제와 s 조직 챔버 ' 전송 피 펫을 사용 하 여 s 절단 목욕.
- 트림된 뇌 샘플 고 관심 영역을 위치 (예:. 피라미드 셀 레이어) 해 범위를 사용 하 여 microcoil 이상의.
- 삽입 조직 고정 장치 (나일론의 메쉬 나일론 세탁기에 부착 된 그물) 이미징 실험을 통해 샘플 위치를 유지 하.
참고: 샘플 위치 강렬한 빛에 노출을 최소화 하는 절차를 신속 하 게 진행 합니다. 전송 피 펫을 사용 하 여 필요에 따라 추가 산소 실제 제공.
- 조립 구멍에 oxygenator, microcoil 및 프로브
- 수정된 microcoil 어셈블리 ( 그림 3) 테이블 클램프에 고정 하 고 삽입 하 여 구멍에 oxygenator 장치를 부착 합니다 코일 위에 구멍에 아 세 탈 지원 못.
- 관류 챔버는 microcoil에 배치 하 여 인감 관류 시스템 ' s 조직 잘하고 cinching 소형 케이블 타이 사용 하 여 함께 2.
- 트림 와이어 절단기를 사용 하 여 케이블 타이에서 초과 길이.
참고: 성공적인 씰링 시 perfusate 관찰 해야 유출 선을 통해 서 종료 하 고 누설 관류 챔버의 실리콘 물개 주위 분명 해야한다. 프로브 조립 전에 이러한 조건을 확인 하는 실패는 하드웨어 이미징에 심각한 손상 될 수 있습니다. - 실제 폐기물 저수지로 떨어지는 볼 수 있습니다, microcoil 그리고 oxygenator 및 이미징 프로브 본체의 상단에 연결할 어셈블리.
- 는 어셈블리에 대해 그라데이션 스택을 조사 위에 그라데이션 좌석. 사진 상대적 배치 및 코일의 적절 한 연결, oxygenator 및 프로브 하드웨어 구성 요소 ( 그림 4) 제공 됩니다.
5. 미스터 이미지 컬렉션 수행
- 자석으로 조립된 프로브 구멍 삽입
- 장소는 분석기에 가까운 근접에서 프로브 본체 아래쪽 자석의 오프닝 보어.
- 자석의 상단에 열 구멍을 통해 관류 라인의 초과 길이 철회.
- 프로브 본체 진출 자석 구멍의 상단에서 관류 라인에서 더 많은 여유를 동시에 제거 하는 동안 기지에 구멍 모두 사용할 수 있는 여유의 관류 라인에서 채택 되는, 일단.
- 심 스택의 해당 슬롯에 탐사선의 기지에서 2 개의 고정 나사를 스레드.
- 계속 하기 전에 확인을 관류 라인 또는 슬쩍 했다 폐기물 저수지로 실제 유출 확인 하 여 프로브 삽입 눌릴.
참고: 실패 perfusate 유출 관류 라인과 위험 치명적인 손상 미스터 하드웨어 이미징 영구 손상 될 수 있습니다 확인. - 아무 perfusate 폐기물 저수지에 반환 라인 종료 볼 경우 프로브 본체를 제거 하 고 perfusate 흐름 reinsertion을 시도 하기 전에 갔는 확인 합니다. 조립된 관류 및 이미징 시스템 분석기의 도식 레이아웃 되었습니다 설명한 8.
- 프로브 바디 연결
- 그라데이션 냉각기에서 유입 및 유출 수 라인을 연결.
- 그라데이션 냉각기에 대 한 펌프를 켜고 물 온도 설정 (19 ° C)를 확인 하십시오.
- 호스 클램프를 사용 하 여 프로브 본체를 공기 냉각기 장치에서 공기 호스를 연결.
- 흐름 손잡이 공기 냉각기 단위 설정에서 " 1 " 위치.
- 프로브 본체를 열전대 와이어 연결.
- 무선 주파수 (RF) 프로브 본체에 입력/출력은 프리 앰프에서 동축 케이블 연결 ' s 양성자 (H) 채널.
- 프로브 본체를 그라데이션 앰프에서 전원 케이블을 연결.
- 내부에 RF 캐비닛, B0 보상 단위, 모든 3 개의 그라데이션 앰프 (x, y, z)을 마스터 장치 전원을 켭니다
- 준비는 분석기
- 콘솔에서 가변 온도 조정 모듈을 사용 하 여 원하는 구멍 온도 설정.
- (임피던스) 일치 하 고 프로브 내 가변 커패시터를 조정 하 여 (주파수)는 RF 회로 조정. 이 프로브 본체의 기지에서 지팡이 조작 하 여 수행 됩니다.
- 는 분석기에 대 한 현재 설정을 조정 ' 샘플에 자기장 동질성을 최대화 하기 위해 s 심 코일.
- 시작 이미지 컬렉션
- 파일럿 이미지 자석 내 샘플의 공간 위치 보어 결정를 수집. 2에 대 한 일반 매개 변수 차원 그라데이션 에코는 다음과 같습니다 (TR/테 100/4 ms, 평균 = = 1, 펄스 각도 = 30 o, 시간 6 초, 매트릭스 = = 64 x 64, 보기의 필드 = 0.3 x 0.3 c m, 해상도 = 47 x 47 μ m).
- 해당 하는 경우 적절 한 스캔 형상과 조직 위치를 확인 하기 위해 확산 중 조종사를 수집 합니다. 2에 대 한 일반 매개 변수 차원 확산 중 파일럿 검사는 다음과 같습니다 (TR/테 = 2000/11.6 ms, 시간 = 4.3 분, Δ 6 ms, δ = 1 = ms, 평균 = 1, b 1200 (1860 효과적인) = s/m m 2, 매트릭스 = 64 x 64, 보기의 필드 = 0.2 x 0.2 m 해상도 = 31 μ m).
- 급성 슬라이스 준비의 안정성 특성을 결정 하 보급 가중치 시계열을 수집 합니다. 2 차원 확산 중된 이미지에 대 한 일반 매개 변수는 다음과 같습니다 (TR/테 = 2000/11.6 ms, 시간 1.5 h, Δ = 6 ms, δ = 1 = ms, 평균 = 42, b = 1200 s/m m 2, 매트릭스 = 64 x 64, 보기의 필드 = 0.2 x 0.2 m, 해상도 = 31 μ m). 참고: 시스템에 안정성을 특성화 달라질 미스터 대비 고용 (T1, T2, 확산, 민감성)와 같은 요인에 따라 설명된 프로토콜에서 물리 섭 동, 고 단위 시간 당 MR 신호 변화 유래 했다 섭 동.
Representative Results
Perfusate 준비
구멍에 산소 장치의 성공적인 고용 시 가스 공급된 carbogen에 실제 perfusate 내에서 100% 포화 상태에 도달 한다. 이 제공 된 가스의 산소 농도 변화 챔버 내에 관류 산소 미터 (그림 1)8를 사용 하 여 실제 perfusate에서 녹은 산소 함유량에 있는 변화를 측정 하 여 설명 될 수 있다. 헨리의 법, 평형 액체 샘플에 있는 녹은 가스의 양을 그 가스의 부분 압력에 직접 비례 온도 상수12를 유지 합니다. 이 지식과 정밀 가스 표준을 사용 하 여, 설명 된 대로 실제 샘플에 포함 된 용 존된 산소의 양을 계량 가능 하다. 이것은 알려진된 구성의 가스에 노출 되는 실제의 포화 솔루션 (1 시간 이상 부풀어 직접)를 사용 하 여 산소 미터 보정에 의해 달성: carbogen (95% O2) 등 낮은 산소와 다른 높은 산소 농도와 한 가스 질소 (0% O2) 같은 농도. 그 후, 측정 샘플으로 산소 전극의 끝을 물속으로 취할 수 있습니다. 보어 oxygenator 제대로 작동 하 고 있는지 확인은 관류에서 폐수를 잘 측정 하 여 얻을 수 있습니다. 산소 측정기로 측정 된 백분율 녹은 산소 공급 가스에 전달 하는 산소의 백분율 농도 일치 해야 합니다. 측정된 된 값 공급 가스에 그 보다 낮은 경우에,이 조직 조각에 신진 대사 불충분으로 이어질 수 있는 하드웨어 실패 좋을 것.
샘플 모양 및 동작
급성 슬라이스 준비 필요한 대사 산물을 공급 하 고 곧 신진 대사 폐기물을 멀리 운반 하는 충분 한 관류를 수신 하는 상대 안정성의 상태에 도달 합니다. 그 시점에서 급성 조각 외부 섭 동을 받게 될 수 있습니다 하 고 이러한 변화에 대 한 답변은 과학적 연구에 대 한 측정 될 수 있다. 미스터 실험에 대 한 시간이 지남에 따라 관심의 신호를 추적 급성 슬라이스 준비13의 상대적인 안정성을 설명 하기 위해 일반적으로 사용 되 연습 이다. 보급이 중 신호는 변화는 조직 물 이동성, 콘텐츠 및 배포에 특히 민감한 경색 뇌경색14,15감지 하이 콘트라스트 메커니즘의 사용에 의해 평가 될 수 있다. 조직 분리를 달성 후 급성 대뇌 피 질의 조각 다양 한 관류 조건에서 유지 시간이 지남에 정규화 된 확산 신호를 플로팅 상대적으로 안정성 (2 ± 3% 이상 15.5 h) 설명 (그림 5). 관류 조건 (간헐적 또는 지속적인) 또는 MRI 스캔 길이에 확산 신호 안정성 유지 되었다 (짧은 [4 분] 또는 long [1.5 h])8. 조각 관류, 받지 못한 생활 피 질에 날카로운 확산 신호 증가 같은 시간 신호 안정성을 전시 하지 않습니다 경우이 차선 실험 조건의 암시입니다. 섭 동 실험 하지 슬라이스 준비에 안정적인 신호 조건의 확인에 앞서 시도 한다.
신호 안정성 뿐만 아니라 올바른 샘플 위치는 이미지 컬렉션의 시간에 확인 되어야 한다. 비록 샘플 위치 해 현미경에서 조직 배치 하는 동안 제어는, 샘플 위치에 교대 코일 또는 자석에 삽입 하기 전에 프로브의 취급 부주의 또는 관류 장치에의 조립 하는 동안 발생할 수 있습니다. 적절 한 hippocampal 배치의 확인 짧은 수집 하 여 달성 될 수 있다 (2 분), 조종사 확산 대비 (그림 6)를 사용 하 여 검색. 피라미드 셀 레이어 인접 hippocampal 하기 보다 확산 가중치에 더 민감한 때문에,이 구조 확산 중 이미지에서 어두운 밴드로 표시 됩니다. 이 특징을 표시 하지 않는 설정 오프 센터 샘플을 포함 하 고 반복 해야 합니다.
그림 1: % O2 콘텐츠 공급 가스에서의 기능으로 실제 perfusate의 산소 함유량을 녹였다. Carbogen 혼합물 산소 (95%, 60% 및 19%)의 가변 농도 포함 하는 공급 가스로 고용 된다. 백분율 녹은 산소 수치는 관류에서 잘 찍은 다음 이며 두 알려진된 컨트롤에 비해: perfusate 저수지 직접 carbogen (95% O2), 그리고 대기 조건 (23 %O2 노출 perfusate 저수지 부풀어 ). 각 경우에, O2 농도 사용 carbogen 혼합물 내에서 조직 관류 접근 100%의 사이트에 백분율 산소 포화. 오차 막대의 샘플 표준 편차 같습니다. 그림은 원래 제8에서 허가로 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 드로잉에 보어 oxygenator 및 관류 챔버의 도식. 이 다이어그램의 이러한 중요 한 장치 기능에 대 한 책임 설계 요소를 보여 줍니다. 거품 트랩을 통해 펌핑 되어 신선한 perfusate 10mm NMR 튜브의 상단을 통해 oxygenator를 입력 합니다. 이렇게, 그것은 높은 가스 전환 침투성 실리콘 튜브 (블루 세그먼트) 오픈, 5mm NMR 관 주위에 코일을 중첩. Carbogen 가스 5mm 튜브의 상단을 통해 제공 오픈 하단을 통해 챔버를 입력 하 고 10 m m 튜브 뚜껑에 환기 구멍을 통해 oxygenator를 종료 하기 전에 코일된 실리콘 튜브를 통과. 이 노출 중 실리콘 튜브를 통해 흐르는 perfusate 제공 된 가스 혼합물의 화학 구성 요소와 함께 포화 된다. oxygenator를 종료할 때 perfusate 폐기물 수집 저수지로 이어지는 반환 라인에 들어가기 전에 관류 챔버에 직접 전달 합니다. 이 디자인에 중요 한 다른 구성 요소 포함 수정된 RF microcoil, oxygenator의 관류 챔버 사이 액체 단단한 물개를 형성 하는 실리콘 세탁기 (빨간 반지) 위에 수직으로 서 서 oxygenator를 수 있는 아 세 탈 지원 못 하 고 이 가역 물개를 형성 하는 데 사용 하는 케이블 타이의 배치를 수용 하는 microcoil의 조직, 그리고 케이블 타이 노치 이 그림은 수정 하 고 원래 제8에서 허가로 복제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 구멍에 oxygenator를 인터페이스를 허용 하는 microcoil 어셈블리에 대 한 수정. 두 홈 3.0 m m x 1.5 m m (검은 화살표) 관류 챔버를 봉인 하는 데 사용 하는 케이블 타이의 폭을 수용 하는 어셈블리의 측면으로 절단 했다. 채널 (15 m m x 3 m m x 4 m m) 코일의 뒤 얼굴에 숲을 연결합니다. 2 나일론 공간 봉인 절차를 질 때 케이블 넥타이 머리에 대 한 catch로 채널 (빨간색 화살표) 행위의 측면에 배치. 코일 어셈블리 (노란색 arr의 상단에 교 련된 구멍 (2 x 14 mm)아야)는 아 세 탈을 조인 페그는 oxygenator 확보를 지원 합니다. 이 그림은 수정 하 고 원래 제8에서 허가로 복제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 상대적 배치 및 적절 한 어셈블리의 microcoil, oxygenator, 프로브 몽타주 사진. 이러한 이미지에 구멍 oxygenator 및 microperfusion 장치의 주요 하드웨어 구성 요소 있으며 별도 부품 서로와 인터페이스 하는 방법을 설명 합니다. (A) 분해 뷰 사진 잘 조직의 씰링 하거나 프로브 본체의 조립 하기 전에 모든 구성 요소의 상대적 위치를 보여주는. 부품의 상대적 위치를 정확 하 게; 표시를 주의 되었습니다. 그러나, 관류 라인의 섹션에는 두 배로 되었습니다 다시이 시리즈에서 모든 구성 요소가 프레임 내에서 이미지를. (1 프로브 헤드, 2 = microcoil 어셈블리, 3 = 나일론 조직 보존 반지, 4 = 잘, 관류 = 5 = 케이블 타이, 6 구멍에 oxygenator, 7 = 그라데이션 코일, 8 = 거품 트랩 =). (B) 코일과 oxygenator 어셈블리를 다음과 같은 구성 요소입니다. 이 이미지에서 나일론 보존 반지 microcoil의 샘플을 확보 하기 위해 조직 잘 내 배치 하고있다. 아 세 탈 지원 못은 oxygenator의 기지에는 microcoil 위에 해당 구멍에 확보 되었습니다. 관류의 오픈 끝에 실리콘 가스 켓 잘 조직 잘 배치 되었습니다 그리고 케이블 타이 관류 챔버를 봉인 하기 위해 이러한 부품 주변 강화 되었습니다. 마지막으로,는 microcoil의 프로브 헤드의 상단에 연결 되었습니다. (C) 구성 요소 프로브 어셈블리를 다음과 같은. 마지막 패널에 케이블 타이에서 초과 길이 microcoil와 플러시 손질 되어 있다. 그라데이션 코일 스택 다음 신중 하 게 초과 관류 라인, oxygenator, 및 microcoil의 빈 센터에 통과 하는 동안 프로브로 실린더를 전진 하 여 위치에 올랐다는. 그래디언트는 프로브 헤드에 연결 되어, 일단 그들은 프로브에는 기온 변화도의 스레드 기반 위에 고정 고리를 속이 고에 의해 장소에서 개최 거 야. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: superfused 급성 대뇌 피 질의 조각에 확산 신호 안정성. (A) 다른 superfusion 패러다임에 들어서는 4 급성 조각에서 정규화 확산 신호 값 최대 21.5 h 안락사를 다음의 기간에 대 한 시간이 지남에 따라 그려집니다. 조각 남아 15.5 h superfusion 여부에 관계 없이 안락사를 다음의 기간에 대 한 그들의 초기 확산 신호 측정의 ± 5% 이내 이며 지속적 또는 간헐적으로 미스터 스캔 길이 (1.5 h 또는 4 분)의 독립. 신호 녹음 포름알데히드 고정 피 질에서 가져온 긍정적인 통제 역할 (n = 1) 고정된 조직 샘플의 정적, 변하지 않는 특성상 안정성에 대 한. 반대로 확산 신호 측정 superfusion 지원의 결 석 라이브 슬라이스 (n = 1) 대사 결핍에 대 한 제어로 제공. 다른 superfusion의 실험 매개 변수는 다음과 같습니다: 연속 (항상 정시, 스캔 당 superfusion = 1.5 h), 간헐적으로 (검사, 사이 10 분 간격에 superfusion 스캔 당 시간 = 1.5 h), 긴 간격, 긴 검사 (superfusion에 스캔 하지만 스캔, 사이 10 분 동안 일시 중지 된 동안 스캔 당 시간 = 1.5 h), 긴 간격, 짧은 검사 (검사, 사이 1.5 h 간격에 superfusion 스캔 당 시간 = 4 분). (B) Analyzed 데이터 표시 그룹 패널 (A)에서 4 개의 라이브 슬라이스 superfusion 실험의 의미합니다. 확산 신호 프로필에서 그룹화, 반면 (2 ± 3% 이상 15.5 h) 시간이 지남에 약간 변화를 전시 하는 superfused 대뇌 피 질의 조각 끼얹는다 비 제어 (n = 1) 극적인 신호 불안정 초기 실험 6.5 h (15%)에 전시. 이 그림은 수정 하 고 원래 제8에서 허가로 복제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 확인 hippocampal 조각 배치의 파일럿 영상 중. 확장된 미스터 현미경 세션을 실행 하기 전에 정확한 샘플의 위치는 스캐너 시간 등의 리소스를 보장 하기 위해 중요 하 고 비싼 perfusate 첨가제 하지 낭비 된다. 해 마의 CA1 영역의 피라미드 세포 레이어 빠른 (4.3 분)에 구상 될 수 있다, 낮은 해상도 (31 μ x 31 μ m에서-비행기) 파일럿 검사 관심의 조직 마이크로 코일에 관하여 올바르게 배치 됩니다. 두 이미지를 일반적인 스캔 매개 변수는 다음과 같습니다: TR/테 2000/11.6 ms, Δ = 6 ms, δ = 1 = ms, 평균 = 1. (A) b = 0 (효과적인 227) s/m m2. 이 예비 검사에서 지층 pyramidale 단지 회색, 대각선 밴드 코일의 구동 프로필에 중심으로 표시 됩니다. (B) b = 1200 (효과적인 1,860) s/m m2. 높은 보급에 가중치, interlamellar 대비 증가 피라미드 셀 레이어 인접 하기에 조직 보다 더 어두운 된다 (위: 지층 oriens; 아래: 지층 radiatum). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
현재 프로토콜 자기 공명 현미경 검사를 받고 급성 뇌 슬라이스 준비의 표준 대사 유지 관리에 필요한 절차를 설명 합니다. 이 절차는 유일한 방법은 현재 사용할 수 있는 해상도에서 씨와 생활 포유류 직물의 시각화를 셀을 해결 할 수 있도록 합니다. Perfusate 조건 설명 맞게 조정 됩니다 구체적으로 중앙 신경 조직, 프로토콜 널리 어떠한 방식으로 생활의 적응력은 perfusate와 가스 성분의 관류 흐름 율 조정을 통해 조직 준비 그리고 온도입니다.
가장 일반적인 문제를 설명한 절차 중 발생할 수 가능성이 실패 대사 산물 공급에 관련 된 포함 됩니다. 칼슘 염의 강 수는 실제 내부 시스템 버퍼링 중 탄산염에서 실패의 결과로 가스 부족 하는 동안 발생할 수 있습니다. 이러한 침전 관류 라인을 방해할 하 고 심각한 하드웨어 손상 될 수 있습니다. 소금 침전 물 조사 어셈블리를 다음과 같은 perfusate에서 관찰 된다, 중단 관류 흐름 즉시 연동 펌프를 해제 하 여. 공급 가스 및 저수지와 oxygenator carbogen 가스 흐름 (1/16 L/min)에서 perfusate, CO2 수준 (5.0%)에 충분 한 나트륨 중 탄산염 수준 (4.37 g/2 L)의 존재를 확인 합니다. 마지막으로, 확인 전화 수준의 생리 범위 (7.3-7.4)에 안정 됩니다. 산소 가스와 pH 레벨은 여전히 통제 되지 적절 하 게, 가스 교환 막 대체 되어야 한다.
조각 의도 실험 시간-과정을 통해 신호 안정성을 전시 하지 않습니다, 경우 올바른 화학 성분 실제 혼합물에 존재 하 고 올바른 osmolality (300 mOsm) 및 (7.3-7.4) pH 유지 됩니다 확인 합니다. Carbogen 가스 perfusate 저수지와 oxygenator 1/16 L/분에 공급 되는 확인 하십시오. 이 단계는 perfusate 조건 해결 되지 않습니다, 가스 교환 막의 교체 조언 된다. 조직 안정성은 하지 perfusate 조건 문제 해결 후 경우, 조직 수확 및 관류 응용 프로그램 사이의 시간 간격을 최소화에 중점을 두고 수술 프로토콜의 세련미를 고려 하십시오.
Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국가 학회 (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01)에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (S10RR031637), 그리고 국립 과학 재단 (협력 계약 번호 DMR-1157490) UF와 플로리다의 상태에 국가 높은 자기장 실험실 (NHMFL) 고급 자기 공명 분광학 (AMRIS) 시설을 통해.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate Preparation | |||
| Osmette A | Precision Systems Inc. | 5002 | freezing point depression osmometer |
| Stir Plate Type 1000 | Barnstead/Thermodyne | SPA1025B | magnetic stir plate with heating element |
| Accumet Basic pH Meter | Fisher Scientific | AB15 | pH Meter |
| pH Probe | Fisher Scientific | 13-620-AP61 | probe for pH measurement |
| Oxygen Meter | Microelectrodes Inc. | OM-4 | meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates |
| Oxygen Electrode | Microelectrodes Inc. | MI-730 | microprobe for the oxygen meter |
| Scale | Denver Instrument Co. | A-160 | microscale for weighing chemical components |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Preparation | |||
| Lancer Vibratome | Ted Pella Inc. | Series 1000 | vibratory tissue slicer |
| Disecting Microscope | Carl Zeiss Inc. | OPMI 1-FC | tabletop, binocular disecting microscope |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion System | |||
| Masterflex L/S | Cole-Parmer | 7523-50 | peristaltic micro perfusion pump |
| Oxygen Regulators x 2 | Victor Medical | VMG-05LY | device for regulating gas flow |
| e-sized carbogen cylinders x 2 | Airgas | gas tanks containing carbogen gas | |
| in-bore oxygenator | developed in house | device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MR Imaging Hardware | |||
| Micro Surface Coil (200mm dia., modified) | Bruker Biospin | B6371/0001 | four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil |
| Micro 5 probe body | Bruker Biospin | Z3395 | microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer |
| Micro 5 gradient coils | Bruker Biospin | M81111 | gradient coil stack used with micro 5 probe body |
| 600 MHz Spectrometer | Oxford Instruments | superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation | |
| Imaging Console | Bruker Biospin | Avance III | support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, & workstation used for MR image generation |
| Air Blower | Bruker Biospin | BCU-II, -80/60 | Air chiller unit used in conjunction with the probe's heating coil to regulate temperature inside the magnet bore |
| Gradient Chiller | Thermo Scientific | Neslab Merlin M33 | Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils |
References
- Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell. Nature. 322, 190-191 (1986).
- Schoeniger, J. S., Aiken, N., Hsu, E., Blackband, S. J. Relaxation-time and diffusion NMR microscopy of single neurons. J. Magn. Reson. B. 103, 261-273 (1994).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of mammalian neurons. Neuroimage. 46, 1037-1040 (2009).
- Flint, J. J., et al. Magnetic resonance microscopy of human and porcine neurons and cellular processes. Neuroimage. 60, 1404-1411 (2012).
- Kamman, R. L., Go, K. G., Stomp, G. P., Hulstaert, C. E., Berendsen, H. J. C. Changes of Relaxation times T1 and T2 in rat tissues after biopsy and fixation. Magn. Reson. Imag. 3, 245-250 (1985).
- Shepherd, T. M., Thelwall, P. E., Stanisz, G. J., Blackband, S. J. Aldehyde fixative solutions alter the water relaxation and diffusion properties of nervous tissue. Magn. Reson. Med. 62, 26-34 (2009).
- Massin, C., Boero, G., Vincent, F., Abenhaim, J., Besse, P. -A., Popovic, R. S. High-Q factor RF planar microcoils for micro-scale NMR spectroscopy. Sensor. Actuat. A-Phys. 97, 280-288 (2002).
- Flint, J., Menon, K., Hansen, B., Forder, J., Blackband, S. J. A microperfusion and in-bore oxygenator system designed for magnetic resonance microscopy studies on living tissue explants. Sci. Rep. 5, 18095 (2015).
- Khong, Y. M., et al. Novel intra-tissue perfusion system for culturing thick liver tissue. Tissue Eng. 13 (9), 2345-2356 (2007).
- Schumacher, K., Khong, Y. -M., Chang, S., Ni, J., Sun, W., Yu, H. Perfusion culture improves the maintenance of cultured liver tissue slices. Tissue Eng. 13 (1), 197-205 (2007).
- Shepherd, T. M., Blackband, S. J., Wirth, E. D. Simultaneous diffusion MRI measurements from multiple perfused rat hippocampal slices. Magn. Reson. Med. 48, 565-569 (2002).
- Henry, W. Experiments on the quantity of gases absorbed by water, at different temperatures, and under different pressures. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 93, (1803).
- Bui, J. D., Buckley, D. L., Phillips, M. I., Blackband, S. J. Studies of perfused brain slices with MR microscopy. Spatially Resolved Magnetic Resonance. Blümler, P., Blümich, B., Botto, R., Fukushima, E. , Wiley-VCH. 337-343 (1998).
- Moseley, M. E., et al. Early detection of regional cerebral ischemia in cats: Comparison of diffusion- and T2-weighted MRI and spectroscopy. Magn. Reson. Med. 14 (2), 330-346 (1990).
- Moseley, M. E., et al. Diffusion-weighted MR imaging of acute stroke: Correlation with T2-weighted and magnetic susceptibility-enhanced MR imaging in cats. Am. J. Neuroradiol. 11, 423-429 (1990).
