Summary
Denne protokol beskriver en metode til at injicere plasmid DNA i musenyre via nyrebækken at producere transgen udtryk specielt i nyrerne.
Abstract
Hydrodynamisk injektion skaber en lokal, højtryks miljø for at transfect forskellige væv med plasmid DNA og andre stoffer. Hydrodynamisk hale vene injektion, for eksempel, er en veletableret metode hvormed leveren kan være transfekteret. Dette manuskript beskriver en ansøgning af hydrodynamiske principper ved indsprøjtning af en musenyre direkte med plasmid DNA for nyre-specifikke genekspression. Mus er bedøvede og nyrerne er udsat ved en flanke indsnit efterfulgt af en hurtig injektion af et plasmid DNA-holdige løsning direkte ind i nyrebækkenet. Nålen er holdt på plads i ti sekunder og webstedet incisionen sutureres. Den følgende dag, live animalske imaging, vestlige skamplet eller Immunhistokemi kan anvendes til assay genekspression, eller andre assays egnet til transgen valg der anvendes til påvisning af protein af interesse. Offentliggjort metoder til at forlænge genekspression omfatter transposon-medieret transgen integration og cyclophosphamid behandling for at hæmme immunresponset til transgenet.
Introduction
Hydrodynamisk hale vene injektionsteknik er blevet et almindeligt anvendte måde til at opnå høje niveau af genekspression i mus lever1,2. Nyrerne er også transfekteret af denne teknik på et meget lavere niveau, ca 100-fold mindre3. Den hydrodynamiske nyrebækken injektion beskrevet her giver en enkel måde at kontrollere specificiteten af orgel udtryk gennem fysiske processer ved hjælp af de samme hydrodynamiske principper, der er fastlagt tidligere i leveren4,5 , muskel6, og andre organer7,8. Denne metode transfects celler i levende dyr i vivo ved hjælp af tryk og hastighed at tvinge væske indeholdende DNA i cellerne, samtidig fremkalde skader på det organ, der er hurtigt løst9. Ved hjælp af veletablerede kirurgiske teknikker til at visualisere nyre via en flanke indsnit10 sammen med en enkelt injektion af insulin sprøjte, har vi fundet vellykket Transfektion af forskellige typer af nyreceller, hovedsagelig interstitiel fibroblaster, tubuli, og indsamle kanal11. Dissektion af disse mus har vist, at andre organer ikke er transfekteret på et niveau højt nok til at visualisere ved luciferase imaging teknikker11. Da teknikken er ikke-virale, tillader anvendelse af plasmid DNA til Transfektion hurtig og nem forberedelse af reagenser kræves til injektion.
Vi har brugt lokaliserede hydrodynamiske injektioner for at udtrykke antioxidant glutathion S-transferase A4, insulin-lignende vækstfaktor-1 receptoren og hormon erythropoietin i nyrerne, alle med forventede biologiske virkninger11, 12 , 13. grundig evaluering af indgiftsmåde, injektionsvolumen, DNA dosering, og promotor valg har været udført11. Derudover begge piggyBac transposon system og/eller cyclophosphamid behandling til at undertrykke immun reaktion transgenet har vist sig at forbedre langsigtede gen expression resultater11. Andre efterforskere har brugt en nyre-vene tilgang i rotte med succes, at opnå høj Transfektion effektivitet for perioder på mere end en måned14. Dog genetiske korrektion af fænotyper efterligne menneskers sygdom er normalt udføres i mus først som en proof-of-concept da mest pattedyr genetiske modeller er musemodeller. Vi sammenlignede nyre-vene injektion til nyrebækken injektion og fandt, at injektion i nyrebækkenet var overlegen i forhold til nyre-vene for genekspression (cirka ti gange højere) og overlevelse11. Nyrebækkenet er en ideel ruten træder i nyrerne, fordi det er fleksibelt nok til at tolerere udsving i urinproduktion og er ofte i stand til at opretholde sin strukturelle integritet selv når forstørrede under hydronefrose. Derudover injektion i nyrebækkenet tilladt adgang til nyrerne uden piercing nyre kapsel, at lade den injicerede væske skal beholdes synligt af nyre bedre end intraparenchymal injektion. Andre mus organer har ikke en rute af post end Vaskulaturen, men den urinveje plads i nyrerne er en ideel injektionsstedet. Derudover resulterede injektion i nyre-vene i udsivning af blod ind i bughulen. Den samlede nyre volumen i wild-type mus nyrerne er blevet anslået ved magnetisk resonans at være cirka 0,2 cm3, så mængden af en enkelt nyre er omtrent lig med mængden af væske sprøjtes af nyrebækken hydrodynamiske injektion (100 µL)15. Heri, har vi stillet til rådighed alle detaljerede nuancerne i den hydrodynamiske nyrebækken injektion protokol til opnå reproducerbare Transfektion af nyrerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUCs) af Baylor College of Medicine og Vanderbilt University Medical Center.
1. Forbered DNA løsning til injektion
- Vælg plasmid(s) at udtrykke transgeners omhyggeligt for at maksimere de ønskede egenskaber for at forbedre Transfektion effektivitet og transgen udtryk.
Bemærk: Hydrodynamisk nyrebækken injektion af plasmider at udtrykke den fluorescerende markør TdTomato, hormon erythropoietin (Epo) og firefly luciferase har været tidligere beskrevet11. Hvis der ikke er en veludviklet assay for Transfektion effektivitet for transgenet, udføre levende dyrs billeddannelse af luciferase ved at indføre 10 µg luciferase-udtrykker plasmid såsom forbedret firefly luciferase i fortyndet DNA til injektion.- Vælg det mindste plasmidet, som er praktisk til programmet.
Bemærk: Små plasmider generelt transfect celler bedre end store plasmider. Zeomycin resistens gen og R6K oprindelse af replikering er små, så udnytter disse elementer i plasmid rygraden vil formindske plasmid størrelse. - Express transgen fra et pattedyr promotor.
Bemærk: Nyre celletype transfekteret, længden af genekspression, og styrken af genekspression vil alle blive berørt af promotor valg. Se Woodard mfl. for en sammenligning af cytomegalovirus (CMV; konstitutiv viral), strækforlængelse faktor-1 alpha (EF-1α; konstitutiv endogene), gamma glutamyl transferase (γGT; tubulus-specifikke) og podocin (NPHS2; podocyte-specifik)11. - Ansætte en ikke-virale integrere system såsom transposoner, hvis højere langsigtet gen expression niveauer er ønskeligt11,16. For undersøgelser med tidlig udlæsninger mindre end 5 dage efter injektion er integration af transgenet unødvendige.
- Vælg det mindste plasmidet, som er praktisk til programmet.
- Forberede injektion ved hjælp af en kommerciel metode som en endotoxin-fri maxiprep kit plasmid DNA. Omhyggeligt undgå at indføre endotoksiner via labware.
Bemærk: Tilstedeværelse af endotoksiner i DNA løsning vil fremkalde en svær immunrespons i dyr emne at kompromittere eksperimentet og muligvis dræbe dyret.- Efter sidst DNA isoleret wash skridt er færdig, Sørg for, at ingen ethanol er tilbage ved visuel inspektion og lugt. Bruge gel-loading tips til at fjerne synlige dråber. Tør de rør, der indeholder DNA pellet hovedet på laboratoriet delikat opgave visker væv ved stuetemperatur eller i en 37-60 ° C ovn med konstant overvågning. Resuspenderes umiddelbart efter resterende ethanol er fordampet for at forhindre overtørring af toerstoffet.
Bemærk: Resterende ethanol griber ind i spektrofotometrets læsning af DNA-koncentrationen og introduktion til nyren er ikke ønskeligt. - Resuspenderes DNA i den samme buffer som vil blive brugt til injektion (hydrodynamiske levering buffer; 100-300 µL) at begrænse variationen i den kemiske sammensætning af DNA stødpudeopløsning mellem grupper.
Bemærk: Ikke resuspenderes DNA i opløsningen eluering buffer, der følger med sættet. Chelatdanner EDTA almindeligt forekommende i "TE" buffer præparater kan påvirke nyrerne og hjerte-kar-funktion. Afhængigt af pellet størrelse, elueres i 100-300 µL af hydrodynamiske levering buffer til at opnå en høj koncentration. Den endelige koncentration af fuldt udvandet DNA vil være mellem 100 ng/µL (10 µg/mus dosis) og 500 ng/µL (50 µg/mus dosis) så bestanden DNA koncentrationen skal overstige dette. - Fuldt resuspenderes DNA i buffer. Forlade pelleten i hydrodynamiske levering buffer i det oprindelige rør ved stuetemperatur i mindst en time eller natten over ved 4 ° C forud for overførsel til et sterilt mikrofuge rør til at sikre, at DNA er helt opløst.
- Læs plasmid DNA koncentration på et spektrofotometer eller af en anden etableret metode.
Bemærk: Behandlinger bør udfærdiget i to eksemplarer med yderligere replikater, hvis nødvendigt. Hvis 260/280-forholdet er under 1,8, præparatet er forurenet med RNA eller et andet stof så kassér det og forberede DNA igen. - Butik plasmid DNA genopslemmes i injektion buffer ved-20 ° C inde i en boks i en manuel afrimning fryser at undgå nedbrydning af DNA.
Bemærk: Gemt på denne måde, vil DNA forberedelse vare i mange år. Tjekke integriteten af DNA af begrænsning digest og Agarosen gelelektroforese. DNA, der er smurt ned af banen har nedbrudt og kan ikke bruges, mens DNA, der producerer sprød bands af den korrekte størrelse kan bruges til injektion.
- Efter sidst DNA isoleret wash skridt er færdig, Sørg for, at ingen ethanol er tilbage ved visuel inspektion og lugt. Bruge gel-loading tips til at fjerne synlige dråber. Tør de rør, der indeholder DNA pellet hovedet på laboratoriet delikat opgave visker væv ved stuetemperatur eller i en 37-60 ° C ovn med konstant overvågning. Resuspenderes umiddelbart efter resterende ethanol er fordampet for at forhindre overtørring af toerstoffet.
- Forberede den fortyndede plasmid DNA løsning til injektion i nyrebækkenet.
Bemærk: Overveje kontrol grupper omhyggeligt. For mange studier er naive og buffer injiceres-kun kontrol inkluderet fordi indsprøjtningen, selv forårsager skader og kan påvirke de eksperimentelle resultat11.- Afrimning endotoxin-gratis DNA elueret i hydrodynamiske levering buffer ved stuetemperatur på bænken.
- Beregningen af DNA behov for injektioner og forberede den fortyndede DNA for hver gruppe. Administrere 10-50 µg af plasmid DNA bragt til et samlet volumen på 100 µL med Hydrodynamisk levering buffer pr. mus.
Bemærk: For eksempel beregningerne at injicere 3 mus med 10 µg/mus af et DNA plasmid, der har en koncentration på 0,5 µg/µL er som følger.- Forberede nok DNA løsning at have ca. 20% ekstra for lastning sprøjter og døde plads i nålen. For 3 mus, udarbejde en blanding på 3,5 x. Beregn massen af DNA i µg, som bør være i opløsningen. Her ville det være 10 µg x 3.5 = 35 µg.
- Beregning af det samlede volumen af løsning ønskede for indsprøjtning 100 µL pr. mus. I dette tilfælde ville det 100 µL x 3.5 = 350 µL samlede volumen.
- Beregne omfanget af stock plasmid DNA tilføjes til løsningen. I dette tilfælde ville det 35 µg / 0,5 µg/µL = 70 µL af stock plasmid DNA.
- Beregne omfanget af buffer til at tilføje til den fortyndede DNA løsning ved at fratrække mængden af stock DNA tilføjet (trin 1.3.2.3) fra det samlede volumen af fortyndet DNA, der er ønsket (trin 1.3.2.2). I dette tilfælde ville det 350 µL - 70 µL = 280 µL hydrodynamiske levering buffer.
- Forberede løsninger i sterile mikrofuge rør ved hjælp af kommercielt tilgængelige filter pipette tips med steril teknik på lab bænk.
Bemærk: DNA løsninger kan tilberedes og opbevares ved stuetemperatur for injektioner indstillet til at forekomme dag. Injicér ikke mus med en kold løsning, som dette vil sænke deres kropstemperatur, men opvarmning er unødvendige.
2. udføre hydrodynamiske nyrebækken injektion kirurgi
- Vælg mus omhyggeligt for kirurgi.
Bemærk: Stamme-specifikke forskelle endnu ikke er blevet overholdt, men kan være muligt. De fleste indsprøjtninger har været på C57BL/6 eller FVB baggrunde. Nyrebækken injektioner virke bedst i mus, der er 6-12 uger gamle. I mus større end 16 uger, op til en 50% fejlrate af luciferase er tænkelig muligt af uklare årsager. Den samme aldersrelaterede fejlrate er blevet observeret for Hydrodynamisk hale vene injektioner til leveren, så det kan være en generel begrænsning vedrører princippet om hydrodynamiske injektion. I samme retning, andre har vist at hydrodynamiske hale vene indsprøjtning fibrotisk rotte lever ikke er så effektiv som sund leveren, så det kan være muligt, at i indstillingerne af renal fibrose nyrebækken hydrodynamiske injektion ikke vil være så effektive, men Det har ikke været testet direkte17. - Forberede mus og DNA sprøjter til kirurgi.
- Bedøver mus med ketamin og xylazin.
- Sat på den korrekte personlige værnemidler kræves af Dyrefacilitet som engangs lab forklæde, Kirurgisk ansigtsmaske og nitrilhandsker.
- Arbejder med 2-4 mus på én gang, vejer hver mus i en 500 mL plastik bæger på en skala, der er nøjagtig til 0,1 g. beregner det korrekte beløb af 24 mg/mL ketamin og 2 mg/mL xylazin fortyndet i normal 0,9% saltvand til at administrere til hver mus ved intraperitoneal injektion (Se refererede video for mere på intraperitoneal injektion) 18. Brug formel (50 µL + ((5 µL) x (vægt (g))), eller alternativt beregnes efter en anden formel efter samråd med den lokale dyrlæge team og IACUC.
- Injicere musen ved intraperitoneal injektion af standard teknikker. Placere musen i et papir spand, indtil musen er immobile.
Bemærk: Mus er klar til kirurgi, når de ikke længere reagerer på tå-knivspids prøve. Give mus, der fortsætter med at reagere på tå-knivspids teste 20-30 min efter den første injektion 20-60 µL mere bedøvelsesmiddel, afhængigt af styrken af svaret. - Sted med musen på en vand-rundsendt varme pad dækket med en blå pad og sted vet salve i begge øjne at forhindre hornhinde udtørring.
- Barbere i venstre side af bagsiden af musen fra skulder til gump og flanke til rygsøjlen med en barbermaskine, designet til pet grooming. Fjern løst hår og debris.
- Forberede en separat sprøjte indeholdende 100 µL fortyndede DNA for hver bedøvede musen, Sørg for, at der ingen luftbobler.
- Bruge en steril 29G x ½" 0,5 mL U-100 insulin sprøjte med en permanent fastgjort nål uden en sikkerhed.
Bemærk: Typen sprøjten er af afgørende betydning. Denne sporvidde giver mulighed for en hurtig injektion. Permanent fastgjort nålen forhindrer løsningen fra siver ud. Tilstedeværelsen af en sikkerhed vil hindre adgang til nyrebækkenet. De sprøjter, der er angivet i tabellen materialer glide mere jævnt under injektion end andre mærker testet. - Indlæse sprøjten til ~ 120 µL og trække stemplet ned for at skabe et rum i toppen. Trykke med en pen, indtil alle luft bobler op til toppen. Hold nålen, omhyggeligt presse stemplet for at fjerne alle luft, indtil en dråbe danner på spidsen af nålen. Der bør ikke være nogen synlige bobler til stede, da disse kan forårsage emboli luft, der vil dræbe dyret.
- Udfør deprimerende stemplet, indtil der er 100 µL i sprøjten ved tømning overskydende DNA løsning i den oprindelige mikrofuge rør. Forsigtigt mærke hvis det er nødvendigt og placere de indlæste sprøjter på en steril drapere at bevare steriliteten, hvis det facilitet, hvor arbejdet udføres ikke tillader opsamling af nåle.
- Bruge en steril 29G x ½" 0,5 mL U-100 insulin sprøjte med en permanent fastgjort nål uden en sikkerhed.
- Bedøver mus med ketamin og xylazin.
- Udføre injektion kirurgi.
- Forberede stedet for kirurgi. Placer en steril drapere over varme pad og Tom steril kirurgiske værktøjer på det sterile drapere uden at røre dem. Afhente musen og placere den i synsfeltet. Justere belysning for at belyse området.
- Fjerne tre 3,15% klorhexidin gluconat og 70% isopropylalkohol hud antiseptiske kloakken fra pakkerne og placere i nærheden af dyret.
- Ændre i steril kirurgiske handsker. Arbejder i en cirkulær bevægelse begyndelsen på indsnit stedet, svaber dyret med en ny chlorhexidin/spritserviet tre gange.
- Find webstedet snit, som vist i figur 1A. Klemme huden med pincet, bruge saks til at gøre et snit på huden lag ca 1 cm fra rygsøjlen og under brystkassen. Når webstedet snit er ca 1 cm lange, foretage en lignende snit site nedenfor, i muskel lag.
Bemærk: Gøre indsnit den rigtige længde til at tillade nyre til lige netop komme gennem incisionen og derefter holdes på plads af indsnittet, selv. For lille et snit og nyrerne ikke kan blive udsat; for stor og nyrerne vil løbende glide tilbage ind i bughulen. - Find nyren.
Bemærk: Det kan være synlige blandt hvidt fedtvæv. Milten er også placeret i venstre side af dyret. Farven på disse organer kan være visuelt differentieret, da milten er en mørke rødbrune mens nyrerne er en mørk rød-orange. Det er ikke ønskeligt at manipulere milten, som det kan være nemt bristede. - Uden at røre nyren, forsigtigt udsætte det fra bughulen ved at sætte støt, blide tryk på maven med fingrene (figur 2 c). Bruge lukkede pincet til at forsigtigt skubbe uønskede organer tilbage i maven hvis nødvendigt. Brug ikke åben pincet, da dette kan beskadige nyrerne eller andre organer.
- Når nyrerne er ud af maven, forsigtigt separat fra de omkringliggende fedt lige nok til at visualisere nyrebækken, en lille hvid prik (figur 1B). Skubbe overskydende fedt til den ene side eller fjern om nødvendigt. Vær sikker på ikke at fjerne binyrerne, i nærheden af den øverste pol af nyrerne, eller nyre kapsel.
- Ved hjælp af lukkede pincet til at skubbe på højre side af nyrerne, så nyrebækkenet forbliver i, forstå indlæst insulin sprøjten med højre hånd og holder den parallelt med den arbejdende overflade med nålen pegede på nyrebækkenet (figur 2E). Indsætte nålen omhyggeligt i nyrebækkenet af immobiliserede nyrerne som vist i figur 1B.
- Injicere løsning hurtigt inden for tre s. Omkring en tredjedel af nyrerne kan klare og ændre farve til hvid.
Bemærk: Det er almindeligt at observere væske oprustning i nyre kapsel følgende injektion samt dannelsen af en hæmatom. Nogle skader er nødvendige for at opnå et tilstrækkeligt niveau af DNA Transfektion til påvisning. - Hold nålen i sted for ca. 10 s for at forhindre tilbagestrømning af løsningen. Derefter forsigtigt og langsomt fjerne nålen. Returnere orgel til bughulen ved forsigtigt strække webstedet indsnit og bruge lukkede pincet.
- Sutur muskel lag af dyret med 5-0 resorberbare suturer, placere 2-4 uafhængige knob.
- Sutur hud lag af dyret med 5-0 eller 6-0 ikke-resorberbare nylon sutur, placere 2-4 uafhængige knob.
Bemærk: Kirurgiske værktøjer kan genbruges efter at placere i en steril perle bad og køles ned.
Figur 1. Korrekte snit websted og nålen placering for Hydrodynamisk nyrebækken injektioner. A) indsnit (rød linje) bør være beliggende ca 1 cm fra rygsøjlen og ca 1 cm under brystkassen af musen. B) efter nyrerne er udsat via flanke indsnit, bør nyrebækkenet være placeret som en lille gullig klar/hvid prik midway ned nyrerne. Injektionen bør ikke forstyrre nyre-vene, nyrearteriestenose eller ureter. Nål af insulin sprøjte er indsat direkte i nyrebækkenet som vist i en dybde af ca. 0,5 cm og hurtigt deprimeret i 2-3 s. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. De kirurgiske foranstaltninger hen til præstere nyrebækken hydrodynamiske injektion af plasmid DNA. A) pincet klemme huden til at gøre det muligt kirurgen at lave en ~ 1 cm flanke snit med en skalpel, først gennem huden lag, derefter gennem muskel lag. B) ved hjælp af to par af lukkede pincet til at åbne den kirurgiske sår, nyrerne er visualiseret i maven hvis det er muligt. C) med blide tryk på maven, uden at røre nogen organer direkte, er nyrerne udsat gennem flanke snit. D) fedt er forsigtigt dissekeret fra nyrerne, forstyrre det så lidt som muligt at opnå adgang til nyrebækkenet. E) trykker på højre side af den venstre nyre for bedre at visualisere nyrebækkenet, sprøjten er afholdt med tommelfingeren på depressor og nålen placeres forsigtigt men fast i nyrebækkenet. F) følgende den < 3 s injektion, clearing kan observeres i områderne i nyrerne, der har modtaget størstedelen af injektion. G) sterile lilla vicryl resorberbare suturer bruges til at lave 2-4 uafhængige knob i muskel lag. H) sterile blå nylon ikke-resorberbare suturer bruges til at lave 2-4 uafhængige knuder i huden lag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
- Genopretning fra kirurgi og postoperativ overvågning.
- Give mus med smertestillende ifølge institutionens IACUC krav for smerter kontrol. For eksempel, administrere buprenorphin ved subkutan injektion hver 8-12 h til 48 h post-operatively Hvis NSAID-relaterede nyreskader er at undgå for studiet.
- Holde mus på en varme pad og overværet af investigator indtil fuldt mobil med brystbenet recumbency. Når fuldt tilbagebetalt, returnere mus til en ren bur, der indeholder en lille mængde af sengetøj fra deres hjem bur til at reducere stress. Gør ikke hus mus udsat for kirurgi med naive mus.
Bemærk: Betingelsen af musene vil forbedre hurtigt, synes at have normal adfærd inden for 24-48 timer. - Give saltholdige væske og øget analgesi til mus der vises stresset til at forbedre deres tilstand. Hvis mus ikke hurtigt genvinder, måle musen vægt, og aflive mus, der har mistet større end 20% af deres oprindelige kropsvægt. Aflive mus optræder uræmisk eller ellers døende. Mulige sundhedsmæssige problemer er nærmere beskrevet i tabel 1.
Bemærk: Mus fjerne undertiden deres ydre suturer eller suturer løsnet inden såret lukning. Dårlig suturering af muskel lag med en intakt hud lag kan resultere i et Brok på indsnit stedet, angivet med svulmende. I sådanne tilfælde, placere musen under anæstesi (isofluran er hurtigere end ketamin/xylazin) og reparere operationsstedet med nye suturer hurtigst muligt. Hvis ikke-resorberbare hud suturer forbliver efter 10-14 dage, skal du fjerne dem. Lejlighedsvis kan mus fjerne deres bur-hjælpere suturer eller kæmpe. Fjerne voldsmanden mus til deres eget bur med berigelse at forhindre dem i at såre andre mus, så snart sådanne opførsel er identificeret. - Når sundhed eller eksperimenterende slutpunkter er nået, aflive mus af CO2-indånding eller isofluran overdosis efterfulgt af en sekundær metode af eutanasi som livmoderhalskræft dislokation ifølge Standard Operating Procedure for eutanasi i sted på institutionen
| Årsag | Debut | Antallet af mus påvirket | Symptomer | Øjeblikkelig handling | Langsigtet løsning | ||
| DNA indeholdt endotoksiner | 6-40 h efter injektion. | Kan påvirke alle de mus får den forurenede DNA forberedelse. | Vejrtrækningsproblemer, tegn på smerter, organsvigt, død. | Aflive de berørte mus. Test hver injiceres komponent for endotoksiner med Limulus Amebocyte Lysate. | Bruge endotoxin-fri maxiprep kits og kun sterile og nye eller NaOH-behandlede labware. Bruge et kommercielt købes, endotoxin-testet buffer til at fortynde DNA. | ||
| Anæstesi overdosis | Under operationen, enten før eller efter DNA injektion. | Kan påvirke kun de yngre, mindre eller slankere mus. | Ophøre med respiration på varmepude, vandladning. | Formindske anæstesi for resterende mus. | Dobbelttjek forberedelse og protokol for dosering nøjagtighed. Udelukke "runts." Konsultere dyrlæge, hvis passende dosis blev brugt. | ||
| Luftboble i sprøjten eller nål anvendes til injektion | Umiddelbart efter nyrebækken injektion. | Medmindre alle sprøjter blev indlæst skødesløst, påvirker det kun en mus. | Gisper efter vejret. | Kontrollere resterende sprøjter for tegn på luftbobler. | Forberede sprøjter omhyggeligt, trykke sprøjte for at fjerne bobler nederst. Forbedre lysforhold for at bedre visualisere bobler. | ||
| Åbning af operationsstedet | 12-72 h efter injektion | En eller flere mus. Undertiden hele buret. | Gabende sår, som regel ingen andre nød | Gentag sutur for at reparere såret grundigt under isofluran anæstesi med steril teknik. Kan være nødvendigt at overrisle med saltvand eller fjerne sår grænser med en saks. | Hvis alle mus har meget korte eller mangler suturer, kan der være en mus at fjerne dem, så mus kan adskilles. Forbedre Sutur teknik. Bruge uafhængige knob. | ||
| Brok på operationsstedet | 48 + h efter injektion | En eller flere mus. | Højen er synlige på operationsstedet. | Under isofluran skære anæstesi med steril teknik, helede huden til at afsløre Brok af muskel lag. Erstatte organer i bughinden, reparere muskel lag med resorberbare suturer og lukke hjemmesiden. | Dette indikerer dårlig suturering af muskel lag. Forbedre Sutur teknik. Bruge uafhængige knob. | ||
| Nyresvigt | 48 + h efter injektion | En eller flere mus. | Vægttab på > 20%, måske bliver uræmisk, foroverbøjet kropsholdning | Give saltvand og øge eller forlænge analgesi. Hvis ingen forbedring er observeret, ofre de berørte mus. | Ændre tilstanden sygdom af dyret til at gøre det mindre alvorlige. Ændre transgen til at være mindre stærk eller inducerbar. Injicere mus på et tidligere tidspunkt i sygdomsprogression. | ||
| Abcess eller infektion | Dage til uger efter kirurgi | En eller flere mus. | Håndgribelig abcess eller tegn på sepsis | Aflive de berørte mus. Anmode om obduktion at bekræfte mistanken. | Dette kan forekomme, når den kirurgiske betingelser og injektioner ikke er tilstrækkeligt sterile. Proceduren vist er for mus med en normal immunsystemet men skal træffes yderligere forholdsregler i fastsættelsen af immunkompromitterede dyr som dem i behandling med cyclophosphamid. | ||
Tabel 1. Tabel over potentielle sundhedsmæssige problemer under nyrebækken injektion protokol. Selv om de nævnte sundhedsproblemer ikke er fælles, er der en række investigator-relaterede fejl, der kan opstå i løbet af proceduren. Denne tabel kan være støtte i forebyggelse og diagnose af de sundhedsmæssige problemer, samt for gennemførelsen af potentielle retsmidler til at forhindre, at sådanne problemer i fremtiden. Med praksis forvente efterforskere sjældne helbredsmæssige problemer og dødelighed på grund af proceduren.
3. vurdere injektion effektivitet og transgene virkninger
- Brug en veludviklet assay for den ønskede transgen til at vurdere Transfektion effektivitet. Brug positive og negative kontroller omhyggeligt for at sikre analysen er specifikke.
Bemærk: Afhængigt af hvilken promotor mus vil sandsynligvis have den stærkeste transgen udtryk på dag 1; altid inden for den første uge efter injektion. - Udføre levende dyrs billeddannelse af luciferase ved at indføre 10 µg luciferase-udtrykker plasmid såsom forbedret firefly luciferase i fortyndet DNA til injektion.
- Ren alle overflader udsat for mus. Sted først bur af mus ind i salen og segl den lukker. Sikre, at der er nok isofluran for eksperimentet ved at kontrollere gage; Hvis ikke, tilføje isofluran, indtil niveauet når linjen "max". Indlede strømmen af isofluran ved at dreje isofluran skiven til 3,5 og ilt til 2.
- Indsprøjtes hver mus ved intraperitoneal injektion med 100 µL af optøede 30 mg/mL luciferin. Registrere tid.
- Åbn software for at kontrollere imaging maskinen ved at klikke på det orange og gule museikonet. Vælg de korrekte initialer under "Vælg/Add User ID," fra drop-down menuen ved siden af "bruger-id". Klik på "OK". I topmenuen, klik på "Køb" og vælg "Automatisk lagring til..." fra drop-down menuen. Vælg mappen, eller Opret en ny mappe til at gemme data til.
- Gå til image erhvervelse boks i nederste højre hjørne. Kontroller, at de automatiske indstillinger er som følger: Binning, medium; F/Stop, 1 for selvlysende, 8 for fotografi; Emission Filter, åbne; Imaging tilstand, kontrollerer selvlysende, fotografi, Overlay og justering kun. Klik på "initialisere" for at initialisere ordningen og venter på initialisering til slut, så ændre "Synsfelt" til "E" til billede fem mus.
- Drej ventilen for anæstesi slanger, så nosecones inde i maskinen administrerer isofluran. Placere dyr inde i imaging maskinen i den ønskede rækkefølge på deres maver med ryggen vender kameraet ovenfor for at visualisere nyren. Hvis mere end én bur til afbildning, skal du placere den næste bur i isofluran kammer.
- 5-10 min efter injektion af luciferin, tryk på "Erhverve" til at tage billedet.
- "Værktøjskassen" til højre, klik på "Billede justering." Under "Farveskala," falde i "Min" baren indtil udtryk er tydelig i alle forventede mus, visualiseret som lilla over hver musenyre. Hvis nogen mus ikke viser udtryk, handler mus med 100 µL af luciferin og vente mindst 3 min før genhentning.
- Hvis billedet har mættet pixels, mindske eksponeringstiden og generhverve for at opnå et kvantitativt billede, da tilstedeværelsen af mættede pixels vil resultere i undervurderer Transfektion effektivitet. Den laveste mulige eksponeringstid er 0,5 s.
- Hvis billedet viser kun svag genekspression eksponering-dengang første, øge eksponeringstiden op til 2 min. og generhverve. Hver gang, billedet er generobret, er data automatisk gemt i den valgte mappe, så alle billeder er tilgængelige for videre analyse senere.
- Gentag imaging trin for efterfølgende bure af mus.
- Fjerne mus fra tænkelig maskine. Slukke gassen. Rene afdeling, nosecones og billeddiagnostiske fase. Lukke et edb-program.
Bemærk: Softwaren vil bede "Gemme datasættet." Dette refererer til manipulationer til datasættet, ikke selve dataene.- Klik på "Ja" for at gemme ændringer i skala og områder af interesse (ROIs). Klik "Nej" for at vende tilbage til de oprindelige indstillinger for billederne.
- Åbn softwaren for dataanalyser. "Værktøjskassen" Klik på "ROI værktøjer." Klik på ikonet cirkel og klik på "1" i drop-down menuen til at placere en ny ROI i billedvinduet som angivet af en rød oval med fire pladser omkring den. Justere størrelsen af Investeringsafkastet ved at placere musemarkøren over en rød firkant og trække for at omslutte den lilla område overliggende den injicerede nyre.
- Placer markøren over en rød firkant på ROI, højreklikke og vælge "Duplikere ROI" til at oprette en ny ROI i billedvinduet og flytte det til den næste mus. Gentag proceduren, indtil alle mus i billedet har en ROI over den injicerede nyre.
- I menuen direkte over billedet, ændres "Enheder" fra "Tæller" til "Radiance (fotoner)." For at eksportere ROI-data i "Værktøjskassen", klik "ROI værktøjer" derefter klikke på ikonet blyant/lineal til at oprette et regneark med målingerne. Brug "Avg Radiance" måling i yderligere analyse i data analyse og statistik program valg.
- Udføre farvning af sektioner som beskrevet11.
Bemærk: Injektion ikke transfect hele nyren lige så forskellige sektioner vil fange forskellige Transfektion effektivitetsgevinster11. Co injektion af perler såsom fluorescerende latex mikrokugler kan hjælpe med at identificere regionerne forventes at være transgen-positive (figur 3D)11. Optimering af farvnings-protokollen er yderst vigtigt. - Udføre vestlige skamplet for at identificere gen af interesse i den transfected nyre.
Bemærk: Høst af organer til protein ekstrakter skal gøres på is. Igen, du ikke brug et lille udsnit af orglet, som dette område ikke kan have været transfekteret godt. Transfektion er ulige fordelt i hele orglet så kombinere forskellige områder og samle dem. Nyrebækken hydrodynamiske injektion af et plasmid producerer hormonet erythropoietin resulterede i en beskeden stigning i hæmatokrit, så det forventes, at der udskilles transgene produkter bør findes i omløb11. - Langsigtet højt udtryk af transgener, kan du kombinere en integrerende vektorsystem med immunosuppressive stoffer såsom cyclophosphamid. Transgenet immunresponset opstår i første adskillige uger efter injektion og er robust11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kirurgi og injektion teknikken er simpel at udføre styr på én gang, kræver ingen større udstyr eller dyre materialer. Hvis nye at flanke-indsnit nyre kirurgi, tillades en træningsdag på flere mus planlagt for aktiv dødshjælp hvor musene ikke er inddrives følgende kirurgi fordi det første forsøg på denne operation kan tage meget længere tid end normalt. Efterforskere fortrolig med lignende teknikker kan alternativt finde det ganske simpelt. Nøje følge illustration i figur 1 og de billedlige retninger i figur 2. For at korrekt placere incisionen, kan kirurgen bruge fingrene til at trykke på musens mave, mens det lægger på sin side. Nyrerne er visualiseret ved en lille klump, der stiger nær rygsøjlen med blid abdominal pres, og snit skal foretages i dette område (figur 1 og figur 2). Det er vigtigt at gøre snit gennem hud og muskel lag den korrekte størrelse (figur 1). Hvis indsnittet er for stor, vil nyrerne glide tilbage ind i bughulen let, vanskeliggør injektion. Hvis indsnittet er for lille, vil det være vanskeligt at skubbe nyrerne ud af bughulen og orgel skade kunne opstå. Et andet vigtigt punkt er placeringen af nålen i nyrebækkenet. Kirurgen skal skubbe nyren med lukkede pincet, så sæt kanylen i nyrebækken i en vinkel parallelt med den arbejdende overflade sådan at de fleste af Injektionsvolumen går direkte ind i nyre parenkym (figur 2). Det er vigtigt at injektionen udføres så hurtigt som muligt til at fremkalde den hydrodynamiske pres der kræves for nyre Transfektion.
Mus af forskellige stammer, alder, vægt og køn har forskelle i placeringen af nyre og mængden af fedt omkring nyrerne, så nogle justeringer kan være nødvendigt at arbejde med mus af interesse. Hvis det er muligt, bør den første kirurgiske forsøg som mus er genoprettet omfatter en øjeblikkelig udlæsning af nyre-specifikke genekspression, såsom luciferase imaging (figur 3A). Hvis unge mus er brugt, er det forventede resultat, at alle mus har en udstråling, der er inden for en størrelsesorden (figur 3B). Lejlighedsvis, selv efter en anden injektion af luciferin fremgår det af imaging, en mus eller mus ikke bliver transfekteret på et niveau svarende til de andre eller at nogle injiceres mus er selv helt mangler i genekspression. Disse mus kan udelukkes fra undersøgelsen på grund af mislykkede transgen levering. Hvis mange af musene mangler genekspression, skal derefter kirurgen formindske tid af injektion af DNA-løsning. Manglende evne til at fremkalde den nødvendige skader gennem højtryk af injektionen er sandsynligvis synderen for konsekvente mangel på genekspression. Mus bør nøje overvåges følgende operation for potentielle sundhedsproblemer (Se tabel 1 for potentielle sundhedsproblemer med ledsagende løsninger og rådføre sig med institutionens veterinære team som nødvendigt). Efter en indledende uddannelsesperiode, bør kirurgi, selv tage mindre end ti min. Den kirurgiske periode bør gøres så kort som muligt ved at operere på en mus på et tidspunkt til at forhindre udtørring af væv under kirurgi. De fleste af tid investeringen i denne procedure er på grund af induktion af og nyttiggørelse fra ketamin/xylazin bedøvelsesmiddel. To erfarne personale, der arbejder som et team skal forvente at udføre op til ti operationer om dagen, med femten som højst rimelig.
Forskere skal forvente et lavt antal celler at plette yderst positive for transgenet inden for de første par dage efter injektionen. Disse positive celler vil være lokaliseret i patches omkringliggende områder hvor injektionsvæske infiltreret nyre (figur 3 c-D). Nogle dele af nyrerne bliver helt negativ for transfekteret celler. Sådanne negative områder vil også mangler erytrocytter og har helt normal histologi, da injektion ikke nåede frem til disse områder. Farvning protokoller og projektledere bør optimeres omhyggeligt for at fange genekspression. Efterforskere bør forvente at cellen typer transfekteret vil være variabel, gene expression niveauer inden for den lave procentdel af celler transfekteret er høj og lokalisering af proteiner i cellerne er muligvis ikke som forventet på grund af høje niveauer af udtrykket (figur 3D).
Figur 3. Hydrodynamisk nyrebækken injektion resulterer i nyre-specifikke genekspression af luciferase og TdTomato. (A) FVB 7-8 uge gamle mandlige mus fik hydrodynamiske nyrebækken injektioner af 20 µg for pTEeL, et plasmid udtrykker forbedret firefly luciferase fra EF-1α initiativtageren. Mus, 2, 3 og 5 var også injiceres med 20 µg af fluorescerende reporter plasmid. B dot plot af udstråling fra mus vist i (A). (C og D) Musene fik enten hydrodynamiske levering buffer alene (C) eller (D) fluorescerende mikrokugler (lyse grønne prikker) og pEF1α-TdTomato udtrykker den røde fluorescerende reporter TdTomato fra EF-1α initiativtageren. Proksimale tubuli blev plettet af Lotus tetragonolobus agglutinin (LTA; grøn) og transfekteret celler er vist efter farvning med anti-RFP antistof til at forstærke TdTomato signal (rød). Kerner er plettet af DAPI (blå). De viste billeder i (C) og (D) er 13,2 mm x 17,5 mm. fejllinjer repræsenterer standard fejlen af middelværdien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol er en robust metode til at opnå reproducerbare genekspression specifikt i nyrerne beskrevet. I hænderne på en moderat erfaren kirurg har vi fundet procentdelen af mus transfekteret ved denne teknik skal være i intervallet 50-100%, afhængigt af musen alder og følsomheden af udlæsning af transgenet. Luciferase genekspression var over baggrunden for adskillige måneder i mus modtage piggyBac transposoner og opretholdes helt i flere uger i immunkompromitterede mus modtager den samme transposoner11. Mens mange celler farves smukt for transgen i områder nær injektionsstedet, den samlede Transfektion effektivitet var relativt lavt (figur 3D). Det vigtigste materiale til at opnå det ønskede resultat er injektion sprøjten, selv. Dette skal være en 29G x ½" insulin sprøjte med en vedhæftet nål og ingen sikkerhed at hindre injektion. Injektion skal være hurtig, inden for tre s. Plasmid DNA forberedelse skal være ren, med meget lav endotoxin og bakteriel genomisk DNA niveauer19.
Det er tænkeligt, at injektioner af andre stoffer, såsom RNA, vira eller protein, kan gøres på en lignende måde. Nyrebækkenet var overlegen som en rute af post til andre injektionssteder testet, såsom nyre-vene eller direkte injektion af nyre parenkym. Disse injektioner førte til blødning og lavere gen expression11. Da nyrebækkenet er en elastisk struktur undertiden forpligtet til at holde urinen tilbagestrømning, det muligvis bedre at strække og rumme nålen. Udsivning af DNA løsning eller urin fra hullet lavet af insulin sprøjten er ikke blevet overholdt, tyder på, at nyrebækkenet er repareret hurtigt. Den nøjagtige mekanisme, hvorved den injicerede væske transfects nyre er ikke blevet undersøgt i dybden, som det har for leveren, f.eks. Fremtidige elektronmikroskopi undersøgelser kan belyse denne mekanisme yderligere. Den retrograde karakter af injektion har forrang i den hydrodynamiske hale vene injektion metode vender strømmen af leverens vene20 og andre vellykkede metoder til nyre Transfektion har injiceret via nyre-vene12, 13 , 14 , 21. nyreskader er sandsynligvis behov for optimal Transfektion virkningsgrader så vi hypotesen, at Transfektion opstår via skader til cellemembranen forårsaget af den hurtige, høj-volumen injektion. Podocytes, tubuli og indsamling kanalerne har direkte grænseflade med urin plads som deres vigtigste funktion er at filtrere og koncentrere urinen.
Selvom reproducerbare og nyre-specifikke, er denne metode begrænset af forholdsvis lave Transfektion effektivitet observeret (figur 3D). Hydrodynamisk nyrebækken injektion er ikke en erstatning for oprettelsen af en transgene dyr kørsel transgenet fra en nyre-specifikke promotor, hvor hver eneste celle i en visse undertype i dyret ville udtrykke gen af interesse. Snarere denne metode er bedst tilpasset til gen overførsel metoder for sygdomme, hvor et lille antal korrigerede celler ville have en dramatisk effekt på fænotype, udskillelsen af hormoner eller andre stoffer, der normalt produceres af nyre eller oprettelse af en befolkningen i sjældne celler, der vil lægge nogle positive virkning på nyrerne til at reparere eller regenerere det. Alternativt kunne det også brugt i den modsatte måde at udvikle en ny model af nyre skade ved at indføre en transgen med en negativ indflydelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har noget at afsløre og erklære nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
En karriere udvikling Award fra Department of veterananliggender [BX002797] støttede L.E.W. og National Institutes of Health [R01-DK095867] og American Heart Association [15GRNT25700209] J.C. National Institutes of Health [DK093660], Department of veterananliggender [BX002190] og Vanderbilt Center for nyresygdom understøttes M.H.W. Dette materiale er et resultat af arbejde støttes med ressourcer og brug af faciliteterne på VA Tennessee Valley Healthcare System.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anesthetic - Not controlled substance |
| BD Insulin Syringe 0.5 mL 29G 1/2 Inch | Cardinal Health | 309306 | Required syringes |
| Buprenex | Pharmacist/Veterinarian | Analgesia - Controlled Substance | |
| Dynarex Disposable Towel Drape | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Place over heat pad |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use only endotoxin-free plasmid DNA |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Positive Control | Charles River | PC200 | Positive control for endotoxin test |
| Endosafe Gel-Clot LAL Rapid Single Test Vial | Charles River | R13500 | Endotoxin test |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instrument | RS-5882 | Surgical tool |
| Fisherbrand Instant Sealing Sterilization Pouch - 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | For autoclaving surgical tools |
| Gaymar Heat Pump | Paragon Medical | TP-700 | Water-circulating heat pump |
| Germinator 500 | Roboz Surgical Instrument | DS-401 | To reuse surgical tools during surgery |
| Graefe Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5136 | Surgical tool |
| Graefe Tissue Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5153 | Surgical tool |
| Halsey Needle Holder, 5" Length | Roboz Surgical Instrument | RS-7841 | Surgical tool |
| Heat pads - 15" x 21" - need at least 3 | Paragon Medical | TP22G | For use with Gaymar Heat Pump |
| IsoFlo (Isoflurane, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | For imaging and euthanasia |
| Isotec Isoflurane Delivery System Vaporizor | Smiths Medical | VCT3K2 | For imaging and euthanasia |
| Ketamine | Pharmacist/Veterinarian | Anesthetic - Controlled Substance | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Laboratory tissues |
| Living Image software | Caliper Life Sciences | For live animal imaging | |
| Luciferin | Perkin Elmer | 122796 | For live animal imaging |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Spectrophotometer for DNA measurement |
| Prevantics Swabs | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | For skin surgery prep |
| Prolene 5-0 sutures Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Non-absorbable sutures for skin |
| Puralube Brand Opthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | To keep eyes moist during surgery |
| Trans IT - QR Hydrodynamic Delivery Solution | Mirus Bio | MIR-5240 | Hydrodynamic delivery buffer for diluting DNA |
| Vicryl 5-0 Sutures J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Absorbable sutures for muscle layer |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Shaver for skin prep |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | For live animal imaging |
References
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA. Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).
- Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues. PLoS One. 11 (1), e0148233 (2016).
- Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume. Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).
- Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver. Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).
- Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs. Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).
- Alino, S. F., et al. Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization. J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).
- Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver. Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).
- Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice. J Vis Exp. (78), (2013).
- Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904 (2017).
- Liang, A., et al. Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis. Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).
- Liang, M., et al. Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis. Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).
- Corridon, P. R., et al. A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).
- Wallace, D. P., et al. Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging. Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).
- Woodard, L. E., Wilson, M. H. piggyBac-ing models and new therapeutic strategies. Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).
- Yeikilis, R., et al. Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats. World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).
- Thalhofer, C. J., et al. In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host. J Vis Exp. (41), (2010).
- Wooddell, C. I., et al. Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent. Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).
- Crespo, A., et al. Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles. Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).
- Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
