Summary
연골과 피부 아날로그 bioprinted nanocellulose-alginate 근거한 bioink를 사용 하 여 했다. bioinks 번 수동 혼합 장치를 통해 인쇄 하기 전에 cellularized 했다. 구문 균일 하 게 cellularized, 높은 생존 능력, 그리고 차별화의 유리한 마커 전시를 시연 했다.
Abstract
Bioprinting 조직 엔지니어링 응용 프로그램에 대 한 구문 신속 하 고 재현성 제조 강력한 기술입니다. 이 연구에서는 연골과 피부 유사 체 소설 수동 단위 기술 혼합을 이용 하 여 bioink pre-cellularization 후 조작 했다. 이 기술은 높은 점성 bioink에 세포 현 탁 액의 혼합에 관련 된 단계를 단순화 하는 목적으로 개발 되었다. Bioprinting를 통해 입금 하는 필 라 멘 트의 해상도 셀 영역의 셀 없이 증 착 또는 바늘을 방해할 수 있습니다 큰 세포 덩어리의 보존을 피하기 위해 인쇄 전에 배포에 균일의 보증을 필요로 합니다. 우리는 빠르게 연골과 피부 유사 체의 bioprinting 전에 bioink와 세포 현 탁 액을 혼합 하는 기능을 보여 줍니다. 두 조직 아날로그 최대 4 주 동안 배양 수 있습니다. 조직학 분석 시연 세포 생존 능력 및 조직의 특정 세포 외 기질 (ECM) 마커 있다 (개 그), 콜라겐 등의 난 각각.
Introduction
최근 몇 년 동안, 3 차원 (3D) bioprinting 기술 연구원, 기술 조직 유사 체의 제조에 더 널리 활용 될 수 있도록 더 접근 되고있다. Bioprinting 생물 의학 연구의 다각적인 조직 구문 신속 하 고 반복 가능한 제조를 촉진 하 여 혁명을 약속 드립니다. Bioprinting 기술의 핵심 3 차원에서 생체 재료 (bioinks 라고도 함)의 증 착을 정확 하 게 제어 하는 능력에 낳는다. 매트릭스 구성, 생리 활성 요소, 및 기본 조직 구조 정리 더 정확 하 게 수 있는 셀의 별개의 영역으로 복잡 한 장비의 세대 수 있습니다.
Bioprinting은 연골1, 피부2,3, 근육 및 뼈4를 포함 하 여 많은 조직의 응용 프로그램에 대 한 구조의 제조에 이용 되었습니다. 이 조직 때문에 그들의 본질적인 전기 마이크로-아키텍처 레이어, 레이어 증 착을 통해 재현 부에 대 한 적합 한 bioprinting에 대 한 매력이 있습니다. 특히, 피부 bioprinting 같은 레이어, 레이어 증 착 기술을 통해 제조를 위해 적당 한 잘 정의 된 다층된 구조5를 소유한 다. 또한, bioprinting 구조는 필요한 해 부 치수를 생성 하기 위해 이용 될 수 있다와 형태는 조직 복구를 제거. 환자 특정 크기와 모양6 생체 재료를 생성 하는 기능 등 많은 조직의 부분 수리에 대 한 수요를 해결 하기 위해 시작할 수에 국한 되지 않는 뼈 결함, 연골 손상 및 피부 장애의 정도에서 변화 한다 환자-환자입니다.
이 연구에서 두 조직 아날로그 (관절 연골과 피부) pre-cellularized bioinks bioprinting를 통해 조작 했다. 셀 서 스 펜 션 도전이 될 수 있다 세포 생존 능력을 보존 하는 동안 균일 한 셀 배포를 보장할 수 있는 bioink의 적절 한 혼합을 보장 합니다. Bioinks bioprinting 통해 압출에 적합 자주 높은 점성 그리고 균질 성 혼합 되도록 혼합 하는 광범위 한 필요. 셀에 기계적 손상 거친 혼합 조건 하에서 발생 하 고 생존에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 연구 결과 잉크젯 인쇄 프로세스 동안 대부분 세포 죽음 혼합7,8등 준비 하는 동안 발생 하는 것으로 나타났습니다. 전통적인 혼합 교 반9 낮은 점도 bioinks 잉크젯 인쇄10적합에 대 한 충분 한 될 수도 있지만, 높은 점도 bioink로 셀의 혼합 압출 bioprinting를 위해 더 적당 한 더 어렵습니다. 해결이 필요, 혼합 노즐의 사용 더 인쇄 과정11동안 bioinks의 혼합에 대 한 인기가 되고있다. 이들이 믹서는 또한 널리 이용 되어 마이크로 연구 중요 한12가 낮은 레이놀즈 수와 액체의 혼합에. bioink으로 세포 현 탁 액을 혼합 하는 연속 혼합 공정 활용 인쇄 과정에서 균일성에 대 한 수 것입니다. 그러나, 이후 셀 정지는 bioink에 비해 낮은 점도가지고, 인쇄 과정9,,1314중 셀의 침전 방지에 어려움 발생 합니다. 또는, 인쇄 하기 전에 bioink로 셀의 혼합이 문제를 해결 수 있습니다.
최소화 하기 위해 세포 죽음을 bioink으로 혼합 하는 동안, 우리는 최소한의 단계에서 bioink 셀 바꿀 수동 섞는 단위에 따라 기술을 개발. 혼합 장치를 통해 자료의 흐름을 통해 생성 된 혼란 혼합 reproducibly 조화 두 가지 구성 요소가 함께15,16에 충분 하다. 이 방법은 주로 어떤 bioink는 압출 bioprinting 적합으로 어떤 세포 현 탁 액의 혼합을 단순화 하기 위해 개발 되었다. 혼합 과정에서 단계 수 혼합 사용자-사용자 변형 제거를 최소화 했다. 과도 한 혼합 단계 셀 관련 하는 경우에 특히 시간이 걸릴 하 고 모든 bioinks, 적용 되지 않습니다 될 수 있습니다. 보조, 우리 독립적인 무 균 유지와 샘플 손실을 최소화 하는 혼합 공정 개발 목적.
이 원고, 혼합 세포 현 탁 액 bioink 수동 처리를 최소화 하 고 높은 세포 생존 능력 및 유니폼 배포 단위 기술 혼합을 사용 하 여 보여 줍니다. 이러한 pre-cellularized bioinks 다음 bioprint 연골 또는 피부 최대 6 주에 대 한 교양을 각각 하나 또는 두 개의 셀 종류와 구성에 활용 됩니다. 활용 하는 bioink 이전 bioprinting1에 대 한 적합성 표시는 alginate nanocellulose 조화입니다.
Protocol
이 프로토콜은 Chalmers 대학의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
참고: 모든 단계 살 균 biosafety 내각 내에서 수행할 수 있습니다.
1. 소모품, Bioink, 및 세포의 준비
- 두 개의 주사기를 얻을, bioink (그림 1b)에 대 한 다른 주사기는 한 주사기 (그림 1a) 셀 서 스 펜 션입니다.
- 살 균 수동 혼합 단위그림 1(c) 듀얼 주사기 Luer 잠금 연결을 통해 결합 될 수 있다 얻을.
- 볼륨 제어 속도로 동시에 두 개의 무 균 주사기에서 돌출 수 분배 장치를 (그림 1의d)를 가져옵니다.
참고:이 연구에 활용 하는 혼합 비율 10:1입니다. 따라서, 10:1 혼합 단위에 따라 12 mL 주사기와 1 mL 주사기를 사용 합니다. - (그림 1e) 살 균 카트리지 및 직접에 bioink 및 세포 현 탁 액을 혼합 하는 살 균 여성 여성 Luer 잠금 커넥터를 가져옵니다.
- 얻거나는 bioink 세포 현 탁 액과 혼합에 대 한 준비.
참고:이 프로토콜에 기반으로 하는 nanocellulose/alginate bioink 이용 되었다. 이 bioink는 포스트 인쇄 살 균 100 m m CaCl2 솔루션의 추가 통해 상호 연결 된. - 0.5 %trypsin / EDTA 용액을 사용 하 여 셀을 분리 하 고 trypan 블루 제외 방법17를 사용 하 여 셀의 총 수를 계산 합니다.
참고:이 프로토콜에서 인간의 섬유 아 세포 했다 활용 됩니다. - 어떤 셀 밀도 최종 인쇄 된 구문에서 원하는 결정 합니다. 이 대상 최종 셀 밀도 달성 하기 위해 희석 해야 합니다 수확된 셀의 농도 다음 방정식을 사용 하 여 계산 합니다.
참고:이 프로토콜에서 최종 셀 밀도 5 x 106 셀/mL의 이용 되었다.- 원하는 셀 농도 실험에 대 한 선택: C셀 (셀/mL).
