Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için

Published: October 12, 2017 doi: 10.3791/56325
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 2, 1,4, 2,4, 1
1University of California, Los Angeles, 2Centre for Biomedical Research, Burnet Institute, 3School of Health and Biomedical Sciences, RMIT University, 4Department of Infectious Diseases, Monash University

Summary

Biz burada bir Fluorometrik boş hücre biyokimyasal tahlil HDL-lipid peroksidasyon belirlenmesi için tarif. Bu hızlı ve tekrarlanabilir tahlil anlayışımız HDL fonksiyonunu kullanabilirsiniz insan hastalık katkıda bulunabilir ve büyük ölçekli çalışmalarda HDL işlevini belirlemek için kullanılabilir.

Abstract

Düşük yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL-C) kolesterolü aterosklerotik kardiyovasküler hastalık (CVD) en güçlü bağımsız negatif belirleyicileri bulunmaktadır. Yapısı ve fonksiyonu HDL-C yerine HDL daha doğru ateroskleroz tahmin. Ateroskleroz gibi inflamatuar Birleşik Devletleri, HDL fonksiyonu zarar HDL protein ve lipit kompozisyon değişiklikler oluşur. HDL işlevi genellikle deneyleri kolesterol sızma tahlil ama bu deneyleri gibi sayısız sakıncaları standardizasyon eksikliği var dayalı hücre tarafından belirlenir. Boş hücre deneyleri HDL işlevi hücre tabanlı deneyleri için kıyasla daha sağlam önlemler verebilir. HDL oksidasyon HDL işlevini bozar. HDL lipid peroksit taşımacılığında önemli bir rolü vardır ve yüksek miktarda lipid peroksitler anormal HDL fonksiyonuyla ilişkilidir. Lipid-sonda etkileşim ne zaman enzimatik olmayan floresan Spektrometre sonuçlarını yorumlama lipid oksidatif devlet ölçmek için deneyleri düşünülmelidir. Bu bize HDL disfonksiyon katkıda bulunan HDL lipid peroksit içeriği (HDLox) değerlendirmek için bir boş hücre biyokimyasal enzimatik yöntem geliştirmek için motive. Bu yöntem enzim horseradish peroksidaz (HRP) ve fluorochrome (kolesterol oksidaz) HDL-c mg başına lipid peroksit içeriği ölçmek Amplex kırmızı dayanır Burada bir iletişim kuralı fluorochrome reaktif kullanarak HDL-lipid peroksidasyon belirlenmesi describedfor. Tahlil değişkenlik deneysel koşullar sıkı Standartlar Kuruluşu tarafından azaltılabilir. Daha yüksek HDLox düşük HDL antioksidan işlevi ile ilişkili değerlerdir. Bu testin okuma doğrulanmış hücre tabanlı deneyleri, kalp-damar hastalıkları, sistemik inflamasyon, immün disfonksiyon ve ilişkili kardiyovasküler ve metabolik risk fenotipleri vekil önlemler çıktıları ile ilişkilidir. Bu teknik yaklaşım HDL işlevi insan hastalığında sistemik inflamasyon, oksidatif stres ve okside lipidler (ateroskleroz gibi) önemli bir rol olduğu değerlendirmek için sağlam bir yöntemdir.

Introduction

Aterosklerotik kardiyovasküler hastalık (CVD) ölüm dünya çapında1,2önde gelen nedenidir. Epidemiyolojik çalışmalar yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) kolesterol seviyesinin düşük genellikle ters ateroskleroz1,2gelişimi için risk ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Çeşitli çalışmalarda HDL1,2için bir atheroprotective rol desteklese de, hangi tarafından HDL başlama ve ilerleme ateroskleroz zayıflar karmaşık 3,4mekanizmadır. Bu nedenle, karmaşık yapısı ve fonksiyonu mutlak düzeyi yerine HDL ateroskleroz 5,6,7,8daha doğru tahmin sürülmüştür. Ateroskleroz gibi inflamatuar Birleşik Devletleri, HDL fonksiyonu zarar HDL protein ve lipit kompozisyon değişiklikler oluşur. Bunlar i) azaltmak onun kolesterol sızma potansiyel 9, II) azaltın anti-enflamatuar ve artış pro-inflamatuar proteinler HDL ilişkili 6,7, III) azalma antioksidan faktör düzeyleri ve etkinlik ve HDL Düşük yoğunluklu Lipoprotein (LDLox)10 ve IV oksidasyonu inhibe yeteneği) lipid hydroperoxide içerik ve Redoks etkinliği (HDLox)9,11artırın. HDL pleotropic işlevleri (örneğin, kolesterol sızma, antioksidan işlevi) çizimle sağlam deneyleri HDL-HDL-C klinikte belirlenmesi tamamlayıcı.

HDL işlevi genellikle kolesterol sızma tahlil8,12,13,14gibi hücre tabanlı yöntemler tarafından değerlendirilir. Bu yöntemi kullanılan hücre türleri, okuma rapor türünü, standardizasyon eksikliği ve trigliserit 7,15karıştırıcı etkileri açısından önemli heterojenite dahil olmak üzere önemli sınırlamaları vardır. Bu sakıncaları zorluklar büyük klinik çalışmalar16için poz. Boş hücre deneyleri HDL işlevi hücre tabanlı deneyleri için kıyasla daha sağlam önlemler verebilir. Kolesterol sızma HDL en önemli işlevlerinden biridir ama hücre tabanlı deneyleri tarafından yalnızca belirlenebilir. Proteomik17,18,19,20,21,22,23gibi HDL işlevini belirlemek için diğer yaklaşımlar 24 ve hücre tabanlı monosit kemotaksisi deneyleri HDL işlevi 17,22,25 değil standardize ve büyük ölçekli insan çalışmalarda kullanılamaz.

HDL önemli antioksidan atheroprotective etkisi5,6,7,8vardır. Antioksidan işlevi HDL, LDL huzurunda önceki hücre ücretsiz Fluorometrik deneyleri 26yılında belirlenmiştir. Biyokimyasal Fluorometrik yöntemlerin HDL antioksidan işlevi başlangıçta Mohamad Navab ve Alan Fogelman ve onların iş arkadaşları26tarafından geliştirilmiştir. Her ne kadar birçok insan çalışmaları-si olmak kullanılmış bu yöntemler HDL işlevi 17,18,19,20,21,22,23 belirlemek için ,24, lipid (HDL)-lipid (LDL) ve lipid fluorochrome etkileşimleri bu hücre ücretsiz enzimatik olmayan biyokimyasal deneyleri HDL işlevi27,28tekrarlanabilirlik sınırlamak.

