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Neuroscience

혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화

Published: November 16, 2017 doi: 10.3791/56407

Summary

여기 선물이 고해상도 이미징 및 마우스의 3 차원 재구성에 대 한 현미경 기반 프로토콜 neurovascular 단위와 혈액-뇌 장벽 뇌 부동성 섹션을 사용 하 여. 이 메서드는 시각화, 분석 및 BBB에서 세포내 세포의 정량화에 대 한 수 있습니다.

Abstract

혈액-뇌 장벽 (BBB) 순환과 두뇌 사이 분자의 수송을 조절 하는 동적 다세포 인터페이스입니다. BBB 걸쳐 Transcytosis 뇌 실질에 호르몬, 대사, 그리고 치료 항 체의 납품을 통제 한다. 여기, 선물이 레이저 스캐닝 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 분석 시각화 subcellular 세포 BBB에서 내 피 세포 내에서 면역 형광 검사 무료-부동 섹션의 결합 하는 프로토콜. 이 데이터 집합을 결합 하 여 3D 이미지 분석 소프트웨어와 함께 반자동된 세분화 및 모 세관 볼륨의 정량화 표면 영역으로 개수와 BBB에서 세포내 세포의 강도 대 한 수 있습니다. 세포내 소포 및 그들의 정량화는 BBB에서 내 마우스 생 면역 글로불린 (IgG)의 검출 방법을 설명 하는 데 사용 됩니다. 이 프로토콜은 잠재적으로 다른 분자 비보의 BBB transcytosis를 제어 하는 메커니즘의 수사에 적용할 수 있습니다.

Introduction

혈액-뇌 장벽 (BBB) 연속 세포 장벽입니다 이다, pericytes, 신경 세포, 내 피 세포에 의해 형성 된 혈액 순환1에서 중앙 신경 조직 (CNS)를 분리 하는. BBB에 걸쳐 교통 규제 뇌 항상성 유지에 중요 한 역할을 담당 하 고 뇌 내 피 세포 (BECs)의 특수 속성에 의해 중재. BECs transcytosis의 낮은 기초 율 사이 꽉 세포 접합의 존재의 혈액을 매개로 분자, 각각2paracellular 및 transcellular 전송을 제한 합니다. 최근, transcytosis 통로 BECs에 뇌3,4치료 큰 분자의 납품을 강화 밝혀 되었습니다 있다. 그러나, BBB에 걸쳐 transcytosis 메커니즘 아직 되지 않은 완전히 특징이5,6.

광범위 한 작업에서 체 외에서 세포 및 분자 메커니즘 BECs7,,89,10, 를 통해 세포내 전송 규제를 해독 완료 되었습니다 11, 하지만 이러한 시스템 복잡 한 건축과 혈관 단위 (NVU)의 생리학 정리 하지. 다른 한편으로, 학문 vivo에서12,13 BBB에서 전송 속도에 상세한 양적 정보를 제공 하지만 전송의 세포내 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하지 않습니다. 따라서,는 NVU의 세포와 세포내 구성 요소 조사 vivo에서 ex vivo 남아 있다 매우 도전적인14. 기술의 제한 된 수만 세포는 NVU의 subcellular 구조를 분석 하는 의무가 있습니다. 대부분의 연구는 전자 현미경 검사 법을 사용 하지만이 기술은 적절 한 조직 준비 및 샘플 처리에 필요한 복잡 한 프로토콜에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리는 뇌 샘플의 처리, 분석, 그리고는 NVU의 세포 내 subcellular 구획의 정량화를 촉진 것이 높은 해상도 confocal 현미경 기반 방법론 설립.

여기, 우리는 BBB와 세포 및 subcellular 수준의 NVU의 양적 이미징 수행을 마우스 뇌 부동성 섹션을 이용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 테스트 하 고 이미지와 3 차원에서 NVU 재구성에 항 체의 수를 확인. 또한,이 프로토콜 뇌 모세 혈관 내에서 세포의 최대 광학 회절 제한 된 해상도 이미지를 수 있습니다. 이미지 분석, 함께 neurodegeneration의 마우스 질병 모델에 예를 들어 다른 실험 조건 하에서 BBB에서 고분자의 세포내 수송을 조사 하기 위해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

Protocol

이 연구에 대 한 윤리적인 승인을 연방 식품 안전 및 스위스의 수의 사무실에 의해 제공 되었다. 모든 동물 실험 엄격한 준수 평가 및 인증의 실험실 동물 케어 인터내셔널 (AAALAC)에 대 한 협회의 규칙에 따라 뿐만 아니라 동물 보호 및 복지에 스위스 연방 조 례에서에서 실시 되었다.

1. 세대의 두뇌 Free-floating 섹션

  1. 최적의 샘플 품질을 보장 하기 위해, 2 %paraformaldehyde (PFA)의 신선한 솔루션에서에서 준비 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)는 관류의 날.
    주의: PFA 적당히 피부 접촉 및 가능한 발암 물질에 의해 독성이 있다. 니트 릴 글러브를 사용 하 여 처리 PFA 화학 증기 두건에서 솔루션을 준비 하.
    1. 60 mL 동물 당 PFA 솔루션의 준비.
    2. 가져와 PFA 180-200 µ L의 PBS의 모든 100 ml 5 M 코 솔루션으로 pH를 증가 하 고 60까지 솔루션을가 열 하 여 솔루션에 ° c.
      참고: NaOH 사용 하지 않아야 고정 시 조직 보존에 부정적인 영향을 그것으로.
    3. 솔루션 식 실내 온도 내려와 pH 7.4 HCl. 여과기를 사용 하 여 아래로 필터 종이 사용 하 여 솔루션 (재료의 표 참조).
  2. 일부 수정 앞에서 설명한 15 transcardial 관류를 통해 전체 마우스 고정을 수행. 먼저, 맥 관 구조 사용 하 여 PBS의 20 mL에서에서 혈액을 플러시 후 2%의 40 mL와 함께 perfuse PFA.
  3. 앞에서 설명한 15 두개골에서 뇌 제거.
  4. 담가 갓 2 %PFA 끼얹는다 뇌에 2%의 20 mL PFA 후 고정을 위한 4 ° C에서 7 h.
    참고: PFA에 외피를 증가 권장 하지 않습니다 그것은 세포내 구조의 검색을 방지할 수 있습니다.
  5. 광범위 하 게 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 두뇌 세척.
  6. Agarose에서 머리를 고정 하는 소스. 난방을 위한 전자 레인지를 사용 하 여 PBS에
    1. 준비 3 %agarose 솔루션. 부드럽게 아래로 냉각 응고를 방지 하는 솔루션을 소용돌이.
    2. 플라스틱 용기에서 agarose 솔루션에 집중 하기 전에 뇌 주위 PBS의 과잉에서 건조. 공기 방울을 제거 하려면 agarose 안에 두뇌를 회전 합니다. 얼음에 그것을 냉각 하 여 응고 agarose 허용
    3. 신중 하 게 플라스틱 용기에서 agarose 블록을 제거 하 고 면도날을 사용 하 여 뇌 주위 큐브를 잘라. Vibratome 견본 홀더에 두뇌를 탑재 (재료의 표 참조) cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 (재료의 표 참조). 단면으로 진행 하기 전에 응고 접착제에 대 한 충분 한 시간.
  7. PBS 가진 vibratome 버퍼 트레이 견본 홀더 뇌 가득 전송. vibratome를 사용 하 여 100 µ m 뇌 조각 (화살 또는 코로나) 섹션. 이전 PBS 가득 6 잘 플레이트에 뇌 섹션을 수집.
  8. 마무리 뇌 단면에 따라 신중 하 게 PBS를 제거 하 고 PBS/글리세롤의 1:1 솔루션으로 대체.
  9. 저장 섹션 PBS/글리세롤에-20 ° c.

2. 셀 또는 세포 기관이 면역 형광 염색 법에 의해 라벨

  1. 신중 하 게 전송 뇌 섹션 24-잘 접시의 우물에 이전 가득 잘 당 PBS의 500 µ L. 섹션 같은 우물에서 절차의 끝에 때까지 유지 됩니다.
  2. 부드러운 동요에서 5 분에 대 한 PBS의 500 µ L로 두 번 섹션 린스.
  3. PBS를 제거 하 고 동시 차단 및 뇌 조각의 permeabilization. PBS에서
    1. 준비 0.3% 차단과 permeabilization 솔루션 트리톤 X 및 10% 당나귀 세럼.
      참고: 당나귀 혈 청 사용 특정 이차 항 체의 호스트 종에 맞게 염소 혈 청으로 대체 될 수 있다.
    2. 부드러운 동요에서 실 온에서 1 h에 대 한 차단 및 permeabilization 솔루션의 250 µ L 섹션을 품 어.
  4. 솔루션을 제거 하 고 추가 5% 당나귀 혈 청 및 (예를 들어, 1:1, 000에 1: 100)는 적합 한 희석에서 1 차적인 항 체를 포함 하는 PBS 솔루션. 부드러운 동요에서 4 ° C에서 밤새 품 어.
    참고: 성공적으로이 프로토콜 NVU의 다른 세포 유형을 분류 하는 항 체의 목록에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오. 1 차 항 체의 최적의 희석은 실험적으로 결정 되어야 합니다. 다른 항 원의 동시 라벨에 대 한 동일한 솔루션에 있는 모든 기본 항 체 희석. 모든 1 차 항 체는 다른 종에서 발생 되어야 합니다. 항 체 침투를 개선 하기 위해, 샘플 수 있습니다 알을 품을 72 h에 대 한 4 ° c.
  5. 제거 항 체 솔루션 및 세척 섹션 실 온에서 부드러운 동요에서 PBS에 10 분 동안 3 번. PBS를 제거 하 고 250 µ L PBS 솔루션 포함 5% 당나귀 혈 청 및 적절 한 종의 붙일 이라는 2 차 항 체를 추가. 섹션 부드러운 동요에서 1 시간에 대 한 실 온에서 품 어.
    1. 이 프로토콜을 사용 하는 2 차 항 체의 목록에 대 한 테이블의 자료를 참조 하십시오.
  6. 실 온에서 부드러운 동요에서 PBS에 세 번 10 분 대 한 항 체 솔루션 및 세척 섹션 제거.
  7. PBS를 제거 하 고 4의 250 µ L를 추가 ', 1 µ g/mL의 최종 농도 가진 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 솔루션. 부드러운 동요에서 10 분 동안 실내 온도에 섹션을 품 어. PBS 가진 5 분 동안 3 번 DAPI 솔루션 및 세척 섹션 제거.
  8. 현미경 슬라이드 (예를 들어, 조직-본드 유리 슬라이드) 본딩에 뇌 섹션을 탑재 합니다. 조심 스럽게 초과 PBS 슬라이드에 섹션 주위 제거. 설치 매체의 한 방울을 추가 (재료의 표 참조) 신중 하 게 뇌 섹션의 상단에 커버 0.17 mm (제 1.5) 붕 규 산 유리 coverslip.
    1. 샘플 이미지 수집 수행까지 빛에서 보호 하는 4 ° C에서 저장.

3. 혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 이미징

  1. 레이저 스캔 적합 한 수행 이미지 수집 confocal 현미경 (재료의 표 참조) 레이저 라인 405, 488, 561와 633 nm의 여기에 대 한 빛의 스펙트럼의, 녹색, 오렌지, 파란색과 빨간색 영역에 fluorophores. 1.4의 조리개 수치와 이미지 수집, 사용 기름 목표 X 63.
  2. 인수에는 현미경을 제어 하는 소프트웨어의 메뉴 이미지 수집 매개 변수를 설정. 드롭 다운 메뉴에서 ‘ 이미지 크기 ’, 1024 x 1024 픽셀의 값을 선택 합니다. 수정 픽셀 크기의 값을 조정 하 여 200, 300 nm 사이의 값으로는 ‘ 줌 ’ 메뉴. ”
    참고: 세포내 구조 분석에 대 한 75 픽셀 크기를 줄일 수 nm. 이 이미지 크기 설정을 대폭 획득 시간을 증가 하 고 512 x 512 픽셀 작은 시야를 영상 획득 시간 감소를 줄일 수 있다.
  3. 에는 ' 수집 속도 ' 400 Hz의 값 즉, 400 초당 라인 선택 드롭-다운 메뉴. 에 ' 시스템 설정 & #39; 선택 메뉴는 ' 픽셀 깊이 ' 드롭 다운 메뉴, 그리고 12 비트에 값을 변경.
  4. 현미경 소프트웨어에서 내는 ' 인수 ' 탭, 순차적 프레임 인수에 대 한 옵션에 토글. 값을 수정 하 여 광학 섹션 두께 0.75와 각 채널에 대해 1 µ m 사이의 값으로 설정 된 ' 홀 ' 메뉴.
  5. 형광 여기 패널에서 최적의 샘플 예 488 nm 레이저 라인 녹색 발광 fluorophore fluorophores 흥분 하 필요한 레이저 활성화.
    참고: fluorophore 스펙트럼 뷰어 사용 하 여 (테이블의 자료 참조) 여기 적절 한 레이저를 선택 하.
  6. 510 및 550 nm 녹색 발광 fluorophore 대 사이의 예 각 채널에 측정 될 것 이다 파장 선택 슬라이더를 이동 하는 형광 검출에 대 한 패널에.
    참고: fluorophore 스펙트럼 뷰어 사용 하 여 (재료의 표 참조) 적절 한 검출 파장 선택.
  7. 는 굴절률 유리 coverslip와 목표에 맞게 두뇌 섹션 coverslip 위에 1.52의 굴절률을 가진 침수 오일 한 방울을 추가 합니다. 샘플 현미경에 놓고 현미경 쌍안경을 사용 하 여 샘플을 시각화 하기 위해 epifluorescent 램프를 켭니다.
  8. 현미경 스탠드에 버튼을 사용 하 여 변경 필터 휠을 DAPI 스테인드 핵을 시각화에 대 한 적절 한 필터를 선택 합니다. 조 악한 초점을 사용 하 여 초점으로 DAPI 스테인드 핵에서 신호 하기.
  9. 혈관 마커 (예: CollagenIV 또는 CD31)에서 신호를 시각화 하 고 개별 모 세관 세그먼트에 보기의 필드 센터 필터 변경 단추를 사용 하 여 현미경 스탠드에.
  10. 라이브 스캔 모드를 시작 하려면 버튼을 누릅니다. 스캔 하는 동안 이미지의 동적 범위를 극대화 하 고 픽셀 채도 피하기 위해 각 채널에 대 한 이득 및 레이저 강도 조정.
    참고: 레이블 포화 픽셀-채도 시각적으로 평가 하는 조회 테이블을 사용 합니다. 신호-채도 방지 하려면 높은 형광 신호를 것으로 예상 되는 샘플 설정을 조정.
  11. 설정 2 평균 라인에 대 한 값.
    참고: 높은 수집 속도 사용할 때 소음을 줄이기 위해이 값을 늘립니다.
  12. 구축 시작 하 고 모 세관의 전체 볼륨에 걸쳐 있는 광 z 스택 수행에 대 한 섹션을 종료. 0.45 μ m의 단계 크기를 사용 하 여.
    참고: 이미지 후속 정량화에 사용 될 경우 완전 한 데이터 집합에 대 한 동일한 수집 설정을 유지.
  13. 정량화에 대 한 통계적 비교에 대 한 적어도 3 개의 다른 마우스에서 섹션 당 10 ~ 20 z-스택 확보.
    참고: 샘플 표백 및 레이저 강도 변동에서 발생 하는 변화를 줄이기 위해 동일한 세션에서 전체 데이터 집합을 확보.

4. 이미지 처리와 3D 재건 Neurovascular 단위

  1. (선택 사항) 인수 z 스택의 축 해상도 증가, 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 데이터 집합이 deconvolution 수행 (테이블 자료 참조 ).
    1. Deconvolution 소프트웨어에서 수행 하기 위해 설정을 변경 " 장 님 " deconvolution, (, 적응형 포인트 확산 함수를 사용 하 여).
    2. Deconvolution 소프트웨어 설정, 배경 제거;에 대 한 옵션에 토글이이 옵션은 이미지 스택에 작은 강도 값에 이미지의 모든 픽셀의 강도 값에서 뺍니다.
    3. Deconvolution 소프트웨어 설정에서 rescaling 강도 대 한 옵션을 전환 하 고 16 비트 깊이; 크기 조절이 옵션 것 원래 강도 값과 이미지의 동적 범위.
    4. 의 메뉴에 ' 굴절률 ', 1.52로 값을 설정. 에 ' 설정 파장 ' 메뉴를 선택 각 이미지 채널에 대 한 값을 방출. 예를 들어 녹색 발광 fluorophore에 대 한 선택.
  2. 시각화 및 3 차원 데이터 세트 (재료의 표 참조)의 분석에 적합 한 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 데이터 집합을 엽니다. 이미지 분석 소프트웨어에서 눌러는 " Surpass " 모 세관의 3D 볼륨 렌더링 하는 단추.
  3. 이미지 분석 소프트웨어에에서는 " 추가 새로운 표면 " 세그먼트에 모 세관 표면 버튼. 아래쪽 화살표를 사용 하 여 표면 생성 마법사의 단계에에서 사이 이동.
    1. 에는 ' 만들기 ' 탭 모 세관 표시, 예를 들면 CollagenIV와 함께 채널 소스 채널을 설정 하 고 0.5 µ m의 값을 노출 영역 세부 설정.
      참고: 후자의 옵션 이미지에 가우시안 필터를 적용 하 고 표면의 부드러움을 결정 합니다.
    2. 에는 ' 만들 ' 탭, 절대 강도 임계값 옵션에 토글.
      참고:이 옵션 이미지에서 선택 된 채널의 절대 강도에 따라 마스크를 생성 하 여 서피스를 생성 합니다.
    3. 표면 만들기 마법사에서 다음 단계에 렌더링 된 마스크 커버 이미지에서 전체 모 세관까지 강도 히스토그램에서 슬라이딩 윈도우를 이동 하 여 표면에 대 한 낮은 강도 임계값을 조정. 각 데이터 집합에 대 한 경험적으로이 매개 변수에 대 한 값 범위를 확인.
    4. 표면 작성 마법사의 마지막 단계에서 아래 드롭 다운 메뉴에서 클릭 합니다 " 필터 유형 " 옵션을 선택 하 고 ' 복 수 '. 2.0e5 1.0e5 사이의 값으로 복의 최소 수를 설정.
      참고:이 옵션 표면 복, 프레임의 가장자리에 모세의 예를 들어 작은 세그먼트의 작은 수를 제외 합니다.
    5. 표면 만들기 마법사를 완료 하 고 클릭 하 여 생성 매개 변수를 저장 " 매개 변수 기억 " 표면 메뉴의 다시 탭에서.
    6. 첫 번째 이미지에 사용 되는 매개 변수 집합을 로드 하 여 데이터 집합을 이미징 하는 전체에 대 한 절차를 반복 합니다. 각각, 임계값, 강도와 최소한의 배경 강도 및 모 세관 형태, 차이 대 한 계정에 각 이미지에 대 한 복에 대 한 매개 변수를 조정.
  4. 세포내 나노미터 구조 (, 면역 글로불린 가득 endosomes) 세그먼트, 먼저만 모 세관 내에서 형광 신호를 포함 하는 새 채널을 만듭니다.
    참고:이 프로세스 단계 4.3
    1. 선택에서에서 만든 모 세관 표면을 사용 하 여 마스크를 생성 하 여 관심의 영역을 정의 것입니다는 ' 편집 ' 메뉴는 ' 모 세관 표면 ' 패널. ' 속성을 마스크 ', 클릭 " 마스크 모든 ". 로 세포내 소포 신호를 포함 하는 채널 선택은 ' 소스 채널 ' 옵션에 토글 " 마스크를 적용 하기 전에 채널을 복제 ".
    2. 에는 ' 마스크 설정 ' 열, 선택 " 지속적인 내부/외부 " 및 " 복을 외면 설정: " 0.00을 값을 설정 하 고.
      참고:이 프로세스 모 세관 마스크 외부 모든 복 0 강도 값을 할 것 이다 하는 이미지에는 추가 채널을 만들어집니다. 계량 (, 뇌 실질에) 모 세관 외부 이벤트를 선택 " 복 표면 내부 설정: " 0.00을 값을 설정 하 고.
    3. 나노미터 구조를 세그먼트, 시작 버튼을 누르면
    4. 는 " 새로운 관광 명소 추가 " 마법사. 아래쪽 화살표를 사용 하 여 표면 생성 마법사의 단계에에서 사이 이동.
    5. 만들기 탭에서 드롭 다운 메뉴를 사용 하 여 " 소스 채널 " 단계 4.4.4에서에서 만든 세포내 마스크 채널 선택.
    6. 만들기 탭에서 아래는 " 탐지 자리 " 섹션, 예상된 XY 직경 0.5와 소포에서 관찰의 평균 크기에 따라 1 µ m 사이의 값으로 설정 실험입니다. 이 옵션 세그먼트화 알고리즘에 의해 검출 될 것 이다 가장 작은 크기를 결정 합니다.
    7. 만들기 탭에서 아래는 " 탐지 자리 " 섹션에 대 한 옵션에 토글 " 배경 빼기 ".
      참고:이 옵션 (단계 4.4.7에서에서 선택한 값)에서 0.75 자리 반지름의 가우스 필터와 이미지를 부드럽게 것 이다 고 0.88 자리 반경으로 필터링 원본 이미지 가우스의 강도 뺀 다음.
    8. 에는 ' 만들 ' 탭, 아래에 있는 드롭다운 메뉴를 눌러 ' 필터 유형 ' 선택 " 품질 ". 참고가 관광 명소의 중심에 강도에 따라 임계값을 적용 하 여 이미지를 세그먼트 것입니다. 걸쳐 슬라이딩 윈도우를 이동 하 여 낮은 강도 임계값을 조정에 ' 품질 ' 식별 소포의 대부분 표시 될 때까지 막대 그래프.
      참고:이 매개 변수에 대 한 값의 범위는 각 데이터 집합에 대 한 실험적으로 결정 될 필요가.
    9. 자리 만들기 마법사를 완료 하 고 버튼을 눌러 생성 매개 변수를 저장 " 매개 변수 기억 " 표면 메뉴의 다시 탭에서.
    10. 첫 번째 이미지에 사용 되는 매개 변수 집합을 로드 하 여 데이터 집합을 이미징 하는 전체에 대 한 절차를 반복 합니다. 조정에 대 한 매개 변수는 ' 품질 강도 임계값 ' 배경 강도 차이 대 한 계정에 각 이미지에 대 한.

5. BBB에서 세포내 수송의 정량화

  1. 계량 (µ m 3)에서 볼륨 및 모 세관 세그먼트의 (µ m 2)에 지역. 분석 소프트웨어에서 단계 4.3에서에서 만든 혈관 표면의 통계 패널을 액세스. 선택은 ' 상세 ' 드롭 다운 메뉴를 사용 하 여 선택 하 고 탭, " 모든 값 " 볼륨 및 지역에 대 한 값을 찾을 수.
  2. 계량 모 세관 세그먼트 내의 소포 수 있습니다. 분석 소프트웨어에서 단계 4.4에서에서 만든 관광 명소의 통계 패널을 액세스. 선택은 ' 전체 ' 이미지에 관광 명소의 총 수의 값을 찾을 수 탭.
  3. 각 이미지에 대 한 모 세관 볼륨당 vesicles의 수를 계산 하려면 볼륨 단계 5.1에서에서 계산에 의해 관광 명소의 수를 정상화. 모 세관 볼륨의 1000 µ m 3 당 소포 수 1000이이 값을 곱합니다.
  4. 모 세관 내에서 총 강도 계량 하 전체 이미지 다음 4.3 다음 수정 단계에 설명 된 지침을 포함 하는 새 화면을 만듭니다. 소스 채널 관련 신호 (예를들면, mIgG)를 포함 하는 채널을 선택 하 고 5 µ m 영역 세부 수준 값 설정. 전체 이미지를 포함 하는 표면, 만들려고 낮은 강도 임계값의 값을 0 설정.
  5. 분석 소프트웨어에 액세스 통계 단계 5.4에서에서 만든 표면. 선택은 " 상세 " 드롭 다운 메뉴를 사용 하 여 선택 하 고 탭, " 모든 값 ". 에 대 한 값을 기록 ' 강도 합계 ' 관심;의 채널에 대 한 이 매개 변수는 모든 픽셀 개별 휘도 값의 합에 해당.
    참고: 세포내 신호에 대 한이 복 외면을 0.0으로 설정 된 중복된 채널에 해당 합니다. 이 복 0.0으로 설정 하는 표면 내부와 복제 된 채널에 해당 하는 뇌 실질에 신호에 대 한.
  6. 각 이미지에 대 한 모 세관 볼륨 당 형광 강도 계산 하는 단계 5.1에서에서 계산 볼륨에 의해 강도 정상화. 1000 모 세관 볼륨의 1000 µ m 3 당 형광 강도 값을이 값을 곱합니다.
    참고: 뇌 실질에 형광 신호에 대 한 모 세관 볼륨 마이너스 총 이미지 볼륨 값을 정상화 하 고 뇌 실질의 1000 µ m 3 당 총 강도를 1, 000을 곱합니다.
  7. 전체 데이터 집합에 대 한 절차를 반복 하 고 적절 한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터의 통계 분석을 수행.

Representative Results

이미지의 대표적인 예는 여기에 설명 된 프로토콜에서 얻은, 마우스 뇌 섹션 지하실 막, 이다, pericytes, NVU의 다른 구성 요소를 인식 하는 항 체로 얼룩진 했다 그리고 내 피 세포 (참조 사용 하는 특정 항 체에 대 한 테이블의 자료 ) (그림 1A, D, 전자). 에이 해상도 개별 astrocytic 프로세스와 모세와 직접 접촉에 있습니다-발 끝을 구별 하는 것이 가능 하다.

세포내 구조를 탐지 하기 위한이 프로토콜의 적합성을 강조 하기 위해 주변16 인간의 안티 타우 mAb86 항 체 주사는 동물에서 뇌 섹션 붙일 이라는 반대로 인간 항 체 ( 물 했다 그림 1B). mAb86는 특히 대상 뉴런 타우16의 병 적인 형태를 표현으로 알려져 있다. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, mAb86 신경 (그림 1B-C) 내에서 개별 나노미터 구조 내에서 회절 제한 된 해상도 감지 되었습니다. 또한, 내 피 세포에서 세포내 구조 pericytes (D-E 그림 1그림 2)에 생 마우스 IgG 검색 되었습니다.

뇌 맥 관 구조의 고해상도 confocal z 스택의 인수 모세 혈관과 세포내 소포 BBB에서의 3 차원 세그먼트화 할 수 있습니다. 렌더링 및 모 세관 CollagenIV와 마우스 igg가 양성 이라는 분단의 과정의 예를 그림 2 에 세포내 소포. 예 모 세관 볼륨 당 소포 수를 측정 하 여 분할 된 이미지의 전체 데이터 집합을 측정, 여 다른 조건 하에서 세포내 전송 프로세스에 변화를 공부 하는 가능 하다. 그림 3 B C mIgG 소포 번호와 형광 강도 해당 하는 뇌 실질에 mIgG 각각, 이전에 보고 된pdgf bret/ret 마우스 모델에서 pericyte 고갈 시 차이점을 보여 줍니다. 17. 동일한 접근 했다 또한 최근 서로 다른 뇌 영역18사이 BBB에서 세포내 수송에 대 한 변경 내용을 분석 하는 데 사용 됩니다.

Figure 1
그림 1: 여러 종류의 subcellular 구조는 혈관의 Labelling 장치 혈관 단위 (A D)와 세포내 소포 신경 (B)에 포함 된 또는이 프로토콜으로 얻은 내 피 세포 (E)의 대표 이미지. A (위)에 최대 강도 프로젝션 이미지 (녹색) CollagenIV에 의해 표시 하는 모세 혈관을 둘러싼 GFAP 양성 이다 (빨간색)의 분포를 보여줍니다. 화살표는 개별 astrocytic 프로세스를 가리킵니다. 눈금 막대 = 20 µ m. 에이 해상도 개별 사이토 프로세스 및 끝 발 명확 하 게 볼 수 있습니다, 박스형된 지역 (아래)의 확대 된 이미지와 같이. 화살촉 끝 발 astrocytic을 가리킵니다. 눈금 막대 = 10 µ m. B에서 이미지는 주변 주입 항 체, hippocampal 신경 내의 (녹색), mAb86의 축적을 보여줍니다. 화살촉 개별 mAb86 양성 소포를 가리킵니다. 눈금 막대 = 10 µ m. C 에서 그래프는 단일 기의 선 프로필 강도를 보여줍니다. 소포 크기 절반 최대 강도 곡선 (녹색 선 및 원)의 가우스 적합 (검은 실선)의 전체 폭에서 추정 되었다. 기저 lamina (CollagenIV, 회색) 내 D 에 이미지 표시 (녹색) 내 피 세포는 pericyte 둘러싸여의 3 차원 재구성 (빨간색) 합니다. 낮은 패널 개별 형광 채널을 표시합니다. 눈금 막대 = 10 µ m. E 에서 이미지 안에 pericytes (오른쪽 패널, 녹색에서 CD13) 하지만 내 피 세포 (왼쪽 패널, 녹색에서 CD31) 내에서 세포내 소포에서 (빨간) mIgG의 지역화를 표시 합니다. 모든 이미지, 핵 스테인드 DAPI 파란색으로 표시 됩니다. 눈금 막대 = 5 µ m. 패널 D 그리고 E 참조17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 : 모세 혈관과 혈액-뇌 장벽에 세포내 소포의 3 차원 렌더링. 설명 하는 프로토콜, CollagenIV 양성 모 세관 (녹색) 및 마우스 IgG 세포내 소포 (레드) 했다의 고해상도 confocal 이미지 (A) 인수. 왼쪽된 패널 횡단면 단일 광학 섹션을 보여 줍니다. 화살표는 뇌 내 피 세포 내에서 개별 mIgG 양성 소포를 가리킵니다. 전체 z-스택 사용 하 여 오른쪽 쇼 3D 개조에 패널 이미지 처리 소프트웨어 ( 재료의 표참조). 모 세관 볼륨 (B) 및 개별 소포 (C) 3 차원에서 렌더링 된 및 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 계량 ( 재료의 표참조). 모든 이미지, 핵 스테인드 DAPI 파란색으로 표시 됩니다. 스케일 바 = 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : BBB에서 mIgG 세포내 지역화의 정량화. 대표 이미지를 보여주는 모 세관 (collagenIV, 녹색으로 표시)의 (A) 3 차원 개조와 mIgG의 분포 (적색) C57BL/6 마우스와 pdgf bret/ret pericyte 고갈 마우스 이전19에서 설명합니다. 스케일 바 = 10 µ m. B에서 이미지 CollagenIV 마스크 내에서 세포내 소포의 세그먼트를 표시합니다. ThB 에서 e 그래프 정량화 및 모 세관의 볼륨 당 mIgG 기 수의 비교를 보여줍니다. 각 점 개별 모 세관 세그먼트에서 측정을 나타냅니다. 오차 막대는 데이터의 표준 편차를 나타내는 및 실선 보여준다는 뜻. C 표시에서 이미지는 CollagenIV 마스크 외부 mIgG 형광 신호. 마찬가지로, C 에서 그래프 표시 정량화 및 mIgG 형광 강도의 비교 C57BL/6 마우스와 pdgf bret/ret 사이의 뇌 실질에서 pericyte 고갈 쥐. 형광 강도 단위 모든 C57BL/6 마우스에서 측정 하는 평균 mIgG 실질 강도 의해 정상화 되었다. 이 그림은 참조17에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

위에서 설명한 프로토콜 BBB의 고해상도 현미경 뇌 부동성 섹션, immunofluorescent 얼룩, 이미지 수집 및 분석 매개 변수의 준비를 설명 합니다. 이 방법은 최근 항 체 전달 플랫폼3, BBB17에서 내 생 적인 IgG의 교통과 pericyte 손실18시 BBB의 이종의 지역화를 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 프로토콜의 다른 단계는 실험의 특정 목표에 맞게 수정할 수 있습니다. 첫째, 두께 (100 µ m) 단면도 사용 하 여 immunostaining 및 설치 절차 동안 그들의 처리를 촉진 한다. 그것은 또한 모 세관 네트워크 neurovascular 단위의 3 차원 재구성 및 모 세관 및 NVU 횡단면의 세대에 대 한 수 있습니다. 그러나, 조직 섹션 내에서 항 체의 다를 수 있습니다 그리고 일부 항 체 얼룩이 지는 coverslip 주변 조직의 표면 층을 제한할 수 있습니다. 프로토콜은 permeabilization 단계 동안 세제의 농도 또는 permeabilization 단계 조직으로 항 체 침투 개선의 길이 증가 하 여 수정할 수 있습니다. 둘째, 이미지 품질 이미지 산란으로 굴절율 불일치에서 광학 착오 인 조직 (표면 아래 일반적으로 20 ~ 30 μ m) 내의 깊은 시도할 때 손상 될 수 있습니다. 이 문제를 해결 하려면 삭제 하는 조직과 활성 항 체 침투20 에 대 한 새로운 방법이이 프로토콜 조직의 이미지 더 큰 볼륨을 함께 결합할 수 있습니다. 셋째, deconvolution 축 해상도의 이미지를 개선 하기 위해 이미지 수집 후 수행 됩니다. 이 프로토콜에 사용 되는 장 님 deconvolution 알고리즘의 선택은 (i) 그것의 사용의 용이성, 포인트 확산 함수의 아무 사전 계산은이 기반 필요, 이미지 품질21, 그리고 (iii) mIgG에의 부족을 개선 하기 위한 (ii) 그것의 견고성 구현 후 세포내 구조입니다. 세포내 구조 샘플에 시각에 따라 다른 deconvolution 알고리즘 높은 이미지 품질에서 발생할 수 있습니다. 다음 참조21,22 장점과 이미지 deconvolution 추가 알고리즘의 한계에 대 한 광범위 한 토론을 제공 합니다. 마지막으로, 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 3 개 차원에서 모세 혈관과 세포내 구조의 세분화를 허용. 명확 하 게 이미지 분석 프로토콜 및 대체 패키지 참조23에서 설명 하는 예 하에 설명 하는 소프트웨어를 제한 하지 않습니다, 그리고 세그먼트 이미지를 사용할 수 있습니다. 이미지 세분화의 정확도 평가 하 여 BBB 통해 세포내 구조 분석에 대 한 다른 소프트웨어 프로그램의 적합성을 실험적으로 확인 되어야 한다.

이 메서드는 고정 된 샘플에 기반을, 그것은 BBB에 걸쳐 transcytosis의 역학에 대 한 직접적인 정보를 제공 하지 않습니다. 그러나, 그것은 결합 될 수 있다 시간 과정 실험24, 예를 들어 정 맥 주입의 분자 재구성의 활동을 주입 후 다른 시간 지점에서 BECs 내의 그것의 축적을 측정 하 여 세포내 수송입니다. 이 방법의 장점은18, 현재 intravital 라이브 이미징 접근에 액세스할 수 있는 같이 깊은 두뇌 지구의 분석에 대 한 허용 한다. 프로토콜 중 중요 한 단계는 조직 고정의 주의 깊은 모니터링. 고정 4 %PFA 극적으로 세포내 세포와 생 또는 주변 관리 면역 글로불린17 (그림 1B)의 immunogenicity 감소 시킨다. 이 프로토콜의 한계의 요구-고품질 항 체의 (, 낮은 일반적인 얼룩, 낮은 분) 면역 형광 검사에 적합 이다. 같은 시 약을 사용할 수를 제공 관심사의 어떤 단백질의 세포내 지역화 조사 메서드를 적용할 수 있습니다. 예를 들어 프로토콜 뇌 내 피 세포17리소좀을 식별 하기 위해 사용 되었다. 이 프로토콜은 confocal 현미경 검사 법에 기반을, 측면 해상도 회절에 의해 제한 됩니다을 약 175 ~ 250 보다 작은 구조를 확인할 수 없는도 주목 한다 nm (그림 2).

이전 연구는 confocal 현미경 검사 법25,26를 사용 하 여 혈관 단위의 세포 구성의 상세한 분석을 수행 했습니다. 그러나, 전송 전자 현미경 검사 법19,,2728의 사용에 주로 의존 BBB에서 세포내 수송을 조사 합니다. 이 메서드는 세포내 구조의 높은 측면 해상도 제공 합니다, 전자 현미경 낮은 처리량을 가진 도전적인 기술 남아 있다. 또한, EM에 의해 구상 될 수 있는 다른 분자 대상의 수는 매우 제한 됩니다. 이 프로토콜 BBB에서 세포내 수송을 조사 하는 액세스할 수 있는 대안을 제공 합니다. 5 ~ 6 일에 이미지 분석, 뇌 컬렉션에서 완전 한 절차를 수행할 수 있습니다. 적합 한 항 체를 사용할 수 있는 경우 면역 형광 같은 샘플 내의 여러 세포 유형/분자의 동시 탐지를 허용 한다. 또한이 프로토콜 공간 해상도29에 한계를 극복 하기 위해 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술로 결합 될 수 있었다. 전반적으로, 위에서 설명한 프로토콜 변화 neurovascular 단위 내의 관심사의 단백질의 세포내 지역화에 정량화를 수 있습니다. 다른 유전자 또는 약리학 물결에 대 한 응용 프로그램 비보에BBB의 세포내 구조 및 전송 기능을 조사 하는 수 있게 됩니다.

Disclosures

저자는 로슈에 의해 유료 취업을 받고 있다.

Acknowledgments

캠핑카 작업 로슈 박사 친목 (2014-2017)에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM Novus Biologicals MCA2388 Labels Brain Endothelial Cells
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin R&D Systems MAB1556 Labels Lumen of capillaries
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV Biotrend BT21-5014-70 Labels Basement membrane of capillaries
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Goat polyclonal antibody against CD13 R&D Systems AF2335 Labels pericytes
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 Abcam ab49874 Labels Astrocytes
Use at dilution 1:100
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 Wako 019-19741 Labels Microglia
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 Fitzgerald 10R-CD107BBMSP Labels Lysosomes
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 LifeTechnologies A21203 Use at dilution 1:400
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 LifeTechnologies A21202 Use at dilution 1:400
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 LifeTechnologies A21422 Use at dilution 1:400
Filter paper Sigma-Aldrich WHA10334347 Whatman prepleated qualitative filter paper
Grade 0858 1/2, grained
Cyanoacrylate glue Roth Carl 258.1 Roti Coll 1
Fluorescent Mounting medium Dako S3023 Dako fluorescent mounting medium
Adult mice The Jackson Laboratory 000664 C57BL/6J male or female mice
between 9 and 19 months of age
Vibratome Leica Biosystems 14047235612 Leica VT100S vibrating blade microtome
Laser Scanning Confocal microscope Leica Microsystems NA Leica TCS SP8 X with HyD detectors
and White light laser
Image processing software Leica Microsystems NA Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587
Image analysis software Bitplane scientific software NA Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64
Fluorescence SpectraViewer ThermoFisher Scientific NA https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science
/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

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References

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혈액-뇌 장벽의 고해상도 Confocal 영상: 영상, 3 차원 재구성 및 Transcytosis의 정량화
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Villaseñor, R., Collin, L. High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis. J. Vis. Exp. (129), e56407, doi:10.3791/56407 (2017).More

Villaseñor, R., Collin, L. High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis. J. Vis. Exp. (129), e56407, doi:10.3791/56407 (2017).

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