Summary
迅速抗原細菌表面に表示のための新たな手法を提示することで、単量体のアビジンとの融合に興味の蛋白質への暴露に続いて表面ビオチン化が含まれます。選択した抗原と BCG を正常に読み込み表面加飾が従来の遺伝的アプローチを置き換えることができますを示唆して、その免疫原性が向上します。
Abstract
結核 (TB)、深刻な感染症のみ利用可能なワクチンウシ細菌カルメットゲラン桿菌 (BCG) 安全かつ効果的なは、子供の深刻な TB の髄膜炎と播種性結核のいくつかのフォームの保護が保護するために失敗しました。肺の結核に対する病気の最も流行する形態であります。現在 BCG を改善する有望な戦略は結核 (Mtb)主要抗原遺伝子とその変換のいずれかを依存して-特定の抗原および/または抗原刺激する共同因子をコードする遺伝子と相補提示細胞。これらのアプローチの主要な制限には、低効率、低安定性、発現ベクターの安全性の不確実性のレベルが含まれます。本研究では対応する遺伝子をプラスミドに変換ではなく、細菌の表面に興味の外因性蛋白質と BCG の相補性から成っているワクチン改善する方法を提案する.標準的なエシェリヒア属大腸菌の単量体のアビジンと融合に興味の蛋白質を表現するまず、式システム、ビオチン化 BCG の表面を飾るために使用します。サロゲート卵白アルブミン抗原で飾られた BCG 表面を用いた動物実験では、変更された細菌は完全に免疫原性と特異的 T 細胞反応を誘導することができることを示しています。完全に、強くここに示すデータは外因性核酸を補完の面倒な従来の手法に代わる現在の BCG ワクチンは整形のため小説と効率的な方法をサポートします。
Introduction
現在の結核ワクチン BCG、遺伝子を導入する遺伝子組み換え BCG 株、弱毒ライブM.tb 、ウイルスのベクトル化技術タンパク質補助システムをどちらかなどを交換する様々 な戦略が提案されています。感染1またはMtbの中に十分に表されない BCG 抗原発現-BCG2に特定の抗原が存在しません。遺伝子工学、しかし、安全、時間のかかるプロセス、および式ベクトル4、5の低効率の不確実性のレベルを含む多くの障壁に直面しています。BCG を改善に関して不確かな遺伝的交替を必要とせず免疫原性を改善するために別のアプローチが必要です。
本研究では BCG 細胞表面ビオチンとよく知られている高親和性アビジン相互作用に基づく利息の組換え蛋白質の表示のための新たな戦略を紹介します。このアプローチにより、BCG は、その優れた安全性を維持しながら有効性の最大の改善を達成するために BCG の広範な操作を容易にビオチン化の表面に組換えアビジン融合蛋白質の迅速かつ再現可能な添付ファイル使用の十年にわたって観察を記録します。
ビオチンにアビジンの親和性が非常に高い (Kd = 10− 15 M) と構成、ビオチン-アビジン複合体は非常に安定と変化の条件6の下でのみ破壊することが。ただし、この種類の相互作用遺伝子転送メソッドの代替方法として、組換えタンパク質の長期的なリバーシブルの表示が必要です。したがって、我々 はここで低親和性単量体アビジンを紹介 (Kd = 10−7 M) 表面からのタンパク質の可逆的なリリースにリードがいったん抗原提示細胞内に取り込まれた BCG を装飾。コンセプトの証明を提供するために、我々 は卵白アルブミン (OVA)7,8から派生したサロゲート抗原に対応する単量体アビジン キメラ蛋白質を使用してこのメソッドをテストしました。結果は、BCG 細胞表面飾ることができる簡単かつ迅速に単量体アビジン融合蛋白質と BCG の表面にこのバインドは安定して細菌の増殖や生存に検出可能な変更することがなく再現できることを示した。また、わかった OVA (AviOVA) と融合した単量体アビジンで飾られた BCG が類似する BCG による免疫反応を引き起こすことができる同じ抗原を遺伝子発現の in vitroとin vivoの両方。細菌の表面に興味の蛋白質の元に戻せる状態表示のこの技術は伝統的な遺伝子移転手法の効果的な代替と BCG の広範な操作とワクチンでさらにアプリケーションのプラットフォームを提供することができます。開発。
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Protocol
すべての動物は、動物のケアおよび使用委員会ブリティッシュ ・ コロンビアの大学によって承認されたプロトコルに従って維持されました。実験は動物ケアおよび使用委員会によって承認され、動物介護ガイドライン カナダ評議会によると実行します。動物保証福祉は A11 0247 です。
1. プラスミドを表現する単量体アビジン融合蛋白質の生成
- サブ 133 に対応する"CTC"や"GAA"サイト間 pDEST17 プラスミドに単量体アビジン シークエンス12のクローン-134bp。 (すなわち、6 histag と pDEST17 Attr1組換えサイト間) p17 avi ファイルを取得します。
注: 単量体アビジン DNA シーケンスを以下に示します。単量体アビジンを取得する野生型アビジンで導入された 3 つの突然変異は、太字の文字で表示されます。
gccagaaagtgctcg ctgactggga aatggaccaa cgatctgggc tccATCatga ccatcggggc tgtgaacagc
agaggtgaat tcacaggcac ctacatcaca gccgtaacag ccacatcaaa tgagatcaaa gagtcaccac tgcatgggac
acaaGCTacc atcaacaaga ggacccagcc cacctttggc ttcaccgtca attggaagtt ttcagagtcc accactgtct
tcacgggcca gtgcttcata gacaggaatg ggaaggaggt cctgaagacc atgtggctgc tgcggtcaag tgttaatgac
attggtgatg acAAAaaagc taccagggtc ggcatcaaca tcttcactcg cctgcgcaca cagaaggagt ga - 両脇にAttB1 とAttB2 サイト OVA ポリペプチド757-1035に対応するプライマーを設計 (- A、b-、H-2_Kb-エピトープを制限) DNA シーケンス。プライマー シーケンス: Attb1-卵子
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCTTGAGCAGCTTGAGAGTAT とAttb2-卵子
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGTTACCCTACCACCTCTCTGC。(Attb1 とAttb2 シーケンスが太字で表示される) です。- PCR 増幅 OVA ポリペプチド757-1035 DNA シーケンス テンプレートとして pUC57 OVA プラスミドを使用して上記のプライマー。
- サイト固有の in vitro再結合反応によって (例えば、BP Clonase) pDONR-卵子を取得する pDONR 221 に PCR の製品をクローンします。
- P17 avi LR Clonase 反応を使用して p17 Avi 卵子を取得する興味の遺伝子を転送します。
メモ: 組み変えのクローニング BP と LR の詳細については、製造元のマニュアルを参照してください。
2. 単量体アビジン融合タンパク質発現・精製・ リフォールディング
- P17 Avi OVA プラスミドを大腸菌BL21 に変換し、37 ° C で 3 h の IPTG (0.1 M) と大腸菌BL21 文化の 250 mL を誘発します。
-
細菌や封入体を可溶化の換散
- 4,000 x g と 4 ° C では遠心分離の 30 分の誘導 BL21 文化の 250 mL のペレットします。
- 換散バッファーの 10 mL にペレットを収集 (50 mM トリス-HCL、150 mM の NaCl、6 M グアニジン塩酸で pH 1.5 2.5) と 95 ° C で 15 分間インキュベートローテーターに室温で一晩インキュベートします。
- 15,000 × g と 4 ° C と上澄みで 30 分遠心分離します。
-
清 (封入体を可溶化された分数) Ni NTA 列を使用してから Avi OVA を浄化します。
- 封入体の 1:2 の換散バッファーで希釈します。
- Ni NTA 樹脂封入体の文化由来の 250 mL あたり 4 mL を使用します。
- 10 ml の溶解バッファー (pH 7.0) の 3 倍を洗います。
- 10 mL の溶出バッファー (250 mM のイミダゾール換散バッファー 7.0 pH) で溶出します。
- 希釈 (1:10) で溶出蛋白質のフォールディングとトリス緩衝液 (7.5) で急速なボルテックスを含む 1 mM DTT、200 mM NDSB256 (3-(Benzyldimethylammonio)propanesulfonate)、Tween 80 0.5 mM、500 mM アルギニン、室温で 30 分間 200 mM の NaCl。
- デ塩、製造元のプロトコルに従ってタンパク質コンセントレーターと PBS に Tris バッファーからの蛋白質を refolded バッファー交換。
- 3,500 × g 4 ° C で 30 分間遠心分離によって集計を削除し、-20 ° C で溶ける蛋白質の因数を格納
3. BCG 細胞表面ビオチン化
- ミドルブ ルック 7 H で BCG を成長 9 スープ 10 %oadc (オレイン酸、アルブミンおよびブドウ糖のソリューション) と 0.05% Tween 80 外径まで 50 rpm でシェーカーのプラットフォーム上の 37 ° c = 0.5-1。
注: BCG はバイオ セーフティ レベル 2 の病原体、バイオ セーフティ キャビネット適切な個人用保護具付けで BCG をに関するすべての実験を行う必要があります。 - 500 μ L の冷たいエンドトキシン無料 PBS プラス 0.1 %tween80 (pbst;) (pH 8.0) 109 BCG 3 倍を洗います。滅菌エンドトキシン無料 PBS で BCG ペレットを中断します。
-
使用直前に滅菌ろ過された水で 10 mM スルホ NHS SS ビオチンの 1 mL を準備します。
- 30 分間室温でスルホ NHS SS ビオチンの 0.5 mM の 1 ml の細菌を孵化させなさい。
-
ラベルの付いた細菌の非反応したビオチン化試薬を削除する冷たい pbst; アイス 500 μ L で 3 回洗います。
- 再 pbst; 1 mL にペレットを中断します。
-
ビオチン化効率を評価するために 20 分間室温で 108ビオチン標識ストレプトアビジン FITC (1: 100, 25 μ L) と BCG を染色します。
- 2 %1 mL にステンド グラスの細菌を孵化させなさい室温で 20 分間 PFA、フローサイトメトリー分析によるビオチン化のレベルを調べます。
4. ビオチン抗酸菌の表現型: 成長および存続
-
ミドルブ ルック 7 H で BCG 株を成長 9 スープ 10 %oadc (オレイン酸、アルブミンおよびブドウ糖のソリューション) と 0.05% Tween 80 50 rpm でシェーカーのプラットフォーム上の 37 ° C で。
- 8 日間にわたって細菌文化の光学濃度 (OD600) を記録します。
-
BCG リュック (上記9) を使用して、マクロファージの細菌の生存を検出します。
- ビオチン標識 BCG リュック (MOI 10:1) と RAW264.7 細胞に感染や BCG リュック (コントロール) を放置期間 48 h を 37 ° C で培養しました。
- 細胞膜を洗浄し、摂取した細菌を解放する 0.025 %sds 溶解します。
- 生物発光ルシフェラーゼ アッセイ システムとルミノ生産を測定します。
メモ: 発光信号は、細菌の生存率を表しています。ルシフェラーゼ アッセイの詳細は、製造元のマニュアルを参照してください。
5. ビオチン BCG 表面に単量体のアビジン融合蛋白質の結合
- シェーカーのプラットフォームに室温で 1 時間 Avi 蛋白質 (PBS T で最終 10 G/ml) と 5 x 108ビオチン BCG をミックスします。
- アイス冷たい PBST および汚れウサギ抗アビジン抗体 (Ab) (1: 100 希釈、前述10) 室温で 20 分間放置と FITC の 500 μ L で 3 回洗い細菌標識ヤギ抗うさぎ IgG Ab 同じ条件で。
- PBST の 500 μ L で 3 回細菌を洗浄し、表面の装飾の程度を評価するためのフローサイトメトリーによる分析します。
6. 抗酸菌の凍結乾燥
- Biotinylate 細菌ステップ 3.1 3.4 とコート ビオチン化細菌によると Avi OVA と 5.1 のステップによると。
- 割り切れるビオチン化やコーティングされた細菌 (108)、PBS で洗浄および再 0.5 mL 凍結乾燥媒体の中断 (1.5%、75% H2O、25 %sauton 培地 Na グルタミン酸)。
- ガラスの瓶に細菌を転送し、一晩-80 ° C のフリーザーで凍結します。
- 凍結乾燥機を使用して 24 時間つぶしと冷凍ガラスバイアルを凍結乾燥します。
- 常温乾燥のサンプルを格納し、PBS 必要なときに再構築します。
- 3.5 ビオチン化及び表面の安定性を評価するための手順を繰り返します。
7. 食作用の試金
- 70-80% の confluency まで DMEM 培地含む 5 %fcs、L-グルタミン、HEPES、非本質的なアミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシンの各 1% の 10 cm 径培養皿で未加工 264.7 マクロファージ細胞は成長します。
- 6 ウェル プレートで 2 x 106未加工 264.7 マクロファージ細胞を播きます。37 ° C、5% CO2で一晩接着細胞を許可します。
- 生成した DsRed BCG 3.1 3.4 の手順および 5.1 によると Avi OVA (した DsRed BCG Avi OVA) で飾られた (前述した9)。
- した DsRed BCG-avi ファイル-OVA またはモイ 20:1 37 ° C で 24 時間で治療した DsRed BCG と生細胞に感染します。
- 血球を 3 回洗浄し、trypsinize 10 分の 37 ° C で 0.25% トリプシンの 1 mL を使用して部分的に切断の細菌を除去します。
- 2.5% で修正室温で 20 分間 PBS で PFA。
- PBS の 3 x を洗浄し、フローサイトメトリーで分析します。
8 マクロファージにおけるビオチン BCG を飾られた OVA の細胞内輸送
-
蛍光顕微鏡
- 24 ウェル プレートで coverslips に 3 × 105 RAW 264.7 マクロファージ細胞を播きます。37 ° C、5% CO2で一晩接着細胞を許可します。
- 抗酸菌 (MOI 10:1) 保守メディアの 37 ° C および 4 に 24 h の 5% CO2で抗生物質なしでマクロファージ細胞に感染します。
- 細胞を洗浄し、ステップ 7.5 のように表面の添付、非摂取の細菌を除去する trypsinize。
- 2.5% で修正感染細胞室温で 20 分間 PBS で PFA は PBS の 3 洗浄が続きます。
- ブロック/透過バッファー内セルを permeabilize (0.1% トリトン X-100、PBS で 3 %bsa) 室温で 20 分間。
- 興味の特定の抗体を使用 (例えば、ウサギの反アビジン Ab) で透過に 10 μ g/mL 室温で 20 分間バッファーは続いて 20 分間 (例えば、FITC ヤギ抗うさぎ IgG) 二次抗体。
- 洗浄は、一度水との蛍光退色を最小限に抑えるため水土台媒体の 10 μ L のスライド マウント、pbs 3 x を細胞します。
- 63 x を搭載した落射蛍光顕微鏡を用いたデジタル共焦点顕微鏡によるスライドを調べる/1.4 計画アポクロマート目的。顕微鏡のソフトウェアに結合するデジタル カメラによる画像を記録。
-
免疫染色や電子顕微鏡
- 6 ウェル プレートで 2 x 106未加工 264.7 マクロファージ細胞を播きます。
- 4% と BCG 感染したマクロファージを修正 PFA 部屋の温度で 4 時間。
- サンプルを PBS で 2 回洗います。
- 4% 低融点アガロースに試料を埋め込むし、70% のエタノールの脱水します。
- アクリル樹脂にサンプルを転送し、50 ° C で重合
- ミクロトームで 60 nm のセクションをカットし、ニッケル グリッドのセクションを収集します。
- 1 時間室温でまたは孵化ソリューション (PBS と 0.1 %bsa) で一晩 4 ° C 10 G/ml アビジン抗体サンプルのラベルし、インキュベーション ソリューション金共役 F(ab')2の超小型ヤギ抗うさぎを洗う部屋で 1 時間 (1/20) を IgG培養液の温度。
- 蒸留水のセクションを洗浄、2% グルタルアルデヒドで染色、乾燥、空気をもう一度、洗浄、電子顕微鏡で調べる。
9. 動物の予防接種と臓器処理
注: すべての手順はバイオ セーフティ キャビネットでされるべきであります。
- パス ビオチン化タンパク質コーティングと細菌 271/2G 針を通して 10 倍単一細胞懸濁液を作成します。
-
1 x 106細菌のエンドトキシン PBS 100 μ l を取り、首の首筋で皮下の C57BL/6 女性なマウスを (- AbH 2 Kb5-6 週齢) を接種します。
- 単独で PBS 100 μ l/マウス コントロールを挿入します。
-
頚部転位続いて CO2吸入による免疫マウス 20 日後予防接種を安楽死させます。
- 脾臓を分離し、RPMI メディアに転送します。
-
5 mL シリンジのプランジャーを 70 μ m セル ストレーナー脾臓をマッシュ アップします。
- RPMI 5 mL で洗浄します。遠心分離機 (800 x g、3 分) 単一細胞懸濁液を分離します。
- マウス ビオチン ビオチン Ter119/赤芽球系細胞 Ab 正の選択キットと赤血球を破壊します。
- 完全な RPMI (10% FCS 1 %l-グルタミン ペニシリン 1%、1% ストレプトマイシン、50 μ M 2 ME) の 10 mL の遠心分離と再中断セルします。
10. 私のb四量体を決定する周波数の抗原特異的 cd 4+ T 細胞と細胞内サイトカイン染色決定周波数の抗原特異的 T 細胞解放サイトカインは、免疫動物の染色
-
四量体染色
- コントロールと免疫マウス (10 の6セル × 20 ~) PE 共役-Abからの脾細胞を染色-OVA323 339テトラマー (1/12.5 希釈) 結合バッファー (2% の FCS と 0.1% ナン3PBS) で 37 ° C で 1 時間。
- 室温で 20 分間脾細胞に AF647 CD4 Ab (1:25) と (死んだ細胞を検出) するため 7 AAD を追加します。
- フローサイトメトリーによるサンプルを分析します。
- テトラマー肯定的なイベントの頻度を決定する CD4 陽性地域で 500,000 個のイベントを取得します。
注: 合計脾細胞によって定義されます SSC/FSC ドットしみ 7 AAD 肯定的なイベントの除外によって生きている細胞および CD4 サブセット AF647 肯定的なイベントのゲートによって。
-
T 細胞抗原特定の細胞内サイトカインの頻度
- 6 ウェル プレート組換え卵子の有無で完全 RPMI 培地 4 mL に転送約 1 × 107脾細胞 (10 μ G/ml)、16 時間インキュベートします。
- さらに 5 時間ブレフェルジン A (1:1, 000) で細胞を治療します。
- PBS であり、次のように染色細胞内サイトカインを洗います。
- 30 分間室温で PE CD8 や PE Cy7 CD4 Ab (1:50 結合バッファーで) 細胞検体を染色します。
- 修正 4% PFA 20 分間室温で。
- 製造元の指示に従って透過ソリューションを使用してを permeabilize します。
- 室温でセルと 20 分間 AF647 共役 IFN-γ Ab (1:50) のラベルを洗います。
- 細胞を洗浄し、上記フロー フローサイトメトリー解析対象します。
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Representative Results
一般的な手順で上記、BCG 表面ビオチン化及びサロゲート抗原 OVA が付いている装飾の可能性を検討しました。当時の変更された BCG 免疫原性in vivoをテストします。細菌の表面は、アビジン キメラ抗原細菌の表現型の検出可能な変更なしの急速な表示のためのビオチンが簡単に付いていた。結果の変更された BCG 抗原提示細胞によって効率的に摂取され、マウスで OVA 特異免疫応答を誘導することができます。
単量体アビジン融合プラスミド ・ タンパク質の生成
単量体アビジン融合蛋白質を作り出すためにゲートウェイ手法に対応する発現プラスミド p17-avi ファイルが生成されました。OVA は p17 avi ファイルにクローンしエシェリヒア属大腸菌に表現し、精製し、refolded前述の通り (図 1)。
ビオチン細菌表面に効率的に接続し、細菌の増殖や生存には影響しません
細菌はさまざまな濃度で付けられました (0-1 mM) ビオチンのと上記のプロトコルに従って表面ビオチン化の効率を調べる染色。フローサイトメトリー解析が 0.5 mM ビオチン (図 2)、ラベルの付いた細菌の蛍光ヒストグラムの総変化を示した、この濃度は、ビオチン化細菌を生成するこの研究を通して使用されました。次に、細菌の表現型の細菌表面改質の効果を検討し、ビオチン化とコントロールが放置を発見 BCG (図 3 a) 8 日間にわたって同様の成長プロファイルを表示します。ルシフェラーゼ (BCG ・ リュック)9を表現する BCG は、マクロファージの細菌の生存を確認する使用されました。48 h. 以上の結果が記録された細菌の生存率を示す発光信号 (図 3 b) ビオチン化と制御細菌間生存率の漸進的な減少のようなプロファイルを示した。結論としては、これらのデータは、その細菌の表面ビオチン化は影響しません細菌の増殖または生存マクロファージ内マクロファージの生存率の増加細菌の病原性の増加を意味することができるので、これは重要を明示します。
細菌の表面装飾の効率
ビオチン化細菌は、前述のプロトコルによると単量体のアビジンとの融合で OVA 抗原ペプチドでコーティングしました。フローサイトメトリー解析は OVA の最小限レベルを示した非ビオチン化細菌へのバインド (MFI 8.31 ± 0.42、図 4 a、上部パネルを =) ビオチン化細菌に OVA の重要なレベルをバインド (MFI = 54.67 ± 4.98) 制御細菌に比べて (MFI = 5.92 ±0.22、図 4 a、下パネル)。
BCG の表面装飾の安定性
従来のライブ BCG ワクチンは乾燥粉末として定式化される、のでこの調査の間に生じた重要な問題だった変更された BCG 凍結乾燥、再構成、およびストレージで冷蔵後や部屋の温度の安定性です。そのため、Avi-卵子の凍結乾燥 BCG Avi-OVA (Avi OVA で飾られた表面) の表面表示を検討しで装飾したての細菌製剤。結果 (図 4 b) 細菌表面に Avi OVA のレベルが証明した新鮮な BCG Avi OVA 準備と比較して部屋の温度で凍結乾燥・後安定して検出可能な 1 ヶ月を残っていることを示したがこの表面装飾方法は、ワクチンの開発に適しています。
大食細胞の表現型は、細菌の表面装飾の影響を受けません。
この表面加飾方法論が宿主細胞への細菌侵入に干渉するかどうかを確認するには、プロトコルを上で説明した貪食分析を実行する RAW264.7 細胞とした DsRed 細菌9を使いました。図 4細菌表面装飾 BCG を示したコーティングされていない野生のタイプ BCG の表面の装飾にマクロファージに影響がないことを示す BCG (24.47 ± 1.18%) に比較して細菌のエントリ (22.5 ± 1.57%) に著しい支障はありませんでした。表現型。
アビジン融合蛋白質は細胞内に旅行し、MHC 分子と共存
マクロファージ内で Avi OVA 装飾 BCG の運命を調べる、付着生細胞感染, 蛍光顕微鏡を用いて上記のプロトコルで説明されているよう.像 (図 5 a) あった Avi OVA だけでなく細菌表面に存在も戸建、転遠い細胞質に細菌に。この結果をさらに確認するには、我々 は実験を染色、免疫を実行、得られる画像 Avi OVA 抗原が唯一 BCG 表面に存在ではないが、BCG 表面からデタッチすることができますもことを明確に示した phagosomal の膜を通過して旅行に向かって細胞質 (図 5 b)。さらに Avi OVA 飾られた細菌抗原提示経路に表面蛋白質貨物を渡すことが可能であったかどうかを調べたり、マクロファージは前述のプロトコルでは、Avi OVA BCG 感染され共焦点の分析を受けます。結果 (図 6 a) は、-A 分子、アビジン融合蛋白質をデタッチして抗原提示コンパートメント II MHC 分子に読み込まれた場所にことを示唆するいると Avi OVA の共存があったことを示しました。また Avi OVA ペプチドが共同でローカライズを示した結果クラス I の分子内 BCG ファゴゾーム染色 H-2_kb (図 6 b) Avi OVA CD8 抗原の潜在的なプレゼンテーションがあることを示したとき+ T 細胞、マクロファージ。これらのデータは、表面修飾したら大食細胞、細菌が入る、抗原が抗原提示経路へのトラフィックを示します。
表面の装飾が施された細菌は完全に免疫原性
PBS 単独で (コントロール)、野生型 BCG で免疫した表面の装飾が施された BCG は特異的免疫反応の生体、 c57bl/6 マウスを誘導することができるかどうかを調べる、BCG、および BCG 遺伝子プラスミドで形質転換を表現する Avi OVA が飾られて、似たような OVA 抗原。免疫マウスが犠牲にされた 20 日後、OVA 特異的 CD4 の周波数+ T プロトコルに従って、細胞とサイトカインを放出 OVA 特異的 T 細胞が検出されました。結果 (図 7 aB) OVA 特異的 CD4 のより大きい割合を示した+と BCG 重量 BCG 遺伝子に比べて Avi OVA でコーティングされた BCG 免疫した動物に T 細胞応答は BCG に同じような免疫応答を示した OVA を表現する変更Avi-OVA (図 7)。これらのデータを示した細菌表面加飾法は抗原の大幅な拡大を誘発することができる特定の CD4+ T 細胞と T 細胞応答誘導の程度、BCG と同様の OVA を表現する遺伝子組み換えに匹敵します。抗原。
さらに式との周波数を決定することにより T 細胞の免疫応答を評価するために細胞内サイトカイン染色 (ICS) 実験を行った細胞内サイトカインは抗原特異的 T 細胞応答の重要な指標でもあるので、OVA に装飾された細菌と細菌のプラスミドを表現する、卵子と遺伝子変換で免疫した動物におけるエフェクター サイトカイン。11細胞内細菌に対する防御反応の知られているインジケーターは IFN-γ リリースのレベルを調べた。OVA 固有 IFN-γ の同じようなレベルを検出することができたことを行った OVA (BCG Avi OVA と BCG p19-Avi OVA) に比べて細菌で免疫した動物で飾られた細菌表面で免疫した動物での+細胞の CD4 を解放遺伝的 OVA (BCG-p19-OVA) (図 8 a) を表現します。重要なは、IFN-γ の有意に高い周波数を検出することができましたまた CD8 を生産と遺伝的 OVA (図 8 b・ C) を表現する BCG 免疫した動物と比較して BCG Avi OVA で免疫した動物細胞の+ T核酸と BCG 変換が効果的に置き換えることができますビオチン-アビジンが抗原の方法論の表面表示を介した例を示します。
図 1: アビジン融合蛋白質の生産のためのプラスミッドのクローニング組換え建設。(A)単量体アビジンのエンコーディング遺伝子セグメント合成制限のサイト NdeI とノッティとし 6 x ヒスチジンと p17 Avi プラスミドを生成するゲートウェイ カセットの間 pDEST17 に subcloned。OVA ペプチド252 345 DNA pDONR221 に複製したattB サイトの終了シーケンス。その後、卵子の遺伝子が subcloned p17 avi。画像編集、PLOS ONE12から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: BCG ビオチン化の効率です。BCG は、NHS-SS-ビオチン、FITC-ストレプトアビジンで標識し、フローサイトメトリーで分析した、室温で 30 分間の様々 な濃度のビオチン標識だった。結果は緑の蛍光性の強度のヒストグラムとして表示されます、挿入グラフは平均蛍光強度 (MFI) 3 の独立した実験から控除の平均 ± SEM を表します。* P < 0.05;* * P < 0.01;P < 0.001。画像編集、PLOS ONE12から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: BCG 表面ビオチン化がその成長やマクロファージで、その生存に影響しなかった。(A) ビオ BCG と野生型 BCG をラベル コントロールの完全な 7 H で栽培された 9 メディア、8 日間にわたってレプリケーションをモニターしていた。結果は成長曲線、すなわち、平均 600 で吸光度として表されます nm ± 3 の独立した実験から SEM の機能として。(B) マクロファージはビオ BCG リュックに感染していたか示されている時間帯は、し細胞ライセートを調製し、細菌を検出する発光のラベルのない BCG リュックを制御します。結果は、光の相対的な単位を意味する 3 の独立した実験から (RLU) ± SEM として表されます。画像編集、PLOS ONE12から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: Avi-卵子ビオ BCG とその安定性へのバインドします。(A) ビオ-した dsRed-BCG (赤い蛍光性を表現する細菌前述9) コントロール非ビオチン化した dsRed BCG 混合されていた、表面染色で評価したバインド 1 h と OVA の程度の室温で Avi OVA とウサギ抗アビジン抗体と FITC ヤギ抗うさぎ IgG (FL1)。サンプルは、洗浄され、フローサイトメトリーで分析しました。結果は緑の蛍光性の強度のヒストグラムとして表示されます、値は 3 つの独立した実験から得られる平均 ± SEM の MFI のビオ-BCG-AviOVA バインディングです。(B) 凍結乾燥ビオ BCG コーティング Avi OVA と焼きたての Avi-OVA-ビオ-BCG されたラベルおよびAで説明したように、フローサイトメトリーで分析しました。表示されるデータは、3 つの独立実験の代表、値は 3 つの独立した実験から得られる平均 ± SEM の MFI の Avi-OVA-ビオ-BCG バインディングです。(C) RAW マクロファージが 37 ° C で 24 時間した DsRed BCG-avi ファイル-OOVA とした DsRed BCG 感染していたサンプルが、洗浄、処理およびトリプシン、修正、および FACS で解析。結果は、赤い蛍光性のヒストグラムは、貪食能の程度を反映として表されます。値は、3 つの独立した実験から得られる BCG 摂取細胞の割合の平均値 ± SEM を示します。画像編集、PLOS ONE12から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: Avi OVA BCG 表面を切り離すし、phagosomal 細胞質膜を交差します。(A) カバー スリップ上付着生細胞が 37 ° C で 24 h の OVA 装飾した dsRed BCG 感染し固定/グリセリンとウサギ抗アビジン抗体と FITC ヤギ抗うさぎ igg 抗体で染色します。サンプルは顕微鏡のスライド マウントされ、デジタル共焦点顕微鏡による分析します。レッド シグナルが BCG の位置を示し、緑信号は、Avi OVA の局在化を反映しています。点線は、マクロファージ細胞境界とパネルに左のパネルに示すように挿入の 4 倍の倍率は、右下を示します。BCG AviOVA 感染した生細胞 (B) 薄片パラホルムアルデヒドで固定アンチ アビジン抗体と金コロイド標識ヤギ抗うさぎ Avi OVA を視覚化する IgG 連続培養し、電子顕微鏡で調べた。12,000 X の倍率が表示されます。矢印を示す Avi OVA BCG 表面から分離ファゴソーム膜を超えてエクスポートします。示されているイメージは、2 つの独立した実験の代表です。画像編集、PLOS ONE12から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: MHC と共局在アビジン融合抗原クラス II およびクラス I 分子。マウスのマクロファージ細胞株 BMA3.1A7 細胞付着性に感染していた OVA GFP BCG (緑の蛍光、前述の9を表現する) 4 時間と装飾で、24 時間の IFN-γ 刺激し細胞が、固定/グリセリンで染色ウサギ抗アビジン抗体、Alexa 594 抗うさぎ IgG と、Alexa 647 ラット抗マウス - A (A) または Alexa 647 ラット抗マウス H-2_kb (B)。サンプルは顕微鏡のスライド マウントされ、デジタル共焦点顕微鏡による分析します。緑の信号が BCG GFP の位置を示し、赤い信号が Avi OVA の局在化を反映しています。青い信号は MHC のクラス II の位置を示すまたはクラス I 分子。点線は、関心のある領域を示します。矢印は、MHC 分子と Avi OVA の共存を示します。示されている画像は、2 つの独立した実験の代表です。画像編集、PLOS ONE12から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7:生体内のCD4+ OVA 装飾 BCG に対する T 細胞応答。C57bl/6 マウスが飾られた OVA、未変更 BCG 野生型、PBS (コントロール)、OVA (BCG p19 OVA) を表現する遺伝子変換 BCG BCG 表面を皮下注射またはコントロールに変換された Avi OVA (飾られたプラスミッドおよび表面BCG-p19-AviOVA)。20 日経過すると、脾細胞を安楽死させた動物の脾臓から調製し、PE 共役-Ab染色-OVA323 339テトラマー (A) は続いて AF647 CD4 抗体と 7 AAD。サンプルが、フローサイトメトリーで分析しました。結果、CD4 の四量体の平均周波数 ± SEM に対する肯定的なイベントを示す 2 つのパラメーターのドット プロットとして表されます+ 2 つの動物グループからの人口。表示されるデータは、(合計六つのマウスを 3 通で評価されるそれぞれのマウスから細胞のサンプルを調べた) 3 つの独立実験の代表です。平均値 ± SEM の OVA 四量体の (500,000 個のイベントの合計) の絶対数のグラフ (B) でデータを表現する、特定の CD4 細胞+の 2 つの動物/グループと 3 つの独立した実験から。* P < 0.05;* * P < 0.01;P < 0.001。画像編集、PLOS ONE12から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: Avi-卵子への応答におけるサイトカインを放出、T 細胞の周波数コーティングされた BCG 予防接種します。PBS、BCG 野生型 Avi OVA、BCG-p19-OVA や BCG p19 AviOVA で飾られた BCG WT 表面の免疫マウスの脾細胞が 16 h ブレフェルジン a. セルで 5 h 期治療続けていた OVA の組換えタンパク質を刺激し、洗浄とPE Cy7 抗 cd4 抗体 (A) または PE 抗 CD8 抗体 (B)、AF647 抗 IFN-γ 抗体染色最初。細胞洗浄され、フローサイトメトリーで分析しました。結果は、パラメーターを 2 つのドットは CD4 の IFN-γ 生産細胞のサブセットの平均周波数 ± SEM を表示するプロットとして表されます+および CD8+ 2 つの動物/グループから集団。表示されるデータは、(合計六つのマウスを 3 通で評価されるそれぞれのマウスから細胞のサンプルを調べた) 3 つの独立実験の代表です。(C) のグラフ内のデータは IFN-γ の絶対数 ± SEM の平均値として表されます CD4 を解放+ T 細胞 (左図) や IFN-γ CD8 を解放+ T 細胞の 2 つの動物/グループと 3 つの独立した実験から (右図)。* P < 0.05;* * P < 0.01;P < 0.001。画像編集、PLOS ONE12から許可を得て転載。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
私たちはこの研究で BCG 面上特異抗原または細菌の免疫原性を効率的に改善するために期待される機能の特定のプロパティを追加する外因性タンパク質の迅速かつ効果的なディスプレイのための非遺伝的アプローチを報告しました。BCG 細胞表面ができる簡単にビオチン標識アビジン融合蛋白質と瞬時の表面装飾のデモンストレーションを行った。形質転換と肯定的なクローンの選択 2 ~ 3ヶ月のタイムラグが必要ですが、2 時間以内合計のプロシージャを実行できます。表面改質は、細菌の増殖や生存には影響しません。サロゲート抗原 OVA 抗原提示経路に抗原を提供することができた、特定の免疫反応で生体内では、 MHC テトラマー染色を含む cytometry 流れの試金によって評価された誘導で飾られた細菌と細胞内サイトカイン染色 (ICS)。もっと重要なは、 vivo の研究は、細菌の表面装飾された BCG エクスプレスと同様の抗原を遺伝子組み換えと比較して免疫応答の同じようなレベルを引き起こすことを示した。
アビジンのビオチンの相互作用は、10−15 M13Kdの自然で知られている最強の非共有結合性相互作用です。生物学研究14で一般的に使用される便利なツールだけではありませんが、また、最近がん療法15,16で適切であることが示されて。本研究ではトリプルの突然変異 (N54A、W110K、N17I) は 4 量体アビジンをアビジン-ビオチンの親和性は著しく減少させ単量体アビジンの形式に変換する野生型アビジンに適用された (Kd= 10−7 M)、バインド元に戻せる状態にビオチン。この単量体アビジンは、ゲートウェイの組み変えの興味の蛋白質のワンステップの急速な表現 (インビトロジェン) をクローニングと互換性のある p17 Avi プラスミドを開発に使用されました。単量体アビジンのこの新しいバージョンには、予防を行う大規模な細菌塊の集約と過渡/リバーシブル細菌表面表示興味の蛋白質のいくつかの利点があります。そのため、宿主細胞が摂取すると、一度 Avi 融合蛋白質からデタッチできますビオチン化細菌やトラフィックの表面細胞内。最後に、突然変異はアビジンを真核生物における酵母や遺伝子組換え植物17,18アビジン融合蛋白質の大量生産のために適用できる非グリコ フォームに変換します。単量体アビジンのこのフォームは、単量体ストレプトアビジン (mSA)19ストレプトアビジンと rhizavidin の両方のシーケンスを高い結合親和性 (10−9 M のKd ) を持っていたバージョンの代わりに選ばれました。mAvidin と比較してください。予備試験と mSA キメラ蛋白質ははるかに低い結合効率を mAvidin キメラ蛋白質と比較してビオチン化細菌にいた。この研究は、したがって、mAvidin に基づいていたが、単量体ストレプトアビジンまたはストレプトアビジン/アビジンの他の形態は、他のアプリケーションのための可能性をまたでしょう。
記述されていたプロトコルの実装を成功させるには細菌表面ビオチン化の生成された融合タンパク質の品質と効率が異なります。Avi ファイルのタグ付きタンパク質の溶出は塩漬け解除する必要があります、適切な分子量タンパク質コンセントレーターを使用して PBS にバッファー交換します。沈殿物が発生するいくつかのタンパク質の高濃度要因したがって、集中係数テスト必要があり、最初に、例えば、20 mL の PBS で希釈した可溶化された封入体の 0.5 を 1 mL で溶出蛋白質の量が少ないを使用して決定濃縮しと。沈殿物を避けるために全体のプロセス中に蛋白質 4 ° C のまわりの温度を維持するために重要です。
細菌表面ビオチン化の効率を向上させる、スルホ NHS SS ビオチンは、4 ° C で暗闇の中で元の容器に格納する必要があります。本試薬は非常に湿気敏感です;したがって、試薬を含むバイアルは、開く前に部屋の温度に平衡する必要があります。また、ビオチン原液 (10 mM) を NHS エステル基を加水分解するので、使用する直前に行った、非常に迅速に非反応性になる必要があります。ビオチン原液できません保存され再利用されます。新しいビオチン バイアルは、すべてのビオチン化実験に必要です。最高の結果を得るには、BCG、新鮮なメディアだけでなく、新鮮なバッファーの新鮮な文化はお勧めします。プロトコルに記載され、ビオチンとコーティングされた BCG 凍結乾燥でき表面のコーティングの品質に影響を与えずに、少なくとも 30 日間保持されます。これは、長いコース実験を行う際の送信やサンプルを 1 つの場所から別に転送する場合、または便利です。
この BCG の表面加飾方法を分析し、迅速かつ正確な方法で新たに開発したワクチン候補の免疫原性を評価する他のエキサイティングな可能性を提供しています。新しい結核ワクチンの主な目的は CD4 など TH1 型細胞を誘導するために+および CD8+ T 細胞 TB に対する保護の重要な役割を果たすこと。本研究で開発されたアビジン-ビオチン システムでは、これらの T 細胞の応答を評価するために非常に有用なツールを提供しています。急速に BCG 表面に組換えタンパク質/抗原を表示するこの斬新な技術を表しますすばやく評価する素晴らしいツールと正確に多くの免疫原性蛋白質 (例えば、分泌される特定のM.tbの予防効果蛋白質)、したがって、効率的なワクチンの開発に翻訳できます。
調整し細菌表面に Avi 融合蛋白質の濃度を変化させる、このメソッドの別の利点はワクチンの有効性を最大化する細菌の表面に興味の異なった抗原を同時に表示することです。BCG 表面に BCG をさらに改善するために 1 つの可能性を飾ることが研究では、BCG がファゴソーム成熟20,21と抗原提示21など重要なマクロファージの機能を妨げることが示されている、ので興味の抗原と共にファゴソーム成熟を加速する知られている要因の組み合わせ。
この技術のいくつかの制限には、低所得者地区でやりがいのある、高価なことができる組換えタンパク質の大量生産の要件が含まれます。また、生産の難しい蛋白質を浄化するためのトラブルシューティングと最適化を必要があります。ただし、組換えタンパク質生産技術の改善を用いるこれらの制限を回避できます。別の制限は、当然のことながら反アビジン抗体研究所動物と人間22で共通がアビジンの治療目的のための使用を妨げる可能性があります可能性を含まれます。ただし、他のラボはアビジン療法の安全性をテストし、アビジンの安全性と効果が大幅に影響されないことその免疫原性23を示しています。興味深いことに、かなり野生型の 4 量体アビジンを単量体のフォームに変換すると、その免疫原性24が減少しました。
要するに、この斬新な技術を介して迅速かつ再現性のある非遺伝細菌表面修飾蛋白質興味の BCG の免疫原性を改善するためにアビジン-ビオチン システム利用は正常に BCG の伝統的な変換を置き換えることができます。プラスミドの抗原エンコーディングします。さらに、この手法のみ現在 BCG ワクチンの改善を促進することができますありませんが、実質的に任意の潜在的な抗原や幅広い bcg、遺伝子を表現する通常難しいタンパク質の迅速な評価のための新しいプラットフォームを提供も結核ワクチン開発のアプリケーション。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
BCG のパスツール株博士 R ストークスと A. Talal のテクニカル サポートに感謝します我々 はまた遺伝子合成を助け GenScript を感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
References
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