Son faiz lipidler ve HDL 27,29,30içinde protein oksidasyon sonucu HDL oksidasyon fonksiyonel sonuçları üzerinde odaklanmıştır. Önceki çalışmalar göstermiştir bu oksidasyonunu HDL HDL işlevi 27,29,30bozar. HDL lipid peroksit taşımacılığında önemli bir rolü vardır ve yüksek miktarda lipid peroksitler anormal HDL fonksiyonuyla ilişkilidir. Böylece HDL lipid peroksit içeriği HDL işlevi 9,17,20,31 belirlemek için kullanılan ve HDL işlev7önceki deneyleri bilinen sınırlamaları verilen, 15,27,32, HDL lipid peroksit içeriği (HDLox) 32quantifies alternatif bir Fluorometrik yöntem geliştirdik. Bu yöntem enzim horseradish peroksidaz (HRP) ve fluorochrome (kolesterol oksidaz) HDL-C 32mg başına lipid peroksit içeriği ölçmek Amplex kırmızı temel alır. Tahlil biyokimyasal prensibi şekil 1' de gösterilen. Biz bu floresan dayalı yaklaşım önceki HDL işlevi deneyleri27,28sınırlamaları yok göstermiştir. Bu tahlil edilmiş daha rafine ve böylece büyük ölçüde insan çalışmaları bile cryopreserved plazma 32,33,34, , güvenilir bir şekilde kullanılabilir bizim laboratuarda standart 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. bu tahlil okuma doğrulanmış hücre tabanlı deneyleri, kalp-damar hastalıkları, sistemik inflamasyon, immün disfonksiyon ve ilişkili kardiyovasküler ve metabolik risk fenotipleri vekil önlemler çıktıları ile ilişkilidir 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39. burada, HDL lipid peroksit içeriği (HDLox) ölçmek için bu basit ama güçlü yöntemi açıklanmaktadır. Bu tahlil bir aracı insan hastalığında HDL işlevinin rolü ile ilgili önemli araştırma soruları cevaplamak için sistemik inflamasyon, oksidatif stres ve okside lipidler (ateroskleroz gibi) önemli rol32olduğu kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

tüm deneylerin insan biyolojik numuneleri kullanılarak etik onayıyla California Los Angeles, Los Angeles ve Alfred hastane insan Etik Komitesi, Melbourne Üniversitesi'nden gerçekleştirilmiştir.

Not: fluorochrome HDL işlevi tahlil (bkz: tartışma) 32 birçok varyasyonu vardır. Aşağıda en tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar verir Protokolü anlatacağız. Genel testin Şekil 2 ' deki.

1. numune işleme

  1. Kullanım taze, Sigara hemolyzed serum (serum ayırıcı tüplerde toplanan olabilir) veya sitrat plazma elde edilen 12-14 saat sonra oruç. Bu protokol için açıklandığı gibi uygun denetim cryopreserved örnekleri kullanıyorsanız, dahil.

2. Tahlil için gün 0-hazırlık

  1. hazırlama çalışma düzenini uygun denetimleri ile deneme örnekleri ve çoğaltır. Her örnek en az triplicates içinde çalıştırın. Bir temsilcisi 96 iyi düzen şekil 3 ' te gösterilen.
  2. Örnekleri ve çoğaltır sayısına göre tahlil için kullanılan reaktifler tüm birimleri hesaplamak.
    Not: her çalışma hisse senedi yeterli hacim belirli deneme için her reaktif için olduğundan emin olmak için ek bir % 10 birim içerir.
  3. Etiket HDL, HDL-C (isteğe bağlı) ölçümü ve fluorochromeassay ayrılması için testin tüm farklı adımlar için gerekli tüm tüpler.

3. Gün 1-hazırlık denetimleri

  1. çalışma özel havuza alınan denetim hazırlanması
    1. oluşturma bir denetimi örneğini havuza alınan plazma veya serum tüm çalışma örnekleri. 20 örnekleri her plaka nüsha olarak çalışıyorsa, her örnek üzerinden 10 µL 200 µL havuza alınmış denetime birleştirin. Bu denetimin HDL-C değeri belirlemek için klinik laboratuvar için havuza alınan bu denetimin ayrı bir aliquot verin.
      Not: Bu havuza alınan denetim tahlil standartlaştırmak ve olası tüm bilinen için hesap için kullanın (örneğin plazma, donma-çözülme çevrimleri, dondurma karşı bir matris serum yazın) ve deneysel değişkenlik etkileyebilir bilinmeyen kaynaklanan 27 , 28.
  2. Özel kalite kontrol (QCs) hazırlanması
    1. her laboratuvar (örneğin 5 mL plazma 10 sağlıklı bağışçılardan de gelen izole HDL) HDL büyük bir hazır hazırlamak ve bu birkaç aliquots cryopreserve hisse senedi donma-çözülme döngüsü en aza indirmek için.
    2. Kullanımı en az 10 farklı HDLox ortalama değerini belirlemek için bu stoktan çoğaltır. Ölçülen HDLox kabul edilebilir bir aralık değerleri için her QC örnek her tahlil dahil içinde < bu ortalama değer of varyasyon katsayısı % 15.
    3. Vermek ayrı bir aliquot havuza alınan bu denetimin bu denetimin (örneğin 40 mg/dL) HDL-C değeri belirlemek için klinik laboratuvar.
      Not: Daha detaylı bir yaklaşım kan kan bankalardan bu denetimleri oluşturmak için nasıl kullanılacağı açıklanan 27 , 28 , 32 olmuştur. Gerektiğinde ek QCs kullanın (örneğin bir sağlıklı bir donörden normal HDL işlevi ve bir büyük ölçüde anormal HDL iþlevi için bilinen bir donörden bilinmektedir.
  3. En iyi duruma getirme arka plan sinyal ve boş değerleri (isteğe bağlı)
    1. arka plan en aza indirmek için kurulan H 2 O hızla kaldırmak için kuluçka ortamda katalaz (1-4 U/mL) uygun miktarda ekleyin 2 nedeniyle kendiliğinden hava oksidasyon arabelleklerinin.
      Not: değerleri boş kuyulardan (HDL) HDL örnekleri değerleri çıkarılan ve sonuçları olmak beri (yani aynı 96 iyi plaka dahil) bir havuza alınan denetimi göre rapor bu adımı değil pratikte affec mu bulduk t sonuçları. Böylece, katalaz ile arka plan sinyal duruma getirilmesi, gerekirse atlanabilir.

4. Gün 1-ayrılık HDL kolesterol HDL yağış kullanarak

Not: bir ticari olarak mevcut standart HDL kolesterol Hizlandirici reaktif tükenmiş apoB serum üreticiye göre ayırmak için kullanın ' s talimatları. Bu reaktifler Renkölçer deneyleri HDL kolesterol düzeylerini belirlemek için yaygın olarak kullanılan.

  1. Plazma veya serum örneği kullanmak taze (veya çözülme).
  2. Karışımı eşit miktarda (örneğin 80 µL) plazma ve HDL kolesterol reaktifi (% 20 w/v polietilen glikol glisin tampon pH 10.0 (25 ° C)) presipite.
  3. Mix de tarafından yukarı ve aşağı pipetting.
  4. , Santrifüj kapasitesi 1000-2000 g 10 dakika süreyle x
  5. Süpernatant (HDL kesir) Aspire edin.
  6. İdeal hemen izole HDL HDL lipid peroksidasyon fluorochromeassay için kullanın. Ancak, aynı gün içinde çeşitli örnekleri çalıştırmak ve HDL-kolesterol konsantrasyonu ölçümü yapılır Ayrıca gibi diğer adımları, sonra 4 ° C'de izole HDL kapaklarý takýlý bu ertesi gün fluorochromeHDL işlevi tahlil için.

5. Gün 1-HDL-C izole HDL tayini

Not: HDL-C klinik laboratuvar değerini HDLox normale HDL-C miktar kadar kullanılırsa, isteğe bağlıdır.

  1. Miktarını HDL-kolesterol plazma üzerinden, standart Renkölçer kullanarak 27 deneyleri. Kolesterol reaktif 50 µL her kuyuya ekleyin ve kolorimetrik plaka okuyucu ve bir kolesterol standart her Seti'nde sağlanan kullanarak kolesterol konsantrasyonu belirlemek.

6. Gün 2-reaktifler hazırlanması

  1. HRP 5 U/mL solüsyon (aralığı 1-10 U/mL) hazırlamak HRP ve kolesterol çözümler.
  2. 20 mM fluorochrome (örneğin, Amplex kırmızı) çözümleri hazırlamak: bir şişe fluorochrome reaktif ve DMSO için oda sıcaklığında erimek. Kullanılmadan önce fluorochrome reaktifi (1 mg) DMSO 200 µL geçiyoruz. Saklamak hisse senedi çözüm dondurulup ≤-20 ° C, ışıktan korunan.
  3. Pozitif ve negatif kontrolleri hazırlayın: Kullanım 1 X ' reaksiyon arabellek ' kolesterol ve 20 mM H 2 O 2 çalışma çözüm negatif ve pozitif kontrol sırasıyla.

7. Gün 2-Fluorochrome tahlil

  1. Ekle 50 µL tepki arabellek boş (negatif kontrol) olarak x 1.
  2. İsteğe bağlı: olumlu denetim her plaka olarak 20 mM çalışma çözüm H 2 O 2 ekleyin.
  3. Deneysel değişkenlik en aza indirmek ve reaktifler ve örnekleri bu ek sağlamak için sürekli olarak yapılır ve zamanında, bir ayrı 96 de yuvarlak-alt, açık, polistren veya polipropilen plaka (plaka 1) örneklerinin tüm eklemeler gerçekleştirmek. Belirli birimlerdeki 3 96-şey kalıplara aktarmak için bir çok kanallı pipet kullanın (2-4 tabaklar: Polipropilen, düz botTom, siyah) (Bu aynı düzene sahip) ( Şekil 2, şekil 3).
    1. Örneğin, önce izole HDL 160 µL plaka 1 her şey/örnek ekleyin ve sonra çok kanallı pipet kullanımı ile HDL-kolesterol 50 µL 96-şey siyah kalıplara her şey/örnek aktarmak. Değiştirmek ipuçları arasında her satır/sütun ve filtre edilmemiş su ipuçlarını tüm transferler için kullanın.
  4. Bırakın örnekleri wells. Atmayın. Reaktifler eklenmesi arasında hiçbir yıkama adım vardır.
  5. Ekle 50 µL HRP çözüm 5 U/mL (0.25 U) her şey.
    Not: Kullanım fluorochrome reaktif eklenmesi önce HRP.
  6. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Örnekleri kuluçka (reaktifler eklemeler arasında hiçbir yıkama adımları) sonra atmayın.
  7. Fluorochromereagent 300 son bir konsantrasyon için Ekle 50 µL µM. Bu noktada, toplam reaksiyon birimdir 150 µL. iyice karıştırın ve ışıktan korumak.
  8. Değerlendirmek (karanlıkta) floresan okuma her dakika 120 dk bir floresan plaka okuyucu (530/590 nm filtreleri) ile 37 ° C'de.
    Not: daha kısa bir 60 dakika aralığı ile taze örnekler kullanın. O 120 dakikalık tahlil cryopreserved örnekleri kullanımı ile daha fazla tekrarlanabilir veri verir bulduk.
  9. Kaydetmek uygun yazılımı kullanarak veri.

8. Gün 3-veri analizi

  1. fluorochrome reaktif ilavesi sonra 120 dakika boş wells de dahil olmak üzere tüm örnekleri için kayıt Floresans birimleri (rasgele adet) ve tüm denetimleri.
  2. Floresan birimleri ortalama değerini hesaplamak (temel alan en az triplicates) (HDL ox_sample). Aykırı kabul ediyor (> 2 ortalama değer üzerinden SDs) içine dikkat.
  3. Aşağıdaki denklemi kullanarak arka plan Floresans çıkarma:
    Equation 1
  4. normalleştirme HDL kolesterol miktarı (HDL-C) için: HDL-C tarafından HDLox lipid peroksidasyon değeri (havuzda çalıştırılır denetimi dahil) her örnek için Normalize) (mg/dl). Sonuçları bölümü HDL öküz n HDL-c Duzeltme yansıtacak şekilde (HDL-C) HDLox ölçü olarak sunulur Aşağıdaki denklemi kullanın:
    Equation 2
  5. HDLox lipid peroksidasyon değeri her örnek havuza alınan bir denetimin değerini karşı ifade standartlaştırmak. (HDL-C) HDLox lipid peroksidasyon değeri (HDL-C için ayarlanabilir) her örnek için n n (HDL-C) HDLox lipid peroksidasyon havuza alınan denetiminin değerini normalleştirmek. Sonuçları bölümü HDL öküz deneysel değişkenliği ve HDL-c Duzeltme yansıtacak şekilde nHDL öküz ölçü olarak sunulur Aşağıdaki denklemi kullanın:
    Equation 3
    Not: Bu yaklaşım diğer kurulan deneysel yaklaşımlar gibi deneysel ölçümler değişkenliği azaltmak için benzer Uluslararası oranı (INR) 44 , 45 normalleştirilmiş. Bu yaklaşım klinik çalışmalar 32 , 33 , 34 , 35 , 36 yılında doğrulandı , 37 , 38 , 39.
  6. kalite kontrol deneysel sonuçların standart kalite kontrol örnekleri kullanarak gerçekleştirmek. Her laboratuar kendi kalite denetimleri (QCs) oluşturmanız gerekir. İdeal olarak bir QC bilinen işlevsiz HDL ile bir örnekten nHDLox için ve bir QC için sağlıklı donör [örneğin kullanım havuza alınan örnekten kurulan kan Bankası bağışçılar ve hiçbir bilinen ektanı ve risk faktörleri için genç yetişkin bir örnekten nHDLox olduğunu Kardiyovasküler hastalık] yasaktır dahil olmak üzere. İkinci denetim sonuçları farklı laboratuvarlar arasında standartlaştıran. Ortalama bu QCs kurulan bağlı olarak en az 5 çoğaltır (genellikle 10 çoğaltır bu önemli adım için kullandığımız) değerleridir.
    1. Onay her tahlil ölçülen QCs olup olmadığını değerleri değer beklenen Aralık içinde. Bir kabul edilebilir en fazla deneysel değişkenliğin % 15 varsayarsak, deneysel ölçülen değerlerin kurulan QC bilinen ortalama değerlerden % 15'lik düşmek gerekir. Aşağıdaki denklemler kullanın:
      Equation 4
      Equation 5
      Not: ya dahil kalite kontrol örnekleri Eğer () normal işlevsiz HDL karşı) HDLox değerleri (her laboratuvar kurulu) beklenen aralığın dışında verir sonra denemeyi tekrarlamak.
  7. Kalite kontrol deneysel sonuçlar deneysel değişkenlik ölçmek için (CV) varyasyon katsayısı kullanarak gerçekleştirmek: MF % ile tüm örneklerini tekrar > % 15. Aşağıdaki denklemi kullanın:
    Equation 6
    Not: bir tipik Intra-tahlil (içinde aynı plaka) ve (arasında farklı tabak) arası tahlil deneysel değişkenlik < %15. 2) tipik bir 1-%7 ve CV % 3-10 arasında olduğunu tipik bir interassay içi-tahlil CV olduğunu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Her HDL örneğinin 50 µL adım 7,3 olduğu gibi her kuyuya eklenir. 50 µL HRP çözüm 5 U/mL (0.25 U) sonra adım 7.5 olduğu gibi her kuyuya ekledi. Örnekleri adım 7,6 olarak 37 ° C'de 30 dakika inkübe. Fluorochrome reaktif 50 µL sonra adım 7,7 (300 µM son konsantrasyonu) olduğu gibi her kuyuya eklenir. (Karanlıkta) floresan okuma sonra her dakika bir floresan plaka okuyucu (530/590 nm filtreleri) ile 37 ° C'de 120 dakika içinde değerlendirilir. Boş, havuza alınan denetim temsilcisi Floresans verileri, bilinen işlevsiz HDL ile örnek ve örnek normal HDL ile şekil 4' te gösterilmektedir. Ham temsilcisi veri ve adım adım analiz sonuçlarının Protokolü'nün 8 bölümünde açıklanan denklemleri kullanarak are göstermek içinde Tablo 1. Bu örnekte, taze HDL örnekleri kullanıldı ve daha yüksek HDLox değerleri genellikle taze HDL ile elde edilir. Örneğin, işlevsel olmayan temel alınarak bağımsız deneyleri HDL işlevinin ve HIV enfekte kişinin olduğu bilinen HDL yaklaşık logosuna 2 kat nispeten daha yüksek miktarda lipid peroksit sağlıklı katılımcılar için havuza alınan HDL karşılaştırıldığında vardı. Şekil 5 , HDL işlevi28,32engelliler için bilinen konular ile bir çalışma temsilcisi sonuçlarını gösterir. HIV enfekte kişilerin yaklaşık bulaşmamış kişilere göre HDL-lipid peroksit içeriği (başına mg HDL-c) Yani % 60 daha yüksek vardı. Önceden yayımlanmış çalışmalarımız cryopreserved HDL ile bu yöntem en az % 10 HDLox göreceli farklılıklar HDL için denetim grupları (olmadan hastalığı örneğin kronik HIV enfeksiyonu)36,37, karşılaştırıldığında göstermek başardı 38.

Figure 1
Resim 1: HDL lipid peroksit içeriği HDL-c belirli miktarı tayini
Sistemik inflamasyon ve oksidatif stres Devletleri'nde HDL Engelli HDL işlevi ile ilişkili olan lipid peroksitler (LOOH) (HDLox) artmıştır. HRP floresan sigara fluorochrome floresan resorufin kırmızı için oksidasyon tromboksan. Bu oksidasyon endojen peroksitler tepki (OH-) mevcut ve HDL-lipid peroksitler (LOOH-) tarafından kurulabilir. Kolesterol oksidaz resorufin (HRP ile) içsel HDL lipid peroksit içeriği HDL kolesterol belirli bir miktarda ölçmek. Arka plan üretimini OH - hava oksidasyon arabelleği bir sonucu olarak her şey floresan okuma çıkarılır. Resorufin en az autofluorescence çoğu örnekleri vardır. Bu rakam değiştirilmiş 32olmuştur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: HDL lipid peroksidasyon fluorochromeassay için iş akışı genel bakış.
0. gün: Tahlil hazırlık: A) 96 iyi plaka mizanpajlar tasarlayın, tahmin hacmi örnekleri (plazma/serum) ve Kimyasalları (HRP enzim, fluorochrome reaktif, arabellekleri, PEG reaktif) etiket tüpler
Gün 1: Hazırlık tahlil ve HDL yalıtım için: A) hazırlık denetimleri (özel havuza alınmış çalışma kontrol, kalite kontrol, pozitif ve negatif denetimleri) B) HDL bulutlu PEG reaktif kullanarak.
2. gün: Hazırlık (gün 1'yapılmazsa) tahlil ve fluorochrome tahlil için: A) hazırlık denetimleri (özel havuza alınmış çalışma kontrol, kalite kontrol, pozitif ve negatif denetimleri) a) HDL örnekleri ilavesi: deneysel değişkenlik en aza indirmek için ve reaktifler ve örnekleri ek sürekli olarak yapılır ve zamanında bu örnekleri (e.g. 160 µL) tüm eklemeler bir ayrı 96 de yuvarlak alt, açık, polistiren veya polipropilen plaka (plaka 1) ilk yapılır tavsiye edilir emin olun. Bir çok kanallı pipet belirli birimleri (örneğin 50 µL) 3 96-şey kalıplara aktarmak için kullanılan daha sonra (2-4 tabaklar: Polipropilen, düz dipli, siyah levha) (Bu aynı düzene sahip). B) HRP ilavesi: Ekle 50 µL 5 U/her şey çok kanallı pipet C kullanarak ml (0.25 U)) Incubate 30 dk D için 37 ° C'de) ekle 50 µL 300 µM/her şey çok kanallı pipet E kullanarak için de fluorochrome reaktif) (karanlıkta) floresan okuma her dakika değerlendirmek 120 dakika boyunca bir floresan plaka okuyucu (530/590 nm filtreleri) ile 37 ° C'de.
3. gün: Veri analizi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Fluorochrome HDL işlevinde tahlil genellikle kullanılan 96 iyi plakaların temsilcisi düzeni.
HDL örnekleri ek bir tabak kuyu içine zamanlama farklılıkları spontan oksidasyon farklılıklar arasında farklı wells yol açabilir. Deneysel değişkenlik en aza indirmek için farklı kuyular arasında değişken spontan oksidasyon önlemek ve reaktifler ve örnekleri ek sürekli olarak yapılır ve zamanında, bu örnekleri (e.g. 160 µL) tüm eklemeler olduğunu tavsiye edilir emin olun ilk bir ayrı 96 de yuvarlak alt, açık, polistiren veya polipropilen plaka (plaka 1) yapılır. Bir çok kanallı pipet belirli birimleri (örneğin 50 µL) 3 96-şey kalıplara aktarmak için kullanılan daha sonra (2-4 tabaklar: Polipropilen, düz dipli, siyah levha) (Bu aynı düzene sahip). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: HDL lipid peroksidasyon testin temsilcisi veri.
(Karanlıkta) floresan okuma sonra her dakika bir floresan plaka okuyucu (530/590 nm filtreleri) ile 37 ° C'de 120 dakika içinde değerlendirilir. Temsilcisi veri (rasgele adet) hastadan işlevsiz HDL (iki bağımsız HDL işlevine bağlı olarak bilinen boş (Hayır HDL; negatif denetimleri), pozitif kontrol (H2O2), havuza alınan HDL denetim ve HDL için gösterilir deneyleri-kolesterol sızma ve monosit kemotaksisi tahlil). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: HDL işlevinin lipid peroksit tahlil yüksek lipid peroksit HDL-C içinde vivobaşına belirli bir miktar içerik algılayabilir.
HDL izole edildi ve HDLox 50 sağlıklı konular ve HIV enfeksiyonu olan 100 hastaya protokolündeki açıklandığı gibi tespit edilmiştir. Daha yüksek HDLox (1.59±0.53) (1.01±0.31) kontrollere göre HIV enfekte kişi vardı (p < 0,001). Bu rakam değiştirilmiş 32olmuştur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada açıklanan protokol HDL işlev ateroskleroz ve insan hastalık rolü ile ilgili önemli araştırma soruları cevaplamak için güçlü bir araç sunar. Tahlil HDL lipid peroksit içeriği HDL-C enzimatik amplifikasyon (HRP) kullanarak mg başına quantifies. Bu yaklaşım kullanılan hücre türleri, okuma rapor türünü, standardizasyon eksikliği ve karıştırıcı etkileri açısından önemli heterojenite dahil olmak üzere önceki HDL işlevi deneyleri (örneğin kolesterol sızma tahlil) bilinen sınırlamaları önler trigliserid7,15,32. Biyolojik özelliklerini (örneğin kolesterol sızma) HDL yerine biyokimyasal belirlenmesi-ebilmek var olmak daha tekrarlanabilir. Arası tahlil deneysel değişkenliği < % 10 karşılaştırır olumlu HDL işlevi, interassay deneysel değişkenlik nerede kez hücre tabanlı deneyleri ile > % 15 (veya rapor değildir). Buna ek olarak, bu yaklaşım lipidler arasındaki biyokimyasal etkileşimler sınırlayabilir ve floresan probları32. HDL oksidasyon Kardiyovasküler hastalıkların atherogenesis 46patogenezinde önemli rol içinde Arteryel duvardaki oksidatif stres verilen bağlamda ilgili belirlenmesidir. Ateroskleroz ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonu32gibi kronik oksidatif stres durumlarında Engelli HDL işlevi algılamaya fluorochrome HDL işlevi tahlil kullandık. Biyokimyasal tahlil HDL işlevi kullanarak, çeşitli çalışmalarda HDLox Derneği obezite ve kalp-damar hastalıkları 19,21,27,34,35 ile doğruladı ,36,47. Önemli ölçüde, insan pilot çalışmalar biz HDLox dernekleri ile doğrulanmış hücre tabanlı deneyleri, kalp-damar hastalıkları, sistemik inflamasyon, immün disfonksiyon önlemler vekil ve kardiyovasküler ve metabolik riski ilişkili gösterdi fenotipleri32,36. Bu tahlil çeşitli çalışmalarda farklı hastalıklar gibi kronik HIV enfeksiyonu32,38, HDL işlevinde rolü adrese yolculuklarında uygulanmış olsa ateroskleroz36 32 ve obezite, o artık olmak büyük ölçekli çalışmalar mevcut klinik bitiş noktaları CVD (örneğin kalp krizi) ile doğrulanmış.

Fluorochrome son derece floresan resorufin üretmek için HRP huzurunda peroksitler ile iyi kurulmuş 48,49tepkidir. HRP floresan floresan resorufin kırmızı50,51fluorochrome oksidasyonunu tromboksan. Bu oksidasyon endojen peroksitler tepki (OH-) mevcut ve HDL-lipid peroksitler (LOOH-) tarafından kurulabilir. Kolesterol oksidaz resorufin (HRP ile) içsel HDL lipid peroksit içeriği HDL kolesterol belirli bir miktarda ölçmek. Arka plan üretimini OH - hava oksidasyon arabelleği bir sonucu olarak her şey floresan okuma çıkarılır. Resorufin en az autofluorescence çoğu örnekleri vardır. Floresan okuma artış zaman içinde HDL lipid peroksitler tarafından tahrik edilir böylece katalaz (1-4 U/mL) tepki arabellekte eklenmesi hızlı bir şekilde endojen peroksitler azaltmak. Tahlil çok yönlü ve HDL Kolesteril ester ücretsiz HDL kolesterol32,48,49 karşı lipid peroksit içeriği değerlendirebilir.

Fluorochrome HDL işlevi tahlil32birçok varyasyonu vardır. Kısa bir süre en az 3 önemli yaklaşım vardır: bir) HDL (örneğin 50 µL) belirli bir birim başına iyi eklemek ve daha sonra normale HDL lipid peroksidasyon değer HDL-C klinik laboratuvarda; belirlenen düzeyi tarafından b) HDL-C konsantrasyonu standart Renkölçer kolesterol deneyleri üzerinde dayalı her örnek içinde belirlemek ve HDL-C (örneğin 1 µg) belirli bir miktarda iyi ücret ekleyin; ve c) HDL işlev okuma HDL veya apoA normalize-ben protein içerik32. Ayrıca HDL HDL lipid peroksidasyon deneyleri için izole konusunda en az 3 önemli yaklaşım vardır: a) HDL kolesterol yağış örneğin ile polietilen glikol; b) Immunoaffinity yakalama; ve c) HDL yalıtım µLtracentrifugation32gibi diğer standart değil yüksek üretilen iş yöntemleri. Buna ek olarak, tahlil çok yönlü ve HDL Kolesteril ester ücretsiz HDL kolesterol 32karşı lipid peroksit içeriği değerlendirebilir. Oranı bir havuza alınan denetim32sonuçlar örneğin rasgele Floresans birimleri, standart resorufin floresan birimleri, normalleştirilmiş bildirmek için çeşitli yolları vardır. Burada biz en tekrarlanabilir yaklaşım mevcut.

