Summary
ב פרוטוקול זה, אנחנו מתארים טכניקות ניתוח ראוי תודרנית פרחים, siliques, כמה טכניקות ניקוי בסיסי, ונבחר מכתים נהלי כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.
Abstract
בשל כלי אימתני שלו ללימודי הגנטי המולקולרי, תודרנית לבנה הוא אחד המינים דגם הבולטים ביותר בביולוגיה צמח, במיוחד, צמח הרבייה הביולוגית. עם זאת, צמח מורפולוגי, אנטומי, וניתוחים ultrastructural באופן מסורתי כוללים גוזלת זמן הטמעה חלוקתה הליכים שדה בהיר, סריקה של מיקרוסקופ אלקטרונים. התקדמות אחרונים במיקרוסקופ קונפוקלי פלורסצנטיות, המדינה-of-the-art תלת-ממדי בעזרת מחשב מיקרוסקופיים ניתוחים ו עידון רציפה של טכניקות מולקולריות כדי לשמש על דגימות כולה-הר מינימלית מעובד, הוביל לביקוש מוגבר פיתוח טכניקות עיבוד מדגם מינימלי ויעילה. פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות ניקוד כראוי תודרנית ופרחים, בסיסי ניקוי טכניקות, siliques, כמה הליכים מכתימים עבור כולה-הר תצפיות מבני הרבייה.
Introduction
פרחים בין החשובים ביותר מגדיר את האיברים של angiosperms. צמחים פורחים הופיע לפני כמה שנים 90-130 מיליון1, ואת המגוון כל כך מהר כי הופעתם מהירה תוארה "תעלומה הזוועה" מאת צ'רלס דרווין2. האינטרסים של חוקרי הצמחים בהתפתחות פרחים מגוונים. מחקר התמקדה הבנת המקור האבולוציוני של הפרח כולו, או את האבולוציה של תכונות אנטומיות מבניות, פונקציונלי ספציפי של פרחים3,4,5,6 . וריאציית גבוהה ב טופס פרחוני, מבנה, כמו גם את דרכי רבייה אל-זוויגית ופוגע להסתמך עליהם, להפוך הפרח מבנה מורכב מאוד. זה הוביל במאמצים מגוונים לאפיון התכונות אנטומיה מבניים איברים פרחוני, תוך שימוש בטכניקות microscopical אלקטרון ואור זה יכול להיות משולב עם חקירות גנטית ומולקולרית7. יתרה מזאת, כמקור של פירות וזרעים, פרחים הם בחשיבות עליונה על תזונת האדם ושל בעלי החיים. לכן, אפיון ופיתוח פרחים ופירות יש השלכות רבות על מחקר יישומי, כולל מזון אבטחה עבור אוכלוסיה אנושית וגובר ואסטרטגיות שימור אקולוגי תחת סביבה משתנה8 , 9 , 10.
פיתוח פרח תודרנית מתחיל עם פרח אינדוקציה, הטרנספורמציה של meristem וגטטיבי כדי meristem תפרחת (קבוצה של פרחים). פרח primordia מבוצעים רוחבית לאגף מ meristem תפרחת11. Primordia איברים פרחוני בהדרגה בצורה המעגלים הקונצנטריים מבחוץ אל מרכז הפרח, ובסופו של דבר לפתח לתוך עלי גביע, עלי כותרת, אבקנים, carpels7. אלו איברים פרחוני להגשים הגנתי התזונתי, ברורים, ואת פונקציונלי (למשל, המשיכה המאביק) תפקידי מיני צמחים שונים, עם איברי המין סופגת את התפתחות gametophytes זכר ונקבה, בהתאמה12 , 13. gametophytes, בתורו, להבדיל כל זוג של זכר (זרע) ולהכפיל גמטות הנשי (ביצה, תא מרכזי), אשר התאחדו על הפריה כדי ליצור את הדור הבא של הזיגוטה, את האנדוספרם העיקרי, רקמות מסוף המשנה התפתחות העובר ה-14,15. פיתוח זרעים ופירות תומכת צמיחה, התבגרות, שימור העובר ופיזור, בסופו של דבר, שלה. מחקר מקיף בוצעה כדי לאפיין את הפרחים והתפתחות העובר במיני צמחים שונים, במיוחד במינים דגם תודרנית7,16,17.
ניתוחים מיקרוסקופיים מוקדם של התפתחות פרחים היו מבוססים על מדגם גוזלת זמן עיבוד והתבוננות טכניקות, כמו פרפין או שרף הטבעה ו חלוקתה, בשילוב עם אור או מיקרוסקופ אלקטרונים. טכניקות אלה מיקרוסקופיים מסורתי שימשו לעיתים קרובות בשילוב עם חקירות הגנטי המולקולרי, כגון ניתוחים microscopical של מוטציות, הלוקליזציה של RNA על ידי הכלאה בחיי עיר או חיסונית-זיהוי חלבונים. התקדמות אחרונים במיקרוסקופ שדה רחב וקונפוקלי פלורסצנטיות, התמונה בעזרת מחשב תלת-ממדי המדינה-of-the-art ניתוחים, עידון רציפה של שיטות מולקולריות שניתן להשתמש בהם על דגימות כולה-הר מינימלית מעובד, הוביל צורך טכניקות עיבוד מינימלי ויעילה מדגם נתונות מעדיפים כמותני. בשנים האחרונות הפך התקדמות משמעותית בפיתוח טכניקות ניקוי על הדגימה בעלי חיים שלמים-הר. הם לעיבוד המדגם שקוף באמצעות מימית אוריאה - או סוכר מבוססי ריאגנטים (למשל, קנה מידה, SeeDB, מעוקב)18,19,20, או על ידי באופן סלקטיבי הסרת שומנים (באמצעות הנוזל מרחביות) לאחר הטבעה דגימות ב hydrogels יציב; הסרת שומנים יכולה להיות מושגת באמצעות דיפוזיה פסיבית (שונה,למשלפרוטוקול בהירות21, ברית-PARS-חישוקים22) או באופן פעיל על-ידי אלקטרופורזה (בהירות המקורי פרוטוקול23 ו מעשה-פרסטו24). בעידודה של התקדמות מהירה זו, כמה טכניקות נגזר גם מתגלים לשימוש בצמחים.
בנייר זה שיטות התמקדו המודל תודרנית, נתאר ההליך את הקרע הנכון של ניצני פרחים, פרחים, siliques צעיר, קרחת היער של דגימות כולה-הר עבור צביעת מגוונות ונהלים התבוננות באמצעות קלאסית או שיטה סליקה מבוססי מרחביות האחרונות. דוגמאות עמילן, callose של כרומטין מכתים ניתנת. אף על פי נהלים אלה עליך בהמשך שיפורים והתאמות בעת שימוש עם מינים אחרים, אנו מקווים שהם יהיה להגדיר את הבמה עבור מחקר נוסף על שיטות אלה פשוט אבל קריטיים המהווים נקודת ההתחלה של פרויקטי מחקר רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פרח, קיבוע Silique
- Siliques מצמחים ופרחים הקציר מסונכרנים בטקס הפתיחה של הפרח הראשון.
הערה: בתנאים ניסיוני המשמש כאן, להתחיל צמחים פורחים כ 21 ימים לאחר ההשתלה של צלחות Murashige ו- Skoog (MS) אל הקרקע. זרעים מרובדת במשך 3-4 ימים ב 4 ° C, מונבטים/גדל על צלחות MS-22 ° C/16 שעות אור ו- 18 ° C/8 h כהה במשך 8-10 ימים, לפני משתילים את השתילים באדמת עשירות בעציצים תחת באותם התנאים (איור 1). המספר של משכפל תלוי המטרה מחקר ספציפי, אך מומלץ מינימום של התפרחות 5 (מ 5 צמחים בודדים) עבור כל טיפול. אם הפרחים יחידת ניסויי, מומלץ מינימום של 10 פרחים לכל שכפול. - התפרחות או פרחים (איור 1E-H) באמצעות מספריים קטנות (למשל, מספריים לציפורניים) ולמקם אותם מיד צינור microcentrifuge (עבור קיבוע תפרחת/פרח יחיד) או צינור חרוטי (עבור הקיבועים קולקטיבית) המכיל טרי גרם של Carnoy, חומצה אצטית/מתנול או כתות ומייצבים FPA50 (בהתאם ליישום, ראה להלן) על קרח.
הערה: דוגמאות צריך להיות לגמרי שקועים מקבע. - להשאיר הריקמה שבתוך מקבע במשך 4 שעות ללון ב 4 º C.
הערה: חדירת אבק יכול לשמש לצורך זירוז חדירת מקבע לתוך הרקמה, אך ייתכן שהדבר מזיק שמירה על המבנה של הרקמה. המחברים לא מיישמת הסתננות ואקום. - הסר את מקבע, הוספת אתנול 70% מספיק כדי לכסות את הדגימות, ולהחזיר אותם עד 4 ° C לפחות 24 שעות; דוגמאות יכול להישאר ללא הגבלת זמן בפתרון זה. לאחר הסרת אתנול, פנה מיד אל השלב הבא; ניתוח או ניקוי מרחביות.
2. ניתוח תחת Stereomicroscope
- לשים ומדברי 70% אתנול בכוס של יוצר השעון מניחים על צלחת פטרי קטנים לקבלת תמיכה.
-
המקום תפרחת/הפרח/silique על זה טרי עשה מקבע ומנתחים תחת stereomicroscope באמצעות מלקחיים מזרק עם מחט.
- שימוש של יצרנית שעון זכוכית או התקן דומה המאפשר את הדוגמאות כדי להיות מכוסה לגמרי עם אתנול (מומלץ) עבור ניתוח התפרחות, ועבור קורע איברים פרחוני של פרחים בוגרת (עלי גביע, עלי כותרת, אבקן יכול להיות גזור בשלב זה ) כדי למנוע את הסיכון של דגימות מתייבשת.
-
לנתח siliques, ניצני פרחים קטנים בשקופית כמתואר להלן.
- לשים בצד של היוצר שעון הזכוכית עם דגימות מעובד מראש ולהשתמש שקופית רגילה של החתך האחרון.
- להעביר את הדגימה עניין לשקופית ולהוסיף 10 µL של אתנול 70% טרי. לעבוד במהירות על החתך האחרון ולהוסיף 10 µL של אתנול, במידת הצורך, כדי לשמור את הדגימה לחות ללא נוזל מוגזמת.
- ולשחרור גרגרי אבקה מן האבקנים, ראה שלב 5.1. ניקוד carpels ו- ovules, בצע את ההליך המתואר באיור2. הליך זה חל על כל שלבי התפתחות שחלה, כולל בשלב ההתפתחות של siliques ירוק.
הערה: לא להוסיף אתנול אם יש מספיק carry-over אתנול מלעבור את הדגימות; לנתח דגימות קטן מאוד קל בהרבה בכמות מינימלית של נוזל. תמיד לשמור רק את האיברים של עניין (עלי גביע, עלי כותרת, אבקנים, carpels, ovules, זרעים או גרגרי אבקה) בשקופית. הליך זה יבטיח עובי אחיד בין שקופיות coverslip, התואם העובי של האיבר תחת בדיקה, וכתוצאה מכך הומוגניות גבוה יותר, ולכן יעילות עבור בדיקות מיקרוסקופיות (מספר גבוה יותר של דגימות היעד באותו מוקד מישור).
- השתמש חתיכה קטנה של נייר סופג כדי לספוג ולהסיר כמה שיותר אתנול ככל האפשר. במהירות להמשיך לשלב הבא (סעיף 3, 4 או 6) לפני מדגם מתייבש החוצה.
3. קלוראל-הידרייט המבוסס על חישוף, מכתים סליקה משולב
הערה: התוצאות הטובות ביותר עבור סליקה מבוססי קלוראל-הידרייט מתקבלים עם FPA50 קבוע חומר.
- מקום 20 µL ניקוי פתרון (קלוראל-הידרייט/גליצרול, שונה בינוני של שותפה עסקית, 4½ של אדון או איקי-4½ פתרונות של אדון) בשקופית מניבי הדגימה. באמצעות זוג מזרקים עם מחטים hypodermal, מקם את דגימות כנדרש על ידי הפחתת שביניהם, סובבי אותם איפה האיבר עניין פונה כלפי מטה. הסר את כל בועות האוויר הנותרים בעזרת המחט.
- הנמך את coverslip על הצד בעדינות למקם אותו, לחיצה בעדינות ו לחכות עד הפתרון סליקה ממלאת את הרווח בין. להוסיף פתרון סליקה מינימלית, במקרה הצורך, כדי למלא את החלל כולו תחת coverslip.
- מניחים את השקופית על בעל שקופית ולהשאיר את זה מתחת למכסה המנוע fume. המשך תצפיות מיקרוסקופיות לאחר לפחות 4 שעות, במהלך הימים הבאים 4 – 5.
4. בשילוב אלכסנדר מכתים, ניקוי 4½ של הר של פורים
הערה: פרוטוקול אלכסנדר המקורי מבוסס על שחרור גרגרי אבקה על השקופית לפני צביעת. יעיל ואינפורמטיבי יותר, שונה אלכסנדר מכתים ולניקוי הליך זה ההכתמה של בוגר גרגירי אבקה בתוך פורים בוגרת אבל ללא dehiscent.
- לבחור ניצני פרחים שנקטפו זה עתה על מנת לפתוח עם פורים dehiscent.
הערה: לא לקחת ניצני פרחים הצעיר כי אלכסנדר מכתים מיועד בוגרת גרגירי אבקה, אינו מכתים ביעילות גרגרי אבקה לא בוגר. מומלץ מינימום של 5 פרחים לכל טיפול שנקטפו התפרחות וצמחים שונים. - להכין צלחת 96-ובכן פתרון של אלכסנדר מספיק. להציף ניצן של פרח. לחשוף את פורים על-ידי הסרת את עלי גביע, עלי כותרת, לטבול אותם בפתרון של אלכסנדר. שומרים את הדגימות מתחת למכסה המנוע fume עבור h 1 – 3.
- להחליף את הפתרון של אלכסנדר עם פתרון 4½ של אדון ולמקם את הצלחת רב טוב בחזרה מתחת למכסה המנוע fume עבור דגירה לילה.
- באמצעות מלקחיים, להניע בעדינות את ניצני פרחים שנוקה על שקופית חדשה. מאז כמה carry-over של הפתרון של אלכסנדר עלולה להתרחש, להשתמש בנייר סופג כדי להסיר כמה שיותר פתרון סליקה ככל האפשר.
- האבקנים לנתח ולהסיר כל רקמות אחרות. בצע את השלבים בסעיף 3 באמצעות פתרון 4½ של הר.
5. הסרת Exine את גרגרי אבקה
הערה: מומלץ להשתמש לשבועיים של Carnoy עבור צביעת דאפי.
- בצע את ההליכים קיבעון, דיסקציה שמתואר בסעיפים 1 ו- 2. עד עכשיו, אחד צריך אחד כדי האבקנים רבים בשקופית בתוך סכום מינימלי של 70% אתנול.
- להשתמש בנייר סופג כדי להסיר עודפי אתנול, ולהוסיף 5 – 10 µL של דאפי פתרון. באמצעות כמה מזרקים עם מחטים, שחרר את גרגרי אבקה בתוך זה כמות קטנה של פתרון (למשל, שימוש במזרק אחד על מנת לשתק את האבקן והשני כדי לשחרר את גרגרי אבקה). להוסיף עוד 5 µL של דאפי אם הפתרון מתייבש.
- הסרת כל פסולת של האבקן הוא שלב קריטי, כזה רק גרגרי אבקה נותרו בין השקופית את coverslip.
- במקום coverslip בשקופית מניבי הדגימה על ידי הורדתו לצדדים ולהוסיף את כמות מינימלית של דאפי הפתרון הנדרש כדי למלא את החלל. במקום של האצבע המורה על coverslip, בלי מועך גם הרבה תפני מהר, המשרד, וקצר התנועה החלקה.
הערה: כדי לאמוד את הכוח הדרוש ואת משרעת של התנועה הזזה, שלב זה צריך להיות מתורגל מספר פעמים, בדיקת התוצאות בכל פעם תחת המיקרוסקופ. - הוספת פתרון דאפי במידת הצורך ולשפר את המקום שהשקופית בקