Method Article

人脐血巨分化与血小板形成的 CD34+单元格

DOI:

10.3791/56420

⸱

December 27th, 2017

 ,  ,  , 
1Haematology Research Unit, St George and Sutherland Clinical School, University of New South Wales, 2Haematology Department, St George and Sutherland Hospitals

In This Article

Summary

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高纯度的巨可以从脐带血衍生的 CD34+细胞获得。本文介绍了一种 CD34+单元格隔离和巨区分的方法。

Abstract

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血小板的产生主要发生在骨髓的过程中, 称为形成。在形成, 造血祖细胞分化形成血小板前体称为巨, 后者的末期分化, 释放血小板从长细胞质过程称为 proplatelets。巨是罕见的细胞局限于骨髓, 因此很难获得足够数量的实验室使用。在合适的条件下, 通过培养 CD34 的+细胞, 可以在体外实现高效的人巨生产。这里详述的协议描述了由脐带血标本中的磁性细胞分类分离 CD34 的+细胞。介绍了在无血清条件下生产高纯度、成熟巨的必要步骤。还提供了巨分化的表型分析和 proplatelet 形成和血小板生成的测定的详细资料。影响巨分化和/或 proplatelet 形成的效应, 如血小板抗体或生成拟, 可以添加到培养细胞, 以检查生物功能。

Introduction

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由于骨髓中的低频率, 在正常的实验室使用中分离出足够数量的初级人类巨 (MK) 是不可行的, 因为它们在0.01% 的有核细胞中占到了1。一种方便的替代方法是在特定生长因子存在的情况下, 对造血干细胞和祖细胞进行体外扩张和分化. 在培养体系中, 有许多细胞因子, 包括干细胞因子、c 型配体和白细胞介素 (IL)-3 和 IL-11 MKs. 生成 (TPO) 是巨文化最有效的生长和分化因子并且是有效的单独或与其他细胞因子, 例如 IL-32。TPO 可以对干细胞种群产生作用, 导致 MKs2的增殖和成熟。

MK 产生血小板从细胞质突起称为 proplatelets 和,在体内,大约 1 x 1011血小板每天形成, 以维持血小板计数 150-400 x 109/l. 血小板生成体外为1000-折叠低于在体内估计3, 这已经产生了许多文化条件使用 CD34+造血祖细胞改善 MK 和血小板生成体外。用于 MK 分化的 CD34+细胞的初始来源是人外周血4。其他细胞来源包....

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Protocol

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该议定书得到了东南悉尼人类研究伦理委员会的批准, 并得到新南威尔士大学人类研究伦理委员会的批准。从健康捐献者获得的脐带血由悉尼脐血库 (悉尼, 新南威尔士州) 提供。这个过程使用了大约100毫升的容量。

注: 使用无菌技术的第二类生物安全柜工作。用70% 乙醇净化脐带血袋的外部。使用无菌器械 (剪刀、镊子) 进行此程序。

1. 脐血细胞的制备和分离 CD34 的+单元格

  1. 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 制备无菌分离缓冲液 (SB), pH 值为 7.2, 含0.5% 牛血清白蛋白和2毫米 EDTA。
  2. 将10毫升的 SB 放入50毫升的锥形管中 (每10毫升的血液需要一根管子)。使用一个 G18 钝针安装在10毫升注射器, 绘制10毫升的血液从袋子和分配到50毫升管包含10毫升的 SB。
  3. 添加15毫升的淋巴细胞分离介质 (参见材料表) 到含有稀释血液的管子底部, 形成两层。
    注意: 在管子的底部慢慢地分配介质, 以避免混合不同的层。
  4. 离心管在 1200 x g 为30分钟在室温 (RT) 没有断裂和没有加速度。
  5. 将含有单个核细胞 (大约 5-10 毫升) 的管的中心附近的层转移到一个新的50毫升管中, 使用巴斯德吸管。每管增加一个, 总容积为50毫升。
    6. ....

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Results

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此协议允许从脐血衍生的 CD34+细胞制备高度纯净的 MK 培养物。脐血中 CD34+单元格的百分比约为 1.3%15 (图 1A), 每个单核细胞的总数量 (步骤 1.8) 范围从 90-300 x 106每个单元。隔离后的 CD34+/CD45+ 细胞的纯度从90到 99% (图 1B)。MK (定义为 CD41 的+单元格) 在无血清 CD34+单元格区域性中早期观察到 rhTPO 的存在。在7天, 成熟的 MK (CD41+和 CD42a+单元格) 的百分比通常为 30-40% (图 1C)。最高级别的 CD41+和 CD42a+双阳性单元格 (.......

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Discussion

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本文所述的协议适用于脐血培养中的 MK 和血小板的持续生产。这些细胞可用于研究各种过程, 如药物或生物活动对 MK 增殖、分化、proplatelet 形成和血小板生成的影响。

文中介绍了多种培养基和细胞因子的组合。细胞因子、Flt-3 配体、IL-3 和 IL-6 细胞因子的增加支持 CD34 的增殖.但是, 此扩展在区域性14中导致 MK 纯度降低。这里提出的方法, 使用无血清培养基和 rhTPO 单独, 不允许显着扩展祖细胞, 但允许 unilineage 巨增殖和分化和一致生产 MK (90-99% CD41+CD42a+双阳性细胞) 而不受其他血统的污染。MK 形成的培养期为10至12天, 无需支持基质或饲养细胞。这与需要更大区域性的其他方法 (超过20天)17,18相比比较有利。本议定书的血小板产生率为每位 MK 19-42 血小板, 每输入.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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作者承认澳大利亚卫生和医学研究理事会 (与六六六相关的项目赠款 1012409) 的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
细胞培养试剂
重组人 TPOMiltenyi Biotec130-094-013
StemSpan SFEM IIStem Cell Technologies9605CD34 + 细胞无血清培养基
名称Company目录号评论
CD34 分离试剂
CD34 微珠试剂盒超纯Miltenyi Biotec130-100-453该试剂盒包括 FcR 人 IgG 封闭试剂和 CD34 微珠。这些微珠包含抗 CD34 抗体克隆 QBEND/10。使用不同的抗 CD34 克隆进行纯度检查（例如克隆 8G12）。
淋巴细胞制备Alere Technologies1114545淋巴细胞分离培养基（密度 1.077 g/mL）
无菌分离缓冲液 （SB）Miltenyi Biotec130-091-221缓冲液含有磷酸盐缓冲盐水 （PBS），pH 值为 7.2，含有 0.5% 牛血清白蛋白和 2 mM EDTA。它可以使用无菌的细胞培养级组分进行制备。使用前脱气，因为气泡会堵塞色谱柱。
名称公司>目录号注释
流式细胞术和细胞染色试剂
PE小鼠抗人CD34BD Biosciences 340669克隆8G12。这可用于 CD34 纯度检查。最终抗体浓度 1：10 稀释。
PerCP 小鼠抗人 CD45BD Biosciences 3474641：10 稀释
PerCP 同种型对照BD Biosciences3490441：10 稀释
FITC 小鼠抗人 CD41aBD Biosciences340929最终抗体浓度 1：5 稀释。
APC 小鼠抗人 CD42bBD Biosciences 551061该抗体也可用于检测成熟 MK（阳性细胞的百分比通常低于抗 CD42a）。最终抗体浓度 1：10 稀释。
Alexa Fluor 647 小鼠抗人 CD42aAbD SerotecMCA1227A647T目前由 Bio-Rad 分销。最终抗体浓度 1：10 稀释。
Alexa Fluor 647 小鼠阴性对照AbD SerotecMCA928A647目前由 Bio-Rad 分销。同种型对照抗体
抗血管性血友病因子兔多克隆抗体AbcamAB69941：200 稀释
V450 小鼠抗 HUNA41aBD Biosciences584251：20 稀释
V450 同种型 对照BD Biosciences5803731：20 稀释
PAC1-FITC 抗体BD Biosciences3405071：10 稀释
抗 CD62p 小鼠单克隆AbcamAB66321：200 稀释
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgGInvitrogenA110081：100 稀释
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgGInvitrogenA110201：100 稀释
Ig 同种型对照混合物-CBD Biosciences558659同型对照抗体
碘化丙啶Sigma AldrichP4864
CountBright 绝对计数微珠分子探针，InvitrogenC36950计数微珠
名称Company目录号评论
材料
LS 色谱柱Miltenyi Biotec130-042-401更小和更大的色谱柱也可市售
MidiMACS 分离磁铁Miltenyi Biotec130-042-302
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
Falcon 5mL 圆底聚丙烯 FACS 管，带卡口盖，无菌体外技术352063
载玻片Menzel-GlaserJ3800AMNZ
含 DAPI 的封固剂Vector LaboratoriesH-1200抗淬灭封固剂
>名称Company>目录号Comments
设备
倒置显微镜徕卡DMIRB 倒置显微镜
荧光显微镜蔡司Vert.A1
细胞分析仪BD BiosciencesFACS Canto II
细胞离心涂片离心ThermoScientific细胞离心涂片 4
名称Company目录编号Comments
Software
细胞分析仪软件BD BiosciencesFACS Diva软件
单细胞分析软件Tree StarFlowJo
荧光显微镜软件ZeissZen 2 blue edition
该<机

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
  2. Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-m....

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