Plazma kullanılırsa plazma sodyum sitrat antikoagülan 27,28olarak var tüpler hazırlamak önemlidir. EDTA40 ve heparin sülfat ile oksidasyon reaksiyonları 41,42engelleyebilir. Heparin sülfat HDL işlevi 27,28biyokimyasal deneyleri ile etkileyebilir. Cryopreserved serum ve plazma lipidler, HDL fonksiyon ve HDL lipid peroksidasyon belirlenmesi için suboptimal olmakla birlikte, cryopreserved örnekleri HDL mg başına HDL lipid peroksidasyon göreli farklılıkları ölçmek. Belirli bir çalışma içinde tüm örnekleri tam olarak aynı şekilde (örneğin aynı donma-çözülme döngüsü) işlemek ve havuza alınan bir denetim için potansiyel confounders örnek işleme farklı çalışmalar arasında farklılıklar ile ilgili hesap her plaka dahil etmek önemlidir. Uzun vadeli dondurma HDL işlevi deneyleri43 sonuçlarını olumsuz etkileyebilir ama uygun bir havuza alınan denetim kullanılan 27ise HDL lipid peroksidasyon bir çalışma içinde örnekleri arasında göreceli farklılıklar hala değerlendirildi, 28.

Önemlisi, önceki HDL işlevi deneyleri standart değil. Burada nerede uygun kontrollerin kullanımı okuma standardizasyon sağlar bir yaklaşımı açıklamak. Özellikle HDL biyokimyasal deneyleri okuma etkileyebilecek bazı bilinen parametreler bulunur daha fazla dondurma, matris etkileri (serum vs yöntemi plazma hazırlık), albümin ve diğer proteinler varlığı gibi işlev donma-çözülme 32. HDL işlevi fluorochrome tahlil ticari olarak mevcut standartları ve deneysel reaktifler32kullanılarak standart. Ancak, orada dabirkaç bilinmeyen (veya kötü karakterize) kaynaklanan her çalışma ve HDL belirlenmesi etkileyebilir farklı kişiler arasında sonuçları işlev. Böylece, her tabak içinde faiz eserler ve kaynaklanan32en aza indiren (işlenen aynı şekilde) bir verilen çalışma içinde belirli örnekleri hazırlanan havuza alınan bir HDL denetimi kullanın. Plazma kan Bankası örnekleri ve HDL-C değerleri klinik laboratuvar kullanımı daha da tahlil32standart hale getirmek.

Biz daha önce farklı yöntemler HDL tecrit HDL işlevi 27,28,32 biyokimyasal deneyleri okuma önemli ölçüde etkileyebilir ama fluorochrome güvenilir bir şekilde HDLox bakılmaksızın ölçebilirsiniz göstermiştir HDL yalıtım 32tanesi. HDL izolasyon yöntemleri yüksek üretilen iş araştırmalar HDL işlevinin önemli kısıtlayıcı bir faktör vardır. Ultrasantrifüj başvuru yöntemi bugün kabul edilir, ancak bir zaman alıcı yöntemi52kalır. Elektroforez imprecise ve 53standart değil. HDL yağış yöntemleri polyanions polietilen glikol (HDL süpernatant 54yılında bırakarak düşük yoğunluklu lipoproteinler çökelti PEG) gibi kullanımı dahil. Her ne kadar bu yöntemler bazı sakıncaları numunelerde Serumlar ile değişken sonuçları ve enzimatik kolesterol yordamlar 55 önceki değişiklikler ile etkileşimler gibi ekranda özgün yordamı kullanarak ticari olarak mevcut standart reaktifler bir basit, güvenilir ve doğru yordam56verim. PEG yağış HDL21,57 hastanın serum üzerinden yalıtmak için yaygın olarak kullanılan yöntem olsa da, büyük bir sorun sigara HDL proteinler gibi albümin58varlığıdır. Immunoaffinity yalıtım HDL işlev 32albümin etkisini en aza indirmek için kullanılabilir. Özel yakalama yöntemi için HDLox içinde göreceli farklılıklar tespit edilebilir olsa da, HDL karşı belirli antikor karmaşık HDL yapıları yakalamak değil tamamen. Bu protokol için açıklandığı gibi uygun denetimleri kullanarak HDLox göreceli farklılıklar (PEG yağış tarafından izole) HDL örnekler arasında güvenilir bir şekilde belirlenebilir.

Bu yöntemi, HDL işlevinin diğer deneyleri gibi önemli sınırlamaları vardır. HDL in vivo oksidasyonunu Arteryel duvardaki oldukça karmaşık ve türdeş olmayan ve lipid peroksit içeriği yalnızca kısmen HDLox46yansıtıyor olabilir. HDL yapısı ve fonksiyonu sürekli vivo değiştirir ve HDL fonksiyon için bir timepoint ölçümü HDL disfonksiyon uç organ hastalığında etkisini saat59yansıtmıyor olabilir. Olmadığı bilinmiyor olup olmadığını HDLox okuma HDL-C veya HDL protein 22normalleştirilmiş. Gelecekteki klinik çalışmalar tahlil (HDL lipid peroksit içeriği HDL-C mg başına) okuma önemini doğrulamak.

Sonuç olarak, fluorochrome HDL işlevi tahlil HDL lipid peroksit içeriği HDL (HDLox) belirli miktarda ücret tespiti için güvenilir bir yöntemdir. Daha yüksek HDLox düşük HDL antioksidan işlevi ile ilişkili değerlerdir. Okuma Bu testin doğrulanmış hücre tabanlı deneyleri ile vekil önlemler kalp-damar hastalıkları, sistemik inflamasyon, immün disfonksiyon ve ilişkili kardiyovasküler ve metabolik risk fenotipleri 19, ilişkili 21,27,32,34,35,36,37,38,39, 47. bu yöntem HDL işlevi insan hastalığında rolünü inceleyen için uygun, ancak sağlam bir araç sunmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu iletişim kuralı ve tahlil patent PCT/US2015/018147 için uygundur.

Acknowledgments

Yazarlar minnetle Dr Mohamad Navab, Alan Fogelman ve Srinivasa Reddy iş geliştirme, önceki yineleme bu modelin içindeki anahtar rolü için kabul. T.A.A. bir RMIT Üniversitesi-Şansölye Yardımcısı'nın doktora sonrası bursu tarafından desteklenir. AJ ve AA NHMRC proje desteği 1108792 tarafından desteklenir. TK tarafından desteklenmektedir NIH NIH K08AI08272, NIH/NCATS Grant # µL1TR000124 verir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Experimental Reagents
HDL PEG (Polyethylene Glycol) Precipitating Reagent Pointe Scientific H7511
Amplex Red reagent. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
DMSO. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Horse Radish Peroxidase (HRP) Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Esterase. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Cholesterol Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
Resorufin fluorescense Reference standard Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
5x Reaction Buffer. Life Technologies, Grand Island, NY A12216 Amplex Red Cholesterol Assay Kit.
• ≤–20°C • Desiccate
• Protect from light
HDL Cholesterol Automated Reagent ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. TR39601
Name Company Catalog Number Comments
Plasticware
96-well plates (polypropylene, flat bottom, clear). Sigma Aldrich M0687
96-well plates (polypropylene, flat bottom, black). Sigma Aldrich M9936
1.5 mL Eppendorf tubes Eppendorf 0030 125.150
ClipTip 200, sterile ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA. 14-488-058
Thermo Scientific Multichannel Pipettes, 8-channel, 125  ThermoFisher Scientific Co., San Jose, CA, USA.  14-387--955
Name Company Catalog Number Comments
Software
Gen5 2.01 software Biotek, Vermont, USA NA
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Gen5 Plate reader Biotek, Vermont, USA NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, D. J., Rifkind, B. M. High-density lipoprotein--the clinical implications of recent studies. N Engl J Med. 321, 1311-1316 (1989).
  2. Rubins, H. B., et al. Gemfibrozil for the secondary prevention of coronary heart disease in men with low levels of high-density lipoprotein cholesterol. Veterans Affairs High-Density Lipoprotein Cholesterol Intervention Trial Study Group. N Engl J Med. 341, 410-418 (1999).
  3. Voight, B. F., et al. Plasma HDL cholesterol and risk of myocardial infarction: a mendelian randomisation study. Lancet. 380, 572-580 (2012).
  4. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat.Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  5. Navab, M., et al. The double jeopardy of HDL. Ann Med. 37, 173-178 (2005).
  6. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Anantharamaiah, G. M., Fogelman, A. M. The role of dysfunctional HDL in atherosclerosis. J Lipid Res. 50, Suppl . S145-S149 (2009).
  7. Navab, M., Reddy, S. T., Van Lenten, B. J., Fogelman, A. M. HDL and cardiovascular disease: atherogenic and atheroprotective mechanisms. Nat Rev Cardiol. 8, 222-232 (2011).
  8. Patel, S., et al. Reconstituted high-density lipoprotein increases plasma high-density lipoprotein anti-inflammatory properties and cholesterol efflux capacity in patients with type 2 diabetes. J Am Coll Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  9. Navab, M., et al. HDL and the inflammatory response induced by LDL-derived oxidized phospholipids. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 21, 481-488 (2001).
  10. Hayek, T., Oiknine, J., Brook, J. G., Aviram, M. Role of HDL apolipoprotein E in cellular cholesterol efflux: studies in apo E knockout transgenic mice. Biochem Biophys Res Commun. 205, 1072-1078 (1994).
  11. Van Lenten, B. J., et al. Anti-inflammatory HDL becomes pro-inflammatory during the acute phase response. Loss of protective effect of HDL against LDL oxidation in aortic wall cell cocultures. J Clin Invest. 96, 2758-2767 (1995).
  12. Undurti, A., et al. Modification of high density lipoprotein by myeloperoxidase generates a pro-inflammatory particle. J Biol Chem. 284, 30825-30835 (2009).
  13. Van Lenten, B. J., et al. Lipoprotein inflammatory properties and serum amyloid A levels but not cholesterol levels predict lesion area in cholesterol-fed rabbits. J Lipid Res. 48, 2344-2353 (2007).
  14. Watson, C. E., et al. Treatment of patients with cardiovascular disease with L-4F, an apo-A1 mimetic, did not improve select biomarkers of HDL function. J Lipid Res. 52, 361-373 (2011).
  15. Annema, W., et al. Impaired HDL cholesterol efflux in metabolic syndrome is unrelated to glucose tolerance status: the CODAM study. Sci Rep. 6, 27367 (2016).
  16. Movva, R., Rader, D. J. Laboratory assessment of HDL heterogeneity and function. Clin Chem. 54, 788-800 (2008).
  17. Charles-Schoeman, C., et al. Abnormal function of high-density lipoprotein is associated with poor disease control and an altered protein cargo in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 60, 2870-2879 (2009).
  18. Imaizumi, S., et al. L-4F differentially alters plasma levels of oxidized fatty acids resulting in more anti-inflammatory HDL in mice. Drug Metab Lett. 4, 139-148 (2010).
  19. Khera, A. V., et al. Cholesterol efflux capacity, high-density lipoprotein function, and atherosclerosis. N Engl J Med. 364, 127-135 (2011).
  20. Morgantini, C., et al. Anti-inflammatory and antioxidant properties of HDLs are impaired in type 2 diabetes. Diabetes. 60, 2617-2623 (2011).
  21. Patel, P. J., Khera, A. V., Jafri, K., Wilensky, R. L., Rader, D. J. The anti-oxidative capacity of high-density lipoprotein is reduced in acute coronary syndrome but not in stable coronary artery disease. J Am Coll Cardiol. 58, 2068-2075 (2011).
  22. Watanabe, J., et al. Proteomic profiling following immunoaffinity capture of high-density lipoprotein: association of acute-phase proteins and complement factors with proinflammatory high-density lipoprotein in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 64, 1828-1837 (2012).
  23. Watanabe, J., et al. Differential association of hemoglobin with proinflammatory high density lipoproteins in atherogenic/hyperlipidemic mice. A novel biomarker of atherosclerosis. J Biol Chem. 282, 23698-23707 (2007).
  24. Watanabe, J., et al. Hemoglobin and its scavenger protein haptoglobin associate with apoA-1-containing particles and influence the inflammatory properties and function of high density lipoprotein. J Biol Chem. 284, 18292-18301 (2009).
  25. Wang, X. S., et al. A sensitive and specific ELISA detects methionine sulfoxide-containing apolipoprotein A-I in HDL. J Lipid Res. 50, 586-594 (2009).
  26. Navab, M., et al. A cell-free assay for detecting HDL that is dysfunctional in preventing the formation of or inactivating oxidized phospholipids. J Lipid Res. 42, 1308-1317 (2001).
  27. Kelesidis, T., et al. A biochemical fluorometric method for assessing the oxidative properties of HDL. J Lipid Res. 52, 2341-2351 (2011).
  28. Kelesidis, T., et al. Effects of lipid-probe interactions in biochemical fluorometric methods that assess HDL redox activity. Lipids Health Dis. 11, 87 (2012).
  29. Navab, M., et al. Mechanisms of disease: proatherogenic HDL--an evolving field. Nat Clin Pract Endocrinol Metab. 2, 504-511 (2006).
  30. Navab, M., et al. The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids and HDL. J Lipid Res. 45, 993-1007 (2004).
  31. Morgantini, C., et al. HDL lipid composition is profoundly altered in patients with type 2 diabetes and atherosclerotic vascular disease. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 24, 594-599 (2014).
  32. Kelesidis, T., et al. A high throughput biochemical fluorometric method for measuring lipid peroxidation in HDL. PLoS One. 9, e111716 (2014).
  33. Kelesidis, T., Yang, O. O., Kendall, M. A., Hodis, H. N., Currier, J. S. Dysfunctional HDL and progression of atherosclerosis in HIV-1-infected and -uninfected adults. Lipids Health Dis. 12, 23 (2013).
  34. Zanni, M. V., et al. HDL redox activity is increased in HIV-infected men in association with macrophage activation and non-calcified coronary atherosclerotic plaque. Antivir Ther. 19, 805-811 (2014).
  35. Roberts, C. K., Katiraie, M., Croymans, D. M., Yang, O. O., Kelesidis, T. Untrained young men have dysfunctional HDL compared with strength-trained men irrespective of body weight status. J Appl Physiol (1985). , 1043-1049 (2013).
  36. Davidson, W. S., et al. Weight loss surgery in adolescents corrects high-density lipoprotein subspecies and their function. Int J Obes (Lond). 41, 83-89 (2017).
  37. Kelesidis, T., et al. Predictors of impaired HDL function in HIV-1 infected compared to uninfected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr. , (2017).
  38. Kelesidis, T., et al. Oxidized lipoproteins are associated with markers of inflammation and immune activation in HIV-1 infection. AIDS. 30, 2625-2633 (2016).
  39. Kelesidis, T., et al. Changes in plasma levels of oxidized lipoproteins and lipoprotein subfractions with atazanavir-, raltegravir-, darunavir-based initial antiviral therapy and associations with common carotid artery intima-media thickness: ACTG 5260s. Antivir Ther. , (2016).
  40. Bhattacharyya, D. K., Adak, S., Bandyopadhyay, U., Banerjee, R. K. Mechanism of inhibition of horseradish peroxidase-catalysed iodide oxidation by EDTA. Biochem J. 295 (Pt 2), 281-288 (1994).
  41. Rees, M. D., Pattison, D. I., Davies, M. J. Oxidation of heparan sulphate by hypochlorite: role of N-chloro derivatives and dichloramine-dependent fragmentation. Biochem J. 391, 125-134 (2005).
  42. Mani, K., Cheng, F., Fransson, L. A. Heparan sulfate degradation products can associate with oxidized proteins and proteasomes. J Biol Chem. 282, 21934-21944 (2007).
  43. Finley, P. R., Schifman, R. B., Williams, R. J., Lichti, D. A. Cholesterol in high-density lipoprotein: use of Mg2+/dextran sulfate in its enzymic measurement. Clin Chem. 24, 931-933 (1978).
  44. von Schenck, H., Jacobsson, M. L. Prothrombin assay standardized with an international normalization ratio (INR): goal and reality. Clin Chem. 33, 342 (1987).
  45. de Kok, J. B., et al. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 85, 154-159 (2005).
  46. Stocker, R., Keaney, J. F. Jr Role of oxidative modifications in atherosclerosis. Physiol Rev. 84, 1381-1478 (2004).
  47. Holzer, M., et al. Aging affects high-density lipoprotein composition and function. Biochim Biophys Acta. 1831, 1442-1448 (2013).
  48. Amundson, D. M., Zhou, M. Fluorometric method for the enzymatic determination of cholesterol. J Biochem Biophys Methods. 38, 43-52 (1999).
  49. Mishin, V., Gray, J. P., Heck, D. E., Laskin, D. L., Laskin, J. D. Application of the Amplex red/horseradish peroxidase assay to measure hydrogen peroxide generation by recombinant microsomal enzymes. Free Radic Biol Med. 48, 1485-1491 (2010).
  50. Lombardi, A., et al. UCP3 translocates lipid hydroperoxide and mediates lipid hydroperoxide-dependent mitochondrial uncoupling. J Biol Chem. 285, 16599-16605 (2010).
  51. Bhattacharya, A., et al. Denervation induces cytosolic phospholipase A2-mediated fatty acid hydroperoxide generation by muscle mitochondria. J Biol Chem. 284, 46-55 (2009).
  52. Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of µLtracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 34, 1345-1353 (1955).
  53. Dyerberg, J. Comments on the quantitation of lipoproteins by agarose-gel electrophoresis. Clin Chim Acta. 61, 103-104 (1975).
  54. Warnick, G. R., Cheung, M. C., Albers, J. J. Comparison of current methods for high-density lipoprotein cholesterol quantitation. Clin Chem. 25, 596-604 (1979).
  55. Demacker, P. N., Hijmans, A. G., Vos-Janssen, H. E., van't Laar, A., Jansen, A. P. A study of the use of polyethylene glycol in estimating cholesterol in high-density lipoprotein. Clin Chem. 26, 1775-1779 (1980).
  56. Izzo, C., Grillo, F., Murador, E. Improved method for determination of high-density-lipoprotein cholesterol I. Isolation of high-density lipoproteins by use of polyethylene glycol 6000. Clin Chem. 27, 371-374 (1981).
  57. Patel, P. J., Khera, A. V., Wilensky, R. L., Rader, D. J. Anti-oxidative and cholesterol efflux capacities of high-density lipoprotein are reduced in ischaemic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 15, 1215-1219 (2013).
  58. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N. R., Tarnus, E., Bourdon, E. The antioxidant properties of serum albumin. FEBS Lett. 582, 1783-1787 (2008).
  59. Panzenbock, U., Kritharides, L., Raftery, M., Rye, K. A., Stocker, R. Oxidation of methionine residues to methionine sulfoxides does not decrease potential antiatherogenic properties of apolipoprotein A-I. J Biol Chem. 275, 19536-19544 (2000).

Tags

İmmünoloji sorunu 128 HDL işlevi HDL lipid peroksidasyon boş hücre tahlil Fluorometrik yöntemi Amplex kırmızı okside
Boş hücre biyokimyasal Fluorometrik enzimatik tahlil yüksek yoğunluklu Lipoprotein Lipid peroksidasyon yüksek üretilen iş ölçümü için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X.,… More

Sen Roy, S., Nguyen, H. C. X., Angelovich, T. A., Hearps, A. C., Huynh, D., Jaworowski, A., Kelesidis, T. Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein. J. Vis. Exp. (128), e56325, doi:10.3791/56325 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter