Summary
현재 bilayer 문화 모델 vivo에서 microenvironments 모방 기능 생체 외에서 연구에 대 한 허용 하지 않습니다. 폴 리 에틸렌 글리콜과 산화 아연 템플릿 메서드를 사용 하 여이 프로토콜에 설명 합니다 ultrathin biomimetic 지하실 막의 개발을 가변 강성, 다공성와 밀접 하 게 비보에 모방 하는 생 화 확 적인 구성 세포 외 매트릭스입니다.
Abstract
지하실 막 강성, 구성, 건축, 그리고 다공성과 다양 한 세포질 bilayers의 중요 한 구성 요소입니다. 상피 내 피 bilayers의 학문 생체 외에서 전통적으로 bilayer 문화를 활성화 하는 침투성 지원 모델에 의존 해야 하지만 투과 지원 인간의 지하실 막의 다양성을 복제 하는 기능에 제한 됩니다. 반면, 화학 합성을 해야 하는 하이드로 겔 모델 높은 가락 고 소재 강성 및 biomimetic 펩 티 드 또는 단백질의 결합을 통해 생 화 확 적인 구성의 수정에 대 한 허용 한다. 그러나, 그들은 모 셀 연락처 및 마이그레이션 연구 기능 생체 외에서 부족 하기 때문에 전통적인 히드로 모델 기능에 제한 됩니다. 또한, 전통적인 hydrogels 두께 때문 hydrogels의 전체 두께 걸쳐 있는 숨 구멍의 설립이 되었습니다 도전. 현재 연구 사용 하 여 poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels와 소설 아연 산화물 템플릿 메서드 biomimetic hydrogels의 이전 단점을 해결 하기 위해. 그 결과, 선물이 ultrathin, 지하실 멤브레인 같은 히드로 가변 기 공 구조, 기계적 특성, 및 생 화 확 적인 구성 사용자 정의 발판에 confluent 셀룰러 bilayers의 문화입니다.
Introduction
세포 외 매트릭스 (ECM) 단백질 건설 기계 셀 첨부 파일을 지 원하는 다른 세포 유형 사이 방 벽으로 봉사 하 고 복잡 한 조직 및 장기의 필수 구성 요소를 확인 합니다. 간 질 성 결합 조직, 달리 지하실 멤브레인 (BM) 다른 조직 구획 분할 하는 장벽 역할 ECM의 특수 유형입니다. BMs 약 100 µ m 두께, 그리고 따라서 양쪽에 셀 사이의 직접 및 간접 통신에 대 한 허용. BMs의 두 가지 일반적인 예 혈관 BMs, pericytes 및 내 피 세포 사이의 microvascular 벽에서 발견 되며 내 피 및 상피 세포 사이 발견 되는 기도 BMs. BMs는 건강과 질병, 세포 극성 및 마이그레이션 등 세포 기능 조절에 중요 한 역할을 제공 합니다. 1 구성, 강성, 건축, 및 BMs의 다공성 고유한 생리 기능을 촉진 하기 위하여 기관 시스템 간에 다릅니다. 예를 들어 BM 모 셀 통신, 수용 성 분자 확산, 유지 하 고 감염 시 염증 또는 박테리아 면역 세포의 마이그레이션에 대 한 중요 하다. 항공에 모 공 0.75에서 3.86 µ m.2 까지 직경 BM의 전체 두께 걸쳐
BM의 얇은 자연 세포 유형 물리적으로 서로에서 분리 되어, 비록 세포 통신 신호 paracrine 및 연락처 중재를 통해 유지 되는 보장 합니다. 따라서, 생체 외에서, 인간 질병 연구에 연구원 문화 셀룰러 bilayers에 다공성 침투성 지원 삽입에 의존 했습니다. 3 이러한 모델 건강과 질병에 있는 역할 셀룰러 통신을 이해 하기 위한 중요 한 되었습니다. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 침투성 지원 삽입 어떻게 백혈구 신규 모집 및 세균 침투; 등의 생리 적 프로세스 조절-셀 신호를 이해 하기 위한 기본 요건을 충족 그러나, 삽입 중요 한 제한이 고 인간 BM. Permeable 지원 모방 하지 삽입 기계 및 생 화 확 적인 tunability 부족과 단순한 다공성 구조를 불규칙 한 숨 구멍을 만드는 섬유 구조를 모방 하지 않습니다 BMs의 전형. 따라서, 세포 프로세스를 영향을 미치는 기본 BM 속성을 다시 만들 수 있는 가변 시스템에 대 한 필요성이 있다.
폴리머 기반 기판 biomimetic 셀룰러 bilayers 맥락을 더 밀접 하 게 비보에 환경에서 공부 하는 BMs의 개발을 위한 이상적인 후보자 이다. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 중합체는 기계적으로 가변 및 화학적 통합 biomimetic 펩 티 드 파편. 을 수정할 수 있습니다. 11 , 12 , 13 bioinert 폴리머 폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) biomimetic BMs를 만드는 데 사용할 수 있습니다 및 최근 작품 자세한 기계적으로 가변 못 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD) 젤 세포 성장을 지 원하는 다공성 네트워크와의 합성 그리고 염증 성 세포 chemotaxis입니다. 14 못 기반 출판 침투성 지원 보다는 인간의 ECM의 보다 현실적인 모델을 제공 하는 기판, 이러한 모델의 대부분은 매우 셀 셀 bilayer 문화를 만들 수 있는 능력을 제한 하는 대략 775 µ m의 깊이와 두께 연락처입니다. 14
여기, 우리는 못 폴리머 기반 BM 모방 많은 현재 셀 bilayer 문화 기술의 한계를 극복 하는의 창조에 대 한 프로토콜을 제시. 고분자 합성 및 가교은 이후에 선택적으로에서 제거 하는 동안에 산화 아연, 미정 질 생산의 제조에 광범위 하 게 사용 된 자료를 통합 하는 템플릿 방법 개발 했습니다는 결과 대량 중합체입니다. 이 프로세스는 인간의 BMs의 꼬불꼬불한 고 상호 공 네트워크를 흉내 낸 임의의 다공성 네트워크를 생성 합니다. 또한,는 다공성 바늘 생산 동안 반응 산출할의 수정을 통해 산화 아연 microcrystals의 형태와 크기를 변경 하 여 변경할 수 있습니다. 여기에 개발 된 기술은 인간 BM.을 마지막으로, 역학, 다공성, 두께 모방한 ultrathin 히드로 만들고 이러한 BM 비슷한 구조의 생 화 확 적인 구성 쉽게 대부분은 microenvironment를 생성 하기 위해 변경 될 수 있습니다. 비슷한 그 본 vivo에서.
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Protocol
재료 안전 데이터 시트 (MSDS)는 이전 하는 모든 자료의 읽어 보시기 바랍니다 사용 하 고 모든 안전 예방 조치를 사용 하 여 시간.
1입니다. 산화 아연 바늘의 합성
- 0.04 M Zn (3)2의 250 mL 준비 * 물 250 mL에 아연 질 산의 2.9749 g을 추가 하 여 6 H2O 솔루션.
- 150ml의 물에 NaOH의 6 g을 추가 하 여 1 M NaOH의 150 mL를 준비 합니다.
- 핫 플레이트 활동가와 미네랄 오일 목욕을 설정 하 고 실 온에서 기름 목욕에 500 mL 둥근 바닥 플라스 크를 잠수함.
- Zn (3)2의 250 mL를 추가 * 6 H2O를 플라스 크 반응 교 반 시작.
- 150 mL (흰색 침전 짧게 형성 되며 다음 두 가지 솔루션을 혼합 계속 사라집니다) NaOH 솔루션을 추가 합니다. 2 h 발견에 대 한 저 어입니다.
- 55-60 ° C에 플라스 크를 열 고 24 h에 대 한 교 반 계속 합니다.
- 끄고 열을 교 반 하면서 실내 온도에 냉각 솔루션을 허용.
- 11 µ m 기 공 크기와 Büchner 퍼 널에 솔루션을 필터링 하 고 하룻밤, 발견 건조를 허용 합니다. 필터 종이 더 이상 부 솔루션에서 젖은 백색 분말 깔때기 구멍을 통해 형성 하는 때 입자 완전히 건조 됩니다.
- ZnO 바늘을 수집 하 고 바늘 같은 형태를 확인 하기 위해 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에 대 한 준비. 간단히, 핀 스텁에 탄소 테이프를 탑재 하 고 금속 주걱을 사용 하 여 탄소 테이프에 ZnO 바늘을 얼룩. 8mm 이리듐 22.4 g/c m3 의 밀도 코트 스퍼터 및 10에서 이미지를 수집 kV.
2. HCl에 대 한 현미경 슬라이드에 희생 아연 층의 추가 유도 못의 출시
- 메탄올의 200 mL에 아연 아세테이트의 1.756 g을 용 해 하 여 아연 아세테이트 솔루션을 준비 합니다.
- 70% 에탄올과 일회용 지우기 3 "x 1" 일반 현미경 슬라이드를 청소 합니다. 10 분 동안 건조 공기를 허용 합니다.
- 150 m m 유리 뜨거운 접시에 배양 접시를 놓고 150-160 ° c 예 열
- 아연 아세테이트, 슬라이드에 분산 된 박막 형성의 5 방울을 적용 하 여 족집게와 코트 슬라이드 유리 슬라이드를 잡고 유리 피펫으로 피펫으로 전구를 사용 하. 초과 솔루션 다시 재고 솔루션에 물방울을 허용 합니다.
- 아연 아세테이트 코팅 면이 미리가 열된 페 트리 접시 (150-160 ° C)에 슬라이드를 놓습니다. 15 분 열판에 남겨 주세요.
- 핀셋으로 슬라이드를 제거 하 고 실내 온도에 냉각 수 있습니다. 슬라이드 흰색 줄무늬와 코팅 표시 됩니다.
- 저명한 백색 줄무늬를 제거 하는 일회용 지우기를 사용 하 여 슬라이드에 남아 있는 과잉 아연을 제거 합니다. 표면 균일 해야 합니다.
- 노출에 UV 준비 슬라이드 무 균을 보장 하기 위해 적어도 1 시간을 위한 biosafety 두건에서 빛.
주의: 자외선 눈에 해 롭 다 고 피부를 노출. 눈 이나 피부에 직접 노출 하지 않도록 하 고 사용 하지 않을 때 전기 공급을 끄십시오.
3입니다. 실리콘 절연체의 준비
- 사각형 보다 작은 1 "x 1" 으로 컷된 실리콘 시트 (절연체 6-잘 접시에 맞게 수 있어야 함).
- 생 검 펀치와 함께 사각의 센터에 8-12 m m 구멍을 펀치.
- 20 분 동안 고압 실리콘 절연체 121.0 ° C와 1.12 kg/cm.
4. 말뚝 솔루션 및 젤 합성 말뚝의 준비
참고: 기능화 및 말뚝의 중 합 되어 광범위 하 게 탐구과 우리의 실험실과 다른 사람에 의해 이전 상세한. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17
- 보 건국 acryloyl-말뚝-50 m m 탄산 (pH 8.5) 아크릴 moiety, 이전 된 생 화 확 적인 반응으로 펩 티 드의 아민 말단의 기능화 수 있도록 1:1 어 금 니 비율에 RGD 셀 접착제 펩 티 드 결합 85% 이상의 효율을 얻을 수이 특징. 17
- 2, 2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone 1-비닐-2-pyrrolidone 300 mg/mL의 농도에서 혼합 하 여 사진 시작자를 준비 합니다.
- 1.5 mL 튜브를 별도에서 다음 밖으로 무게: ZnO 바늘의 20 mg, 못 다의 12.5 mg 및 말뚝 RGD의 2.5 mg.
- 10 %FBS / PBS 솔루션;의 270 µ L에서 ZnO 바늘의 20 mg을 일시 중단 혼합 하는 소용돌이 (약 15 s).
- 간단히 (< 1 s) 튜브 베이스에 어떤 ZnO 집계를가지고 벤치탑 미니 원심 분리기에서 솔루션을 회전.
- 집계는 튜브의 아래쪽에 유지 되도록 ZnO 솔루션의 상단에서 250 µ L를 수집 합니다. 와 못 다 못 RGD 솔루션을 만드는 못 약 2.5 m m RGD와 결합. 혼합 하는 소용돌이 (약 15 s).
- Acetophenone/n-비닐 pyrrolidone 사진-초기자와 혼합을 짧게 소용돌이의 2 µ L 추가 (약 5 s).
- ZnO 코팅 슬라이드의 중앙에 따라 폴리머 솔루션의 20 µ L를 추가 합니다.
- ZnO 코팅 얼굴 위에 두 번째 슬라이드를 천천히 낮은 다운 (페그 솔루션 두 ZnO 코팅 층 사이 있어야 함). 어떤 기포의 형성을 방지 하려고 합니다. 어떤 거품 탈출 하 고 얇은 층을 솔루션을 확산 수 있도록 주요 축을 따라 옆으로 슬라이드를 이동 합니다. 폴리머 솔루션 슬라이드의 대부분을 커버. 슬라이드 떨어져 나중 단계에서 끌어올 수 있도록 상단 슬라이드와 약간의 돌출을 만듭니다.
- Crosslink 365 nm UV 램프 (약 10 mW/cm2) 15 분 동안 아래 슬라이드.
5. 말뚝의 릴리스 유리 슬라이드에서 젤
- 돌출 된 슬라이드 및 수동으로 순서에 느린 속도로 떨어져 두 개의 슬라이드 슬라이드를 크래킹 방지 풀에 압력을 적용 됩니다. 적어도 5 분, 건조 또는 하룻밤 젤을 허용 합니다.
- 살 균 25 m m 유리 페 트리 접시에에서 슬라이드를 배치 하 고 부드럽게만 충분히 커버 슬라이드 (약 10-20 mL)을 사용 하 여 슬라이드에 1 M HCl 솔루션을 붓는 다. 부드럽게 바위 페 트리 접시; 젤은 HCl에 녹이 고 희생 적인 아연 코팅 및 바늘으로는 슬라이드 해제를 시작 한다. 일단 젤은 슬라이드에서 재고 솔루션으로 다시 HCl를 붓는 다.
- 슬라이드와 젤 빠져들 때까지 부드럽게 페 트리 접시에 1 x PBS의 약 25 mL를 붓는 의해 젤 린스.
6. 시드 셀 Bilayers
- 시드의 A549 세포를 준비 합니다. 간단히, 1 x PBS의 5 mL와 75 c m2 플라스 크를 씻어, 0.25%의 3 개 mL를 추가 트립 신-EDTA와 37 ° c.에 2-3 분 동안 앉아 보자
- 기계적으로 플라스 크를 선동, 끄다 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스와 3 mL Dulbecco의 수정이 글 매체 반응 고 15 mL 원뿔 플라스 크에 수집 합니다. 완전 한 Dulbecco의 수정이 글 미디어의 추가 4 mL와 린스와 동일한 원추형으로 수집. 475 x g 6 분에 세포를 스핀.
- 셀 아래로 회전 하는 동안 6 잘 플레이트의 각 음에 완전 한 Dulbecco의 수정이 글 중간의 작은 방울을 추가 합니다. 새로운 6 잘 플레이트에는 젤과 실리콘 절연체를 전송 족집게를 사용 하 여 젤 미디어 방울에 휴식 하는. 이제는 젤 얇은 층으로 확산은, 눈에 보이는 큰 구멍을 확인 합니다. 이 셀 건조와 젤의 크래킹을 피하기 위해 시드 전에 즉시 행해져야 한다.
- 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 1% 페니실린-스 6 x 105 셀/mL의 농도에서 Dulbecco의 수정이 글 중간에 셀 resuspend 추가 셀 서 스 펜 션 드롭 젤, 실리콘 막의 밖으로 구멍을 뚫은 영역에서 초승달 모양 유지 하의 중심에는 것이 현명 합니다. 4 h에 대 한 준수를 셀 수 있습니다.
- 4 h 후 잘 Dulbecco의 수정이 글 완전 한 매체의 0.5 mL을 추가 하 고 완전 한 접착을 위해 수 있도록 37 ° C에서 밤새 품 어.
- 다음 날, 셀 시드를 위한 HUVECs를 준비 합니다.
- 1 X PBS의 5 mL와 75 c m2 플라스 크를 씻어, 0.25%의 3 개 mL를 추가 트립 신-EDTA와 37 ° c.에 2-3 분 동안 앉아 보자
- 기계적으로 플라스 크를 선동, 담금질 3 mL 20% 태아 둔감 한 혈 청, 1% 페니실린-스와 1% 성장 보충 M199 미디어와 함께 반응 고 15 mL 원뿔로 수집 합니다.
- M199 완전 한 미디어의 4 mL와 린스와 동일한 원추형으로 수집. 475 x g 6 분에 세포를 스핀.
- 셀 아래로 회전 하는 동안 각 잘 새 6 잘 플레이트에에 완전 한 매체 199의 작은 방울을 추가 합니다. 실리콘의 센터에 있는 미디어의 드롭 잘에서 새로운 실리콘 아이 솔 레이 터를 놓습니다.
- 핀셋을 사용 하 여 신중 하 게 새로운 6 잘 플레이트에 못 젤은 아이 솔 레이 터에 A549 세포를 지 원하는 실리콘 아이 솔 레이 터를 플립.
- 6 x 105 셀/mL의 농도에서 HUVECs를 resuspend 하 고 현명 하 고, 실리콘 막의 밖으로 구멍을 뚫은 영역 내에서 젤에 초승달 모양 유지 하려고 뒤집힌된 젤 드롭의 중심에 세포 현 탁 액을 추가 합니다. 2 시간에 대 한 준수를 셀 수 있습니다.
- 2 시간 후 부드럽게 각 우물에 M199 완전 한 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다.
7입니다. 면역 형광 검사
- 조심 스럽게 수동 피 펫과 젤에서 미디어를 제거 하 고 셀 시드는 젤의 센터에 4 %paraformaldehyde (PFA)의 약 500 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 30 분 동안 앉아 보자.
주의: PFA는 독성 화학; 보호를 착용 하 고 처리는 생물 안전 캐비닛에서 수행 합니다. - 조심 스럽게 제거는 PFA 고 각 젤을 PBS에 2 %BSA 대략 500 µ L를 추가 합니다. 실 온에서 1 h 동안 앉아 보자.
- BSA는 조심 스럽게 제거 합니다. PBS에 2 %BSA 1: 100 희석에서 1 차 항 체를 준비 하 고 각 젤을 500 µ L를 추가. 실 온에서 1 h 동안 앉아 보자. 1 x PBS의 500 µ L 부드럽게 린스 합니다.
- 2 차 항 체와 동일한 프로세스를 반복 합니다. 항 체에 따라 사용: 1) 반대로 인간 CD144 (VE-Cadherin) 클론 16B1; 2) 안티 인간 CD324 (E-Cadherin) 클론 6714; 3) 안티 인간 CD31 (PECAM-1) 복제 C-20; 4) 안티-A549; 5) 반대로 마우스 FITC; 6) 알 렉 사 Fluor 647 항 염소입니다. F-말라를 시각화 하려면 500 µ L Phalloidin의 추가 (PBS에 10 µ g/mL) 20 분.
- 조심 스럽게 2 차 항 체 또는 phalloidin를 제거 하 고 500 µ L DAPI의 추가 (0.1 µ g/mL) 20 분에 대 한 신중 하 게 DAPI 솔루션을 제거 하 고 부드럽게 1 x PBS의 1.5 mL를 추가 각 잘 젤에에서는.
- 족집게와 실리콘 절연체를 사용 하 여, 유리 슬라이드에 한 젤을 전송 합니다. 이미징, 직전 각 젤에 대 한이 작업을 수행 하 고 영상 후 PBS 솔루션으로 젤을 바꿉니다.
- 또는 젤 DAPI 설치 매체를 사용 하 여 탑재 합니다. 잘 매니큐어와 샘플 인감, 건조 하 고 젤의 균열을 방지 하기 위해 2 일 이내에 이미지를 수집. 문제 해결 표 1을 참조 하십시오.
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Representative Results
못 RGD hydrogels 사이 2 개의 희생 아연 산화물 층 사이 폴리머 솔루션 및 산화 아연 바늘 기 공 템플릿 만들기 형성 되었다. 희생 아연 산화물 구성 요소는 염 산, 지속적인 모 (그림 1)와 ultrathin 못 hydrogels 생성 다음 제거 되었습니다. 산화 아연 바늘의 형태는 전자 현미경 (SEM), 검색 하 여 확인 되었다 고 평균 길이 너비 각각 3.92 ± 0.089 µ m 및 0.43 ± 0.02 µ m, 되도록 결정 되었다 (그림 2A-2B). 산화 아연 바늘의 제거에 따라 하이드로 겔 모 공 SEM으로 시각화 했다 하 고 (그림 2C-2E) 특징. 평균 기 공 밀도 hydrogels 176,863 ± 49,532 숨 구멍 이었다. SEM은 시각화 하 고 표준 3 µ m 기 공 폴 리 카보 네이트 침투성 지원 삽입의 기 공 밀도 계산 및 기 공 밀도 평방 m (그림 2D, m 당 약 2.51 ± 0.05 모와 크게 낮은 것으로 판명 되었습니다. 표 2)입니다. 아연 산화물은 템플릿 못 히드로 0.19 ± 0.01 µ m, 고 투과성 지원 삽입 (그림 2E, 표 2)에서 관찰 3.47 0.21 ± µ m 모 공 보다 크게 작은에서 평균 기 공 직경. 광학 일관성 단층 촬영 두 2 및 3 차원 이미지와 hydrogels 1 x PBS (그림 3A-3B)에서 부동의 두께 결정 하기 위해 사용 되었다. 평균 젤 두께 18.89 ± 3.47 µ m (표 2) 이었다. 젤 역학 또한 앞에서 설명한, 탄성 계수를 측정 하 여 평가 했다 그리고 평균 탄성 계수 96.78 ± 23.92 kPa (표 2) 발견 되었다. 14
면역 형광 검사 현미경 검사 법 내 피 세포 및 상피 세포 ultrathin 못 RGD hydrogels에 경작 되 고 이후 그들의 phenotypic 정체성 유지 하는 방법을 보여 줍니다. 내 피 세포 유지 안티 A549 항 체 (그림 4A-4B)와 긍정적으로 얼룩이 진 PECAM-1, 그리고 상피 세포의 표현. 두 셀 형식 또한 꽉 접합을 형성 하는 기능을 유지. 내 피 세포-셀 접합에서 VE cadherin 표현 되 고 상피 세포 표현 E-cadherin (그림 4C-4 D). 또한 말뚝 RGD hydrogels 셀룰러 bilayers 지원과 양식 샘플 (그림 4E) 스테인드 phalloidin의 immunofluorescent 영상에 의해 검증 된 다공성 구조 내에 셀 연락처에 대 한 허용.
그림 1 . 하이드로 겔 준비 프로토콜의 개요 개요입니다. A) 합성 및 ZnO 바늘의 컬렉션. B) 유리 슬라이드;의 준비 희생 ZnO 층의 창조입니다. C) 준비 및 실리콘 절연체의 살 균. D) 말뚝 준비 솔루션 ZnO 바늘. E) ZnO 코팅 유리 슬라이드 사이 젤 말뚝의 합. 화이트 라인 희생 ZnO 바늘 및 코팅을 나타냅니다. F) 바늘의 제거 및 슬라이드에서 젤의 릴리스 HCl 린스. 어두운 줄 모를 녹은 ZnO 바늘에 의해 만들어진 나타냅니다. G) 전송을 젤 및 실리콘 절연체의 6-잘 접시 셀 시드를 위한 준비. H) 셀 시드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 바늘 특성화 및 히드로 다공성 아연. A) 아연 바늘 (눈금 막대 5 µ m)의 SEM 이미지. B) 의 길이 그리고 폭 아연 바늘. 점 대표 개별 바늘;에 대 한 측정 선은 평균 및 표준 오류를 나타냅니다. C) 다공성 하이드로 겔 (눈금 막대 2 미크론)의 SEM 이미지. D) 기 공 밀도 E) 폴 리 카보 네이트 침투성 지원 및 말뚝 hydrogels 평균 기 공 직경. 바 평균 및 표준 오류를 나타냅니다. p < 0.0001 T-검정을 통해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 하이드로 겔 두께입니다. 광학 일관성의 Tomography 보여 줍니다 A) 3 차원 및 B) hydrogels PBS에 부동의 2 차원 이미지. 화살표 나타냅니다 액체 표면, 별표 나타냅니다 하이드로 겔. 눈금 막대는 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . Hydrogels 지원 단층 및 Bilayer 문화. 둘 다 내 피 세포 및 상피 세포 못 hydrogels에 confluent monolayers 형성 수 있다 형광 염색에 의해 증명으로 A) CD31 (CD31 빨간색, DAPI 블루)와 B) A549 (A549 레드, 블루 DAPI), 각각. 그대로 cadherin 접합부의 형성에 대 한 시연 C) 내 피 세포 (VE cadherin 녹색, 파란색 DAPI)와 D) (스케일 바 100 미크론) 상피 세포 (E cadherin 녹색, 파란색 DAPI). E) bilayers 세포의 두 가지 예 phalloidin (phalloidin 빨간색, 파란색 DAPI) 얼룩 (규모 바 10 µ m)에 의해 증명 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 문제 | 잠재적인 솔루션 |
| 젤 큰 구멍이 있다. | 아연 바늘 그들을 사용 하기 전에 충분히 세분화 되어 있는지 확인 합니다. |
표 1입니다. 문제 해결을 위한 솔루션을 제안 했다.
| 하이드로 겔 | Transwell | 세포 외 기질 | |
| 기 공 밀도 (모 공/m m2) | 105 ± 4.9 x 104 x 1.77 | 2.51 ± 0.05 | 8.50 x 102 7.0 x 104 2,14 |
| 기 공 직경 (µ m) | 0.19 ± 0.01 | 3.47 ± 0.21 | 0.47 3.86 2,14 |
| 두께 (µ m) | 18.89 ± 3.47 | 10 | 0.05 0.10 17 |
| 영의 계수 (kPa) 5 | 96.78 ± 23.92 | > 1000 | 3.5 14 |
표 2입니다. 하이드로 겔 속성 표준 침투성 지원 삽입 및 기질을의 비교 (값 의미를 나타내는 ± 표준 오차)
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Discussion
여기서 설명 하는 프로토콜을 가변 PEG 하이드로 겔 biomimetic BM 비 계 역할을 만들 수 있다. 특히, 다양 한 PEG 분자 무게 펩 티 드 활용 전략, 그리고 산화 아연 미정 질 구조 또는 농도, 탄성 계수, 생 화 확 적인 속성과 hydrogels의 다공성 구조 수정할 수 있습니다, 각각. Ultrathin 못 비 계는 높은 기 공 밀도 더 많은 기능을 vivo에서 지 세포 막 투과성 지원 모델 (표 2)에 비해 발견의 모방은 작은 기 공 직경을 갖추고 있습니다. 또한,이 방법을 통해 우리 20 µ m의 평균 두께 ultrathin 구조를 달성 했다. 폴 리 카보 네이트 침투성 지원 모델 이미 우리의 지식, 10 µ m의 ultrathin 레이어를 달성 하는 동안 이것은이 두께 달성 하기 위해 첫 번째 부동성 및 가변 하이드로 겔 시스템. 마지막으로, 페그 hydrogels 이다 크기 순서 보다 적게 전통적인 침투성 지원, 조직 문화, 플라스틱과 유리, 모든 평점 범위에서에서 탄성 계수는 그리고 그러므로 더 보다 뻣 뻣 한 대략 100 kPa의 탄성 계수는 낮은 비교 (< 10 kPa) vivo에서 세포 외 매트릭스 (표 2)의 탄성 계수.
낮은 탄성 계수를 달성 여기, 작품의 주요 목표 중 하나 이며 전통적인 폴 리 카보 네이트의 사용에 한계가 침투성 지원 모델. 그것은 잘 알려진 기판 강성 셀 동작을 지시할 수 및 작업 기판 강성 분화 세포의 세포 운명 가이드 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 12 뻣 뻣 한 기판은 또한 일반적으로 질병 상태, 거리 조직이 나 암 종양을 포함 하 여 모방 하는 데 사용 됩니다 및 따라서 없습니다 정확 하 게 건강 한 조직의 대표. 18 , 19 , 20 , 21 위해서는 무부하 셀룰러 고기 및 기능 연구, 그것은 관련 vivo에서탄성 계수를 모방 하는 기질을 사용 하 여 중요 한. 이 시스템의 주요 장점 중 하나는 다른 분자 무게와 말뚝을 사용 하 여 달성 될 수 있는 젤의 메커니즘을 조정 하는 기능입니다. 많은 질병은 ECM 스티프닝와 관련,이 시스템에는 세포 기능에 병 BM 대 건강의 효과 공부 biomimetic 플랫폼을 제공 합니다. 이 시스템의 추가 수정 또한 펩 티 드 조각이 세포 접착에 대 한 포함을 변경 하 여 얻을 수 있습니다. 이 연구의 목적을 위해 RGD 회사 셀 첨부 파일을 촉진 하기 위하여 많은 BM 단백질 및 그것의 기능에서 그 유비 쿼터 스 식으로 사용 되었다. RGD, 뿐만 아니라 laminin 조각 또한 꼭대기 기저 셀 분극 가이드 laminin 상피 상호 작용 촉진을 통합할 수 있습니다. 1 질병에 BM 강성 변경 처럼 지하실 멤브레인의 구성은 리 모델링 병 적인 조건에서. 아민 반응 못 보 건국 전조를 사용 하 여 다양 한 펩 티 드 및 단백질 못 고분자 기지에 단백 결합 가능 하다. 11 , 14 , 15 이 integrin 참여 다른 integrin 수용 체에 대 한 효과 조사를 위해 특히 유리 하다. 예를 들어 RGD 시퀀스 fibronectin과 콜라겐에 표현 되는 여러 integrins 종사 하지만 integrin αvβ3에 대 한 높은 특이성을가지고. 신 aspartic 산 valine (LDV) 시퀀스 통합 될 수을 특별히 모방 fibronectin 풍부한 기판, 종사 하는 α4β1, 또는 collagenous 멤브레인을 모방, aspartic 산 글리신 글루타민 산-알라닌 (DGEA) integrin 교전에 추가 될 수 Α2Β1입니다. 8
상피 내 피 bilayers는 여기에 제시 하는 모델을 만들 수 있는 셀룰러 bilayer의 한 예입니다. 자연스럽 게 비보에, 얇은 BM 또는 ECM, 구분 존재 하는 다른 bilayers pericyte 내 피와 내 피 부드러운 근육 세포 bilayers 포함 됩니다. 따라서,이 방법에 대 한 응용 프로그램은 광범위 하 고 혈관 생물학 폐 의학에서 확장. 또한, 이러한 hydrogels의 독특한 다공성, 때문에 그들은 이전 히드로 모델 지원 되지 않은 기능 연구를 기능을 제공 합니다. Ultrathin 하이드로 겔 시스템에 숨 구멍을 통합 하 여 우리가 만든 침투성 지원 모델에 대 한 향상 된 생체 모방 교체는 폐에서 흔한 세균성 침투의 조사 활성화 결핵에 상피 내 피 장벽 했다입니다. 3 , 6 , 14 , 22 마찬가지로, 환생 또는 혈관 세포 배양에서 염증 세포의 chemotaxis 수 조사 이전 표시 되었습니다로 젤의 RGD 기능성된 세포 접착 표면에 셀 캡처의 속도 측정 하 여. 16 이것은 캡슐화를 통해 공동 문화 조건 달성 이전 히드로 기반 방법에 비해 뚜렷한 이점을 이다. 이러한 시스템 근접을 허용 하 고-셀 두 셀 형식 간의 연락 및 신생 vasculogenesis, 등의 기능을 측정 하는 데 성공 하지만 액세스를 많이 제공 하는 2 차원 시스템에서 제공 부족 공동 경작된 세포 장벽을 가로질러 누출, 침투, 또는 활성 마이그레이션을 측정 하기 위한 간단한 플랫폼. 17
따라서, 여기 설명 하는 방법을 여러 분야에 걸쳐 다양 한 연구에 대 한 플랫폼을 제공 하며 더욱 vivo에서 병 리를 이해 하 에 체 외 연구에서 더 많은 관련 데이터 생성으로 디딤돌 그리고 기계 장치입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 그들의 사려깊은 대화 및 재료 과학 전문 교수 폴 반 술과 교수 Chinedum Osuji 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에 대 한 자금 Dubinsky 새로운 이니셔티브 상 EB16629-01A1 건강 NIBIB BRPR01의 국가 학회에 의해 제공 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1M Hydrogel Chloride (HCl) | EMD | HX0603-75 2.5L | Sterile. Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| 1X PBS | Gibco | 14040-133 500 mL | None |
| Zinc Nitrate Hexahydrate (Zn(NO3)2•6H2O) | Sigma-Aldrich | 228737-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Macron Chemicals | 278408-500g | Use with eye protection and gloves. |
| Zinc Acetate Dihydrate ((CH3O2)2Zn2+•2H2O) | Fisher Scientific | AC45180010 1 kg | Use with eye protection and gloves. |
| Methanol (CH3OH) | J.T. Baker | 9070-05 4L | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS | VWR | 97068-085 | Sterile filter. 5 mL FBS in 45 mL PBS |
| Mineral oil | CVS | PLD-B280B | None |
| Round bottom flask | ChemGlass | N/A | |
| Thermometer | N/A | ||
| Stir bar | N/A | ||
| Plain precleaned microscope slides 3"x1"x1" mm thick | Thermo Scientific | 420-004T | Spray with ethanol and let dry prior to use. |
| Glass pasteur pipets | N/A | ||
| 1 mL rubber bulbs | N/A | ||
| Plastic 100 mm petri dishes | N/A | ||
| Sterile forceps | N/A | ||
| Silicone isolators | 0.8 mm thick | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) punches | N/A | ||
| Glass bottles | N/A | ||
| 6 well plates | Cellstar | 657 160 | N/A |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Stirrer-hot plate | VWR Dya-Dual | 12620-970 | Use with eye protection and gloves. |
| 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenone (C6H5COC(OCH3)2C6H5 | Sigma-Aldrich | 24650-42-8 | Use with eye protection and gloves. |
| 1-Vinyl-2-pyrrolidone (C6H9NO) | Aldrich | Use with eye protection and gloves. | |
| Polyethylene Glycol 10,000 (H(OCH2CH2)10,000OH) | Fluka | 81280-1kg | Use with eye protection and gloves. |
| RGDS | Life Tein | 180190 | Use with eye protection and gloves. |
| Blak-Ray long wave UV lamp | UVP | Model B 100AP | N/A |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | N/A |
References
- Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. Functional diversity of laminins. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).
- Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells. Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).
- Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment. FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).
- Mul, F. P., et al. Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells. J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Lab Invest. 84, 736-752 (2004).
- Birkness, K. A., et al. An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun. 67, 653-658 (1999).
- Wang, L., et al. Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions. PLoS One. 8, 55311 (2013).
- Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).
- Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells. Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).
- West, J. L. Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments. Nat Mater. 10, 727-729 (2011).
- DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J Control Release. 109, 139-148 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Taite, L. J., et al. Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies. Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).
- Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis. Technology. 02, 133-143 (2014).
- DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration. Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).
- Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers. PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).
- Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells. Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).
- Schwartz, M. P., et al. A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration. Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).
- Kalluri, R. Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).
- Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior. Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).
- Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells. Infect Immun. 70, 140-146 (2002).