- Bioink 필요, Vbioink, 원하는 구문의 총 수에 따라 금액 계산:
Vbioink = V구성 × NContructs
참고: 예를 들어 구문 당 bioink의 볼륨은 100 µ L. 30 구조, 인쇄 하는 경우 필요한 bioink 볼륨 3 mL입니다. - 필요한 셀의 수를 계산.
N셀 C셀 (1.1 × Vbiolink) = - Resuspend 1/10번째 는 bioink의 볼륨에서에서 (N셀) 셀:
V세포 현 탁 액 = 0.1 × Vbiolink
참고: 예를 들어, 경우 Vbioink V세포 현 탁 액 3 mL = = 0.1 × 3 = 0.3 mL
2. 세포 현 탁 액 및 Bioink의 혼합
- 셀 서 스 펜 션 주사기로 세포 현 탁 액을 전송 합니다.
- 다른 주사기에는 bioink를 전송 하거나 포함 하는 bioink 주사기를 얻을.
- Bioink 주사기 플런저를 후퇴 하 고 분배 장치에 주사기를 삽입 합니다. 세로로 Luer 잠금 커넥터와 위쪽 (그림 1f1) 단위를 배치 합니다.
- Bioink 주사기로 비슷한 길이를 다시 셀 주사기의 플런저를 당겨 하 고 분배 장치 (그림 1f2)에 삽입 합니다.
- Luer 잠금 커넥터 (그림 1f3) 복잡 하 게 혼합 단위를 모두 주사기를 연결 합니다.
- 돌출 주사기에 공기를 분배 장치에 밀어 혼합 시스템을 프라임. 못쓰게 솔루션 Luer 잠금 (그림 1g4)에 도달 하기 전에 중지 합니다.
- 애 벌 칠, 후 충전 카트리지 Luer 잠금 커넥터 (그림 1g 5)를 통해 혼합 단위의 끝에 연결 합니다. 충전 카트리지에서 플런저 하단 첨부 파일 이전에 있는지 확인 합니다.
- 천천히 카트리지 (그림 1i7)에 함께 bioink와 세포 현 탁 액을 혼합 분사 장치 (그림 1h6) 압축.
- Bioink-셀 혼합 혼합 후 연결할 피펫으로 멸 균 팁 충전 카트리지 아래쪽에 플런저를 밀어. 셀/bioink 혼합물은 혼합에 다시 압출 하지 있도록 압축 될 때까지 분배 하십시오.
- 카트리지 뚜껑을 부드럽게 작업 대에 카트리지 (피스톤 끝)의 상단에 어떤 공기 방울을 이동 하려면 누릅니다.
참고:이 시점에서 셀/bioink 혼합은 인쇄에 대 한 준비. 다음 섹션에서는 특정 응용 프로그램 및 인쇄 절차 개요 것입니다.
3. 수동 주걱 혼합에 비해 혼합 단위를 사용 하 여 세포 생존 능력의 결정
- 80% 합류에서 0.5%의 트립 신/EDTA 용액으로 인간의 섬유 아 세포 (통로 7)를 분리, 개수, 및 충분 한 세포 밀도 bioink와 혼합 후 최종 농도 달성 하기 위해 문화 매체에서 resuspend (1시 10분 셀: bioink 비율) 5 x 10의 6 셀/mL입니다.
- 혼합 셀 중 수동 단위 기술 (단계 2)를 혼합 사용 하 여 bioink 또는 세포 생존 능력에 두 기술의 효과 평가 하는 주걱을 통해.
- 수동 단위 기술 1, 2, 또는 3 번 100 m m CaCl2를 사용 하 여 교차 연결에 대 한 금형에 분배 하기 전에 혼합을 사용 하 여 bioink로 세포를 혼합.
참고: 추가 혼합을 수행 하는 카트리지 보다는 주사기에 직접 셀/bioink를 혼합. 다음 혼합 셀 주사기 구성 하지 않고 이전 프로토콜에 따라 혼합 장치를 통해 리믹스. - 혼합 주걱을 통해 30, 60, 90 또는 미 전송의 기간에 대 한 (각 혼합 시간)에 대 한 혼합물 100 mM CaCl2를 사용 하 여 교차 연결에 대 한 금형에 수동 기계를 사용 하 여 별도 bioink로 세포를 혼합.
- Cross-linking 문화와 표준 조건 하에서 완료 후에 잘 접시에 샘플을 전송.
- 문화의 1 일 후 씻어 구문 (n = 그룹 당 3-4) 30 분에 대 한 혈 청 무료 세포 배양 매체에 얼룩 얼룩 솔루션 구문에서 셀 (4 µ M Calcein 오전, 1 µ M 브로민 homodimer-1) 30 분.
- 두 개의 추가 번 세척 하 고 37 ° c.에서 1 h의 총에 대 한 혈 청 무료 세포 배양 매체에서 샘플을 품 어
4. 단일 셀 유형으로 연골 아날로그 Bioprinting
- 원하는 조직 아날로그의 3D 모델을 그립니다. Gcode 파일 bioprinting에 변환 하 고 bioprinter1에 Gcode 파일 로드.
참고:이 프로토콜에 크기 4.8 x 4.8 x 0.9 m m3 평방 구조는 STL 파일로 내보낼 했다. 다음 설정을 사용 하 여 격자 구조의 Gcode 파일 생성: 레이어 두께, 0.3 m m; infill 패턴, 직선; infill 밀도, 25%; 속도, 10 m m/s입니다. - 분리 하 고 기본 인간의 코 chondrocytes (hNC) 환자 참조 된 프로토콜1에서 cryopreserve.
- 해 동 및 cryopreserved hNCs를 확장 하 고 37 ° c.에 표준 문화 매체를 사용 하 여 단층 문화에 한 번 확장 80-90% 합류 0.5 %trypsin / EDTA 솔루션에서 세포를 분리 하 고 trypan 블루 제외 프로토콜을 사용 하 여 계산. 모든 실험은 통로 2에 hNCs를 사용 하 여 실시 했다.
- 100 x 106 셀/mL 이내 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린-스, 그리고 준비는 bioink 혼합 50 µ g/mL ascorbic 산 보충 문화 매체의 300 µ L에는 hNCs를 resuspend.
- 블렌드 nanocellulose/alginate에 hNC 세포 현 탁 액 단위 프로토콜 9 x 106 셀/mL의 최종 셀 농도를 10:1 bioink:cell 정지 비율로 혼합 수동 bioink 다음을 기반으로 합니다.
- 그는 bioprinter 살 균 되 자외선 노출과 닦기를 통해 아래로 70% 에탄올으로 확인 합니다. 층 류 흐름에 캐비닛을 배치 하 여 불 임을 유지 합니다.
- Bioink/셀 서 스 펜 션의 혼합을 포함 하는 카트리지를 살 균 인쇄 노즐을 연결 하 고는 bioprinter에 삽입.
- 수동으로 또는 프린터에 특정 프로토콜에 의해는 bioprinter를 보정.
- Bioprint 격자 구조 셀-라덴 구문 다음 인쇄 매개 변수를 사용 하 여: 25 G 25 kPa의 압력에 원뿔 노즐. Bioprint 셀-무료 구조 (셀을 포함 하는 셀 매체와 혼합) 컨트롤입니다.
- 구문을 구문 100 m m CaCl2 5 분 린스의 이온 솔루션을 추가 하 여 상호 링크 하 고 표준 문화 조건 (37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 상대 습도)에서 문화 매체에서 품 어. 두 번째 또는 세 번째 매일 미디어를 변경 합니다.
- 2-4 주에 조직학 분석을 위해 샘플을 수집 합니다. Alcian 블루 얼룩18를 사용 하 여 개 그 생산에 대 한 샘플을 얼룩.
5. 2 개의 세포 유형으로 피부 아날로그 Bioprinting
- 원하는 조직 아날로그의 3D 모델 그리고 bioprinting Gcode 파일로 변환. Gcode 파일은 bioprinter에 로드 합니다.
참고:이 프로토콜에 크기 4.8 x 4.8 x 0.9 m m3 평방 구조는 STL 파일로 내보낼 했다. Gcode 파일은 다음 설정을 사용 하 여 격자 구조의 생성: 레이어 두께, 0.3 m m; infill 패턴, 직선; infill 밀도, 25%; 속도, 10 m m/s입니다. - Bioprinting에 대 한 bioink에 혼합에 대 한 셀을 준비 합니다. 피부 유사 체의 제조에 대 한 2 개의 세포 유형 활용 했다. 두 세포 유형 bioink와 bioprinting로 혼합 했다.
- 기본 HDF를 얻을. 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린-스와 50 µ g/mL ascorbic 산 보충 DMEM 성장 매체에서이 세포를 유지 합니다. 80-90% 0.5 %trypsin / EDTA 솔루션 및 카운트와 합류에 셀을 분리 합니다.
- 분리 하 고 기본 hNC 환자 참조 된 프로토콜1에서 cryopreserve. 해 동 한 단층 문화에서 cryopreserved hNCs를 확장 합니다. 80-90% 0.5 %trypsin / EDTA 솔루션 및 카운트와 합류에 셀을 분리 합니다.
- 100 x 106 셀/mL 성장 미디어 내에 두 종류를 resuspend. 믹스 미디어의 300 µ L에서 100 x 106 셀/mL의 최종 총 농도 달성 하기 위해 1:1 비율로 함께 셀 정지.
- 블렌드 HDF 및 nanocellulose/alginate에 hNC의 50: 50 세포 현 탁 액 단위 프로토콜 9 x 106 셀/mL의 최종 셀 농도를 10:1 bioink:cell 정지 비율로 혼합 수동 bioink 다음을 기반으로 합니다.
- bioprinter 살 균 되 또는 무 균 유지 캐비닛 층 흐름에 배치 됩니다 확인 하십시오.
- Bioink/셀 서 스 펜 션의 혼합을 포함 하는 카트리지를 살 균 인쇄 노즐을 연결 하 고는 bioprinter에 삽입.
- bioprinter 중 하나를 수동으로 보정 또는 프린터에 특정 프로토콜.
- Bioprint 격자 구조 셀-라덴 구문 다음 인쇄 매개 변수를 사용 하 여: 25 G 25 kPa의 압력에 원뿔 노즐. Bioprint 셀-무료 구조 (셀을 포함 하는 셀 매체와 혼합) 컨트롤입니다.
- 구문을 구문 100 m m CaCl2 5 분 린스의 이온 솔루션을 추가 하 여 상호 링크 하 고 표준 문화 조건 (37 ° C, 5% CO2, 그리고 95% 상대 습도)에서 문화 매체에서 품 어. 두 번째 또는 세 번째 매일 미디어를 변경 합니다.
- 2-4 주에 조직학 분석을 위해 샘플을 수집 합니다. 콜라겐에 대 한 샘플의 얼룩이 나 Masson의 trichrome 얼룩19를 사용 하 여 생산.
Representative Results
이 원고는 결과 두 개의 섹션으로 나누어집니다. 첫째, 세포 생존 능력 후 기계적인 방법 또는 수동 혼합 단위 혼합 분석 했다. 다음, 연골 및 피부 구문은 경작 되었고 관련 조직학 표식에 대 한 분석.
셀 유통 동질적인 두 경우 모두에서 나타났다. 그러나, 주걱 (그림 2b)를 사용 하 여 손으로 혼합의 행동 수동 혼합 단위 (그림 2는)와 혼합 하는 것 보다 더 많은 차이 있다. 범위, 속도, 그리고 주걱으로 혼합 기술을 매우 사용자에 따라 달라 집니다. 그러나, 수동 섞는 단위와 bioink로 세포를 혼합 혼합 표준화 하 고 일괄 처리를 통해 변화를 최소화 합니다. 또한, 30, 60, 90 s 혼합 시간 5 월 bioink의 대량으로 많은 양의 세포의 혼합에 대 한 충분 한 수 없습니다. 주걱으로 혼합을 통해 보다 엄격한 블렌딩 할 수 있습니다. 비교, 수동 혼합 단위를 활용 하 여 더 나은 혼합 하는 동안 bioink에 셀의 혼합 비율을 유지 하 고 균질 혼합 수행 되도록 보장. 또한, 샘플 손실 어디 bioink 남아 있을 수 있습니다 뒤에 접시, 튜브, 및 그들의 높은 점도 인해 혼합 도구에서 전통적인 혼합 기술로 관심사 이다. 세포 생존 능력은 섞는 단위와 혼합에 대 한 높은 (> 90%) 1, 2, 또는 3 번. 수동 혼합 단위 이용 되었다 때 일정 한 속도로 천천히 혼합 약 1 분을 했다 혼합. 30 그리고 60 s 90 보다 큰에 대 한 혼합 후 높은 생존 능력을 전시 주걱으로 혼합 하는 동안 다른 그룹에 비해 생존에 큰 감소 귀착되 었 다 혼합의 s (77.9 ± 14%, p < 0.05)그림 2(c). 이 과도 한 혼합 세포에 손상을 일으키는 원인일 수 있습니다. 장기 라이브/죽은 얼룩 14 일 및 문화의 28 일 후 보충 그림 1에 표시 됩니다. 셀 하루 14, 확산 시작 높은 하루 28, 확산 하 고 좋은 생존을 나타냅니다.
문화, 후 연골과 피부 조직 아날로그 조직학 통해 분석 되었다. 0, 14, 그리고 28 일에 연골 구문 분석에서는 수량에 Alcian 블루 얼룩 (그림 3a-3_c)를 통해 같이 개 그의 범위 증가. 하루에 14 얼룩은 위치에 있는 셀에 인접 하는 동안 얼룩의 부재는 날 0, 것으로 나타났습니다. 그러나, 문화의 하루 28, Alcian 블루 chondrocytic ECM의 형성을 보여주는 구조에 걸쳐 발견 된다. Bioprinted 피부 구조는 조직학 얼룩 콜라겐의 Masson의 Trichrome 얼룩 (그림 3d-3 층)을 활용 하 여 내가 통해 분석 되었다. 연골 구조와 마찬가지로, 0 샘플 전시 아니 콜라겐 증 착. 문화의 하루 14, 콜라겐의 상당한 예금 셀 주위 및 구성의 표면을 따라 지적 했다. 이 조밀한 콜라겐 레이어 구조 표면에 및 대량 내 발견 했다 더 하루 28, 강화 되었다.
그림 1 : 혼합 단위 시스템 수동. 세포 현 탁 액, (b) 12 mL 주사기 (e), (d) 수동 혼합 단위, (c) 분배 단위, bioink 카트리지, (f) 어셈블리 bioink 주사기 (1) 및 셀의 작성에 대 한 (는) 1 mL 주사기 서 스 펜 션 주사기 (2) 분배 단위, 수동 혼합 단위 주사기 (3), 여성 여성 Luer 잠금 커넥터 (4)의 첨부 파일 (g)와 충전 카트리지 (5)의 첨부 파일의 끝에 부착 완료 (h, 어셈블리 ) 총리는 혼합 단위 (6), (나)를 분배 단위를 압축 분배 단위는 bioink와 세포 현 탁 액을 혼합 하 여 충전 카트리지 (7)으로 분배에 밀어 계속. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 세포 생존 이미지 및 분석. 수동 단위 1, 2, 또는 3 배 혼합과 혼합 후 라이브 (녹색)와 죽은 (레드) 인간의 섬유 아 세포를 보여주는 대표 이미지 (a) 또는 30, 60, 또는 90 초 (b)에 대 한 주걱과 1 일 3D 문화. 4 배 확대에 이미지 표시 됩니다. 규모 막대 표시 200 µ m. (c) % 평균 생존 인간의 섬유 아 세포의 1 일 단위 또는 주걱 및 3D 문화를 혼합 하는 수동과 혼합 후. 오차 막대의 평균, 표준 편차를 표시 * 0.005. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 조직 특정 세포 외 매트릭스 증 착. 14, 그리고 (c) 28 Bioprinted 연골 구조 있다 0, (b) Alcian (a)에서 파란색을 활용 하 여 대 한 스테인드. 5 배 확대에서 캡처 이미지입니다. 콜라겐에 대 한 Masson의 Trichrome (d)를 사용 하 여 0, (e) 14, 난 스테인드 Bioprinted 피부 구조와 (f) 28. 5 배 확대에서 캡처 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: 14 (a), 일과 일 28 (b)에서 세포 생존 능력. 눈금 막대는 200 µ m, 그린 라이브 셀 참조, 레드 죽은 세포를 말합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
에서와 같이이 원고, pre-cellularized bioinks bioprinted 중 연골을 조작 또는 아날로그 최대 4 주 동안 배양 된 피부를 했다. 수동 단위 기술 혼합을 사용 하 여 혼합 한 후 세포 생존 능력 전통적인 혼합 방법 보다는 더 높았다. 또한, 혼합 장치를 사용 하 여 혼합 프로세스의 단순화 처리 단계 수를 최소화 하 고 혼합의 정도에서 더 나은 일관성에 대 한 있습니다. 궁극적으로, 두 셀 유통 구조 및 실험적인 그룹 bioink, 시간과 더 나은 재현성 결과. 조직의 특정 ECM 등의 구성 요소 개 그 콜라겐의 난 문화의 4 주 후 각각 연골과 피부 유사 체에 대 한 관찰 되었다. 이 혼합 기술과 다른 조직 대상을 조작 하 선택한 구조 기하학의 유연성을 나타냅니다. 연골과 피부 유사 체의 제조 전시 독특한 설계 조직 목표에 대 한 nanocellulose-alginate bioink와 bioprinting의 두 사용의 유연성. 우리는 아래의 연구의 두 가지 구성 요소를 설명 합니다: (1) 수동 단위 기술, 그리고 (2) 연골과 피부 유사 체 내의 셀의 동작을 혼합.
개발과 bioink에 세포 현 탁 액의 혼합에 대 한 기술 최적화 이러한 구조의 제조에 중요 했다. 전통적인 낮은 점도 히드로 재료, 달리는 bioinks의 높은 점도 인쇄 하기 전에 bioink의 pre-cellularization에 어려움에 결과. bioink에 셀 설립의 전통적인 방법 대신, 점성 bioink에 세포 현 탁 액의 원스텝 혼합에 대 한 프로토콜 개발 및 논의. 또한, 조직 구조의 제조에서 혼합이 기술의 실용적인 응용 프로그램 평가 했다. 이 한 단계 혼합 방법은 전통적인 혼합 기술 포함 제어 혼합 비율, 높은 및 불규칙 한 전단 응력의 최소화를 통해 몇 가지 장점이 고 샘플을 제거 하는 닫힌된 시스템 혼합 용기에 닫습니다. 그러나,이 기술은 세포/bioink 혼합에 대 한 전통적인 방법에 비해 장점이 되도록 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 셀 셀 주사기에 중단 하 고 잘 혼합 하기 전에 혼합 긴요 하다. 너무 큰 주사기에 해제 및 셀의 전송 사이의 시간 간격의 시작 혼합 공정 발생할 수 있습니다 고르지 혼합 및 인쇄 된 필 라 멘 트로 유통 될 토사에 셀. 경우 침전 관찰, 간단한 반전 (2-3 회)의 혼합 직전 수동 혼합 단위 어셈블리는 resuspend 세포와 혼합 전 균일 한 분포를 보장 하기에 충분. 그것도 주사기에서 공기 방울 제거 또는 최소화 혼합 비율이 일정 하 게 유지 되도록 사전에 중요 한. 큰 공기 방울 혼합 이전 bioink 카트리지에 남아, 경우에 솔루션을 통해 실행 혼합 단위는 추가 시간 철저 하 게 혼합 되도록 하는 것이 좋습니다. 공기 방울 남아 있으면 인쇄 카트리지/주사기의 부드러운 도청 잔류 공기 방울 치환 수 있습니다. 또한, 여러 재료 혼합 (여러 혼합 단위 또는 자료)은 필요한 경우 더 복잡 한 구조에 대 한, 혼합 수를 bioinks/세포 현 탁 액의 농도 조정 해야 합니다, 적절 한 혼합을 통해 희석 후 되도록 최종 농도 아직도 얻을 수 있다.
다른 혼합 기술에 비해 수동 혼합 단위 bioinks cellularize에 대 한 새로운 접근 이다. 혼합, 또는 주걱 또는 다른 도구와 함께 감동 듀얼 주사기 같은 다른 혼합 기술, 달리 수동 혼합 단위 배치 및 사용자가 혼합에 더 일관성을 수 있습니다. 수동 혼합 기법, 주걱 혼합, 등의 자연의 혼합의 속도에 더 큰 사용자-사용자 변화에 발생합니다. 또한, 단위 및 듀얼 주사기 혼합 혼합 수동 폐쇄 시스템 매뉴얼 페 트리 접시 또는 튜브에서 혼합에 비해 더 작은 샘플 손실이 있다.
Bioink의 단일 유형 및 1 개 또는 2 개의 세포 유형 모두 조직 아날로그가이 원고에 조작에 의하여 이루어져 있다. 그러나, 다른 세포 유형으로 뚜렷한 bioinks의 영역을 포함 하는 아키텍처의 구성 조직 아날로그의 bioprinting 더 많은 생리 적 조직 구조20,21의 제작에 필요한 있을 수 있습니다. 22. 더 독특한 구성으로 bioinks를 전문화 또는 기능 다양 bioinks 있는 고유한 구성 또는 기능23, 창조 하는 함께 기존 bioinks의 여러 종류의 혼합을 통해 생성 될 수 있습니다. 24. 이 피하 층 또는 bioink 구성25,26 의 기온 변화도의 개발을 보장 하기 위하여 필요한 수 조직 지역 뼈 연골 피부와 같은 조직 전환 영역에서 특히 중요 한 있을 수 있습니다. 기본 조직27에서 발견이 중요 한 영역입니다. 또한, 혼합 단위 성장 요인 및 bioprinting 이전 bioinks에 morphogens 혼합 활용 될 수 있습니다. 닫힌된 혼합 시스템으로 샘플 손실의 제거는 비싸고 낮은 농도 생리 활성 요소의 사용에 대 한 매력이 어디 샘플 손실 bioprinted 구문 내 그들의 최종 농도 변경에서 될 수 있습니다, 특히 그라디언트 관련 됩니다.
수동이이 연구에 활용 하는 단위를 혼합을 포함 하 여 어떤 혼합 기술로 제한 기계적으로 민감한 세포 유형에 손상의 위험입니다. 예를 들어 같은 줄기 세포를 고립 된 골 또는 태아, 또는 유도 만능 줄기 세포에서 기계적 손상28,29더 받습니다. 혼합의 행위 셀 혼합 공정에 관련 된 전단 세력 때문에 비정상적인 기계적 스트레스를 부여 하 고 그들은 생존30을 유지 하기 위해 균형 해야 합니다. 기본 섬유 아 세포와이 연구에서 chondrocytes 사용 결과 좋은 생존 (그림 2), 하는 동안 더 많은 연구는 안전 혼합 비율 및 더 민감한 셀 형식에 대 한 비율을 결정 하는 데 필요한. 그때까지, 그 생존 능력을 극대화 하기 위해 꾸준한 느린 속도에서 수행 혼합 것이 좋습니다. 또한,이 연구에서 선택한 셀 밀도 이전 연구1에 따라 결정 했다. 이 셀 밀도 모든 셀 형식에 적합 하지 않을 수 있습니다.특히, 높은 농도에서 세포를 혼합 세포 생존 능력 및 조직 형성31,32향상 될 수 있습니다 증가 셀 연락처 발생할 수 있습니다. 비슷한 맥락에서 수동 혼합 단위 셀 spheroids 또는 다른 셀의 집계33 bioinks로 혼합에 적용할 수 있습니다.
로 제안 하 고 혼합 단위 시스템 수동 점성 bioink으로 빠르게 세포 현 탁 액 혼합이 연구에서 설명. 셀에 기계적 손상에 대 한 위험이 여전히 남아 있다, 그러나 접근 내 단일 연구와 사용자가 더 많은 일관성을 수 있습니다. 이 접근을 이용 하 여 pre-cellularized bioinks 두 연골을 조작 하 여 최대 4 주 동안 배양 되었고 조직 특정 ECM 마커의 시연 아날로그 피부 사용 되었다. 미래 연구는 단위 시스템에서 더 복잡 한 조직 유사 체의 제조에 대 한 표준화 된 bioinks 전문된 bioinks 혼합을 혼합 하는 수동의 활용에 집중할 것 이다.
Disclosures
이 논문의 저자는 CELLINK LLC의 직원이 있습니다.
Acknowledgments
저자 아무 승인 있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| STARTINK Kit | CELLINK | SK0001 | Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure |
| Live/Dead Kit | Life Technologies | L3224 | Kit for the analysis of cell viability after mixing |
| Masson's Trichrome | Sigma Aldrich | HT15-1KT | Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs |
| Alcian Blue | Sigma Aldrich | B8438-250ML | Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs |
| INKREDIBLE+ bioprinter | CELLINK | Gen1+ | Printer utilized in the study |
| DMEM with Glutamax | Thermofisher | 10566016 | Media for culture of the cells |
| 10% fetal bovine serum | Thermofisher | A3160402 | Media supplement |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15070063 | Media supplement |
| live cell imaging solution | thermofisher | A14291DJ | component utilized using live/dead imaging |
| inverted microscope | Olympus | IX73 | microscope utilized |
| a digital color camera | Olympus | XC10 | microscope camera utilized |
| cellSens imaging software | Olympus | n/a | stock software with the microscope |
| ImageJ | NIH | n/a | open source image analysis software |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad | n/a | software for statistical analysis |
| Slic3r software (v1.2.9) | Slic3r | n/a | open-source software to convert .stl file to gcode |
| primary adult human dermal fibroblasts | ATCC | PCS-201-012 | cell source for fibroblasts |
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