Summary
グルコース欠乏が引き起こす SH SY5Y 傷害における低用量大気圧プラズマ処理の神経保護アプリケーションのためのプロトコル。
Abstract
大気圧プラズマ ジェット (平衡) は、その排出活性窒素種 (RNS) と活性酸素種 (ROS) の複数の種類が含まれるために、近年複数の分野から多くの研究者の注目を集めています。私たちの以前の研究では、酸化ストレス傷害に対して平衡の細胞保護効果を示しています。本研究の目的は、SH SY5Y 細胞におけるグルコース剥奪による障害にヘリウム APPJs の神経保護アプリケーションに関する詳細な体外治療プロトコルを提供することです。SH SY5Y ひと神経芽細胞腫由来細胞ラインは 15% 牛胎児血清添加 RPMI 1640 中維持されました。培養液は、平衡治療前にグルコース不含 RPMI 1640 に変更されました。セルのインキュベーターで 1 時間培養後、細胞は細胞カウント キット 8 を使用して決定されました。結果、グルコース欠乏グループと比較して、平衡細胞展示大幅に増加した細胞生存率用量依存的に 8 s/ウェルが至適投与量として観察されます。一方、ヘリウム流にはグルコース欠乏による細胞障害の影響がなかった。平衡がグルコース欠乏に関連する中枢神経系の疾患の治療法として潜在的に使用できるが示唆されました。このプロトコルは、異なる障害を持つ他のセルに胃酸アプリケーションとしても使用が、細胞培養と平衡治療条件を再調整する必要があります、治療線量が比較的低くする必要があります。
Introduction
成人の脳は、ほとんど専ら通常の生理条件下でのエネルギー代謝の基板としてブドウ糖を使用します。人間の脳は体重の 2% だけを構成するが、ボディ1内全体のブドウ糖の約 25% を消費します。それも記載のグルコース代謝異常を引き起こすことが虚血性脳卒中やアルツハイマー病 (AD)、ハンチントン病 (HD)、パーキンソン病 (PD)など、様々 な神経変性疾患の中には主要な病理学的変化の一つ2,3。糖と糖取り込みや酸化的リン酸化の欠如が ATP の生産に直接影響してさらにその維持セル実行可能性を示唆している神経の機能障害のリスクを高める可能性があります、神経細胞死を誘導するか、グルコース欠乏はこれらの病気を治療するための合理的なアプローチかもしれない後細胞損傷を遅らせます。グルコース調節、抗炎症剤、イオン チャネルの変調器、フリーラジカル捕捉剤、神経栄養因子に焦点を当ててを介して神経保護効果の検討など注目されています。ただし、臨床実習にベンチからこれらの神経のアプローチの翻訳は成功4をされていません。
大気圧プラズマ ジェット (APPJs) は、近年複数の分野から多くの研究者の注目を集めている大気中低温ガス放電技術の新しい種類です。APPJs は、医療などのさまざまな癌細胞治療、細菌の不活化、血液凝固、創傷治癒、内服薬、等5,6、複数種類の排出のために何十年も使用されています。活性窒素種 (RNS) と活性酸素種 (ROS) (図 1) の7。以前のプラズマ生物医学アプリケーションは主に細菌、細胞・組織8酸化およびニトロ化ストレスに焦点を当てた。ただし、RNS と ROS は多くの生理学的および病態生理学的プロセス9に関連する重要な細胞内シグナル伝達分子であるので、平衡には「両刃の剣」可能性があります。亜酸化窒素 (NO) は、生物学的プロセスの広い範囲を制御し、中枢神経系 (CNS) を中心に、人間の体内で二重の役割を果たしています。なしの低レベルを示している神経活動両方生体外および生体内で複数の信号経路10を介して。私たちの以前の研究が最初に報告されたヘリウム平衡誘起酸化ストレス傷害11に対して平衡の神経保護効果の生産は関与していません。ただし、他の傷害の APPJs の効果は報告されていません。したがって、本研究の目的は、SH SY5Y 細胞におけるグルコース剥奪による障害で、体外治療プロトコルのヘリウム平衡神経保護アプリケーションに関するを提供することです。以前の研究とは異なり、我々 のプロトコル平衡治療が小説「ないのドナーの薬剤として潜在的に使用できるを示す過剰なプラズマ照射誘起傷害の結果なし神経保護アプリケーションの低用量プラズマ処理を使用「今後の研究と臨床の翻訳のためにも。このプロトコルも異なる障害を持つ他の細胞型の細胞保護アプリケーションとして使用することが示唆されたが、平衡治療条件を再調整する必要があり、治療線量が比較的低くする必要があります。
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Protocol
1。 平衡デバイスの準備
警告: 使用前に関連するすべての材料安全データ用紙 (MSDS) を参照してください。ヒューム フードと保護具 (保護メガネ、保護手袋、白衣、等) の使用を含む、すべての実験を行う際は、適切な安全対策を使用してください。プロトコル標準セル処理テクニック (殺菌、細胞回復、細胞継、細胞凍結、細胞染色、等) が必要です
。- 内部の直径 1 mm の石英管を選択し、外径 3 mm. の両端研磨ホイルを使用して断面を滑らかにします 。
- は、1.0 mm の直径を高電圧電極としてニッケル メッキ ステンレス鋼針を使用します。0.05 mm の曲率半径にその先端を挽く 。
- 石英チューブから 1 cm で石英管の周りラップ アルミ箔 (幅 2 mm) ノズル。アルミ箔のもう一方の端から 1 cm のステンレス製のニードル ポイントを修正します。低電圧電極としてアルミ箔のリングを使用します 。
2。ジェットの買収
- AC 信号を提供し、電源として機能する関数の信号発生器に高電圧の電力増幅器を接続します。高電圧電極に印加電圧の波形を記録するには、デジタル ・ オシロ スコープに高電圧プローブの一方の端を接続し、もう一方の端を電源装置に接続します。回路を保護するために使用 2 k Ω 保護抵抗として抵抗します。 図 2 に示すように、回路を接続します
。 注意: は、高圧線を触れないで 。
- は継続的にヘリウム (体積、99.999%) の石英管を通過し、安定した 1.4 標準リットル分 (SLM) あたりでガス流量を制御します
。 注: 我々 は培養細胞を治療する前にフィルターを使用しないでください。実験で使用されるヘリウムの体積率は 99.999% と、ほとんどの微生物はこれらの条件の下で生きられない 。
- は、オシロ スコープ、信号発生器、および高電圧電力増幅器の電源を入れます。5 kHz に周波数調整ノブを回します。徐々 に電圧がピーク-ピーク値の 6 kV
。 注: ジェットは十分な長さ (約 3 cm) 針に印加する電圧のピーク-ピーク値が約 6 kV 。
3。SH SY5Y 細胞の調製
15% 牛胎児血清 (FBS)- 成長 SH SY5Y ひと神経芽細胞腫由来細胞ライン RPMI 1640 年に 25 cm 2 フラスコで培。37 で 5% CO 2 と 95% 空気の入った加湿のインキュベーターで細胞を維持 ° C
- セル 85% 合流点に到達、慎重に培地を吸引し、セルに 1 ミリリットル 0.25% トリプシン + EDTA 0.1% を追加します 。
- 室温で後 15 のインキュベーション慎重にトリプシンを吸引し、2 mL 15% を含む RPMI 1640 を追加を中和する FBS 。
- SH SY5Y 単分子膜が完全に切り離されてまで、井戸の底を洗うピペットを上下に優しくします 。
- 、検定によるセルをカウントし、RPMI 1640 中 +15 を追加して 2 x 10 5 セル/mL に細胞濃度を調整 %fbs、し、96 ウェル プレートの各ウェルに細胞懸濁液の転送 100 μ L.
- 平衡治療前にセルのインキュベーターで 12 h を付けるセルを許可します 。
4。SH SY5Y の平衡治療
- 調整石英ノズル間隔管と 96 ウェル プレートの配置場所 3 cm. プラットフォームによりビームが培地の表面を触れることができる
。 注: 距離は、プレートの下からは測定できません。石英管のノズルと 96 ウェル プレートを配置するために使用するプラットフォームの間 3 cm にまず調整されます 。
- 平衡治療前に媒体を変更文化制御井戸を除く各ウェルに RPMI 1640 グルコース培地なし 。
- 平衡ノズル下プレートを置き、ジェットが各ウェルに垂直方向に撃つことができることを確認します 。
- 0 の平衡の別の井戸で扱う細胞 s、1 s、2 s、4 s、8 s と 12 s.
注: によってヘリウム ( 図 1) を電離平衡が生成されます。グルコース欠乏によって負傷したセルは 4 によって扱われる s と 8 s ヘリウム ヘリウムの細胞に及ぼす影響を排除するために。3 通すべての治療法を実行する必要があります 。
5。セル実行可能性の試金
注: この手順では媒体を変更しないでください
。- 平衡治療後 1 h セル インキュベーターで細胞をインキュベートします 。
- 各ウェルにセルが (CCK-8) をキット-8 カウントのソリューションの追加 10 μ L.
- インキュベート 4 h の 37 ° C でセル
注: SH SY5Y 細胞株は、グルコース欠乏条件 12 に敏感です。セル実行可能性薬効学研究の最適なセル生存条件である 1 h 無グルコース後ほぼ 50% に減少します。CCK 8 細胞に細胞毒性を持たないし、セルはセル実行可能性を確認する平衡治療後別グルコース欠乏条件 4 h の CCK 8 試薬と孵化させます。8 h 無グルコース平衡治療後無グルコースの長い期間は、SH SY5Y 細胞の深刻な被害をもたらしたので、平衡の保護効果は有意。24 h グルコース欠乏 11 の後生きている細胞の証拠はない 。
- 450 で吸光度を測定マイクロ プレート リーダー nm 。
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Representative Results
データは、少なくとも 3 つの独立実験の平均 ± SD として表されます。グループ結果を分散分析を使用している差異を分析しました。すべての解析は統計解析ソフトウェア プリズムと p を使用して行われた < 0.05 だった統計的有意性のしきい値。
CCK 8 4 時間後細胞生存率を測定しました。無グルコース減少 44.1 ± 2.6% 対照群のそれに比べて SH SY5Y 細胞の図 3のように、(通常 15% を含む RPMI 1640 培地で培養した細胞 FBS)。平衡治療が 8 s/まあの最適な用量で、用量依存的に細胞生存率を大幅に増加、細胞生存率に 62.27 ± 3.1% に達した。ガスの流れはグルコース欠乏によって誘導される細胞障害 (表 1) に影響を与えなかった。
図 1: 平衡排出量の典型的な RNS と ROS 反応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 実験装置の概略図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 保護 SH SY5Y 細胞のグルコース欠乏による障害に及ぼす平衡します。細胞が平衡と扱われ、後、細胞生存率を求めた CCK 8 アッセイを用いた 1 h のグルコース剥奪を受けます。誤差範囲を表す平均 ± SD. * * * P < コントロールと 0.001#P < 0.05 と ##P < グルコース欠乏グループ対 0.01 (n = 3)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| グループ | 細胞生存率 (コントロール %) | |||
| コントロール | 100 ± 3.7% | |||
| 無グルコース | 44.1 ± 2.6% * * * | |||
| 平衡トリートメント + 無グルコース | 1 s | 49.3 ± 2.8% | ||
| 2 s | 53.0 ± 2.7% | |||
| 4 s | 60.4 ± 2.3%# | |||
| 8 s | 62.3 ± 3.1%# | |||
| 12 s | 51.3 ± 2.7% | |||
| 彼の流れ + 無グルコース | 4 s | 45.4 ± 2.4% | ||
| 8 s | 44.1 ± 3.1% | |||
表 1: SH SY5Y のパーセントの生存率データ細胞無グルコース平衡治療の有無。P < コントロールと 0.001#P < 0.05 と ##P < グルコース欠乏グループ対 0.01 (n = 3)。
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Discussion
SH SY5Y 細胞はひと神経芽細胞腫由来細胞株で、広く神経毒性や神経保護12に関する生体外で研究の適切な細胞モデルとして使用されます。SH SY5Y 細胞株は、グルコース欠乏条件に敏感だった。細胞生存率は薬の研究の最適な細胞生存条件である 1 h グルコース剥奪後の約 50% に減少しました。また、CCK 8 試薬は、細胞に細胞毒性を持たないし、細胞生存率をチェックする平衡治療後別グルコース欠乏条件 4 h の CCK 8 試薬を添加して細胞。現在の研究では、SH SY5Y 細胞のグルコース欠乏による障害平衡の神経保護アプリケーションに関する詳細な体外治療プロトコルを提供します。
変更とトラブルシューティング
CCK 8 インキュベーション時間が短い場合は各色も大幅に変更可能性があります。SH SY5Y 細胞密度がよくあたり 1 x 10 の4セル以下の場合セル無グルコースと平衡治療後に死んでいます。また、プラズマのビームが培地の表面に触れることができることを確保しながらガス流量を削減することをお勧めします。平衡は、他関連神経 (HT 22、2 a、または行も一次ニューロン) (低酸素、酸化ストレス等)、異なる障害を持つため胃酸エージェントとしても使用できるが、細胞培養と平衡治療条件する必要があります。再調整、治療線量は比較的低する必要があります。我々 はこの平衡生成パラメーターの距離を削減しようし、プラズマ ジェットも直接細胞傷害 (SH SY5Y 細胞だったから容易に切り離すの付着状態) になる可能性がある SH SY5Y 細胞の添付ファイルに影響を与える可能性がわかった。セル特性とプラズマ ジェット治療への耐性に基づいて治療距離必要があります考えています。
技術の限界
現在のプロトコルは、のみ、生体外で神経平衡細胞に及ぼすグルコース剥奪負傷 SH SY5Y に焦点を当てた。前の研究はプラズマの吸入を示したラット心筋梗塞モデル13心機能を向上させることができます。多くの仕事はまだ、脳保護のため生体内で治療方法の検討必要です。
既存のメソッドの意義
プラズマ医学に関する先行研究は、平衡治療14による酸化・ ニトロ化ストレスのため細菌、癌細胞、組織の不活性化能力にもっと注意を払った。私達のプロトコルは平衡治療小説「ないドナー薬」として今後の研究の可能性がありますされる可能性がありますもことを示す過剰なプラズマ照射誘起の傷害の結果なし神経保護アプリケーションの低用量プラズマ処理を使用臨床の翻訳。
プロトコルの中で重要なステップ
このプロトコルでは最も重要なステップは平衡と治療上の平衡治療線量が比較的低い、以来かどうかを確認し、細胞傷害を悪化させる、直接細胞死を誘導します。グルコース剥奪期間を制御するもう一つの重要なステップは、セルが死ぬや平衡の細胞保護効果が大幅に削減されます。純粋なヘリウム、ヘリウム混合 O2または空気の少量ではなくが使用されました。ヘリウムの O2または空気の少量の混合を使用すると、プラズマで活性酸素の量が増えます。複雑なプラズマ化学反応が発生したときに診断をすることは非常に難しい。
将来のアプリケーション
SH SY5Y セル平衡が中枢神経系におけるグルコース欠乏関連疾患の治療法として潜在的に使用できるを示す無グルコースの誘導後平衡治療が適用されたことに注意する価値があるも特に虚血性脳卒中。したがって、将来の研究両方単独でそしてブドウ糖剥奪後の異なる期間で他の神経保護薬との併用で、平衡の神経保護効果の治療条件を評価するために必要なです。
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Disclosures
本稿に関連して利益相反が宣言されていません。
Acknowledgments
この作品は、北京脳神経外科研究所 (2014-11)、(11475019, 81271286 番) 中国国家自然科学基金、北京自然科学基金 (ナンバー 7152027) の技術革新基金によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SH-SY5Y cell line | China Center for Type Culture Collection | 3111C0001CCC000026 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Scientific | 21875091 | stored at 4 °C |
| RPMI 1640 medium no glucose | Thermo Scientific | 11879020 | stored at 4 °C |
| fetal calf serum | Thermo Scientific | 16000044 | stored at -20 °C |
| tripsin-EDTA solution | Solarbio | T1300 | stored at 4 °C |
| 96 wells plate | corning | 3599 | |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | Dojindo Laboratories | CK04 | stored at 4 °C |
| microplate reader | Tecan | M200 Pro | for measuring the absorbance at 450 nm |
| High – voltage Power Amplifier | Trek | PD06087 | for amplifing the power |
| Function Signal Generator | MaZe Electronics Science&Technology | AT30120 | for providing the specific signal |
| High – Voltage Probe | Tektronix | P6015A | for detecting high voltage |
| Digital Oscilloscope | Tektronix | DPO4104B | for displaying the signal |
References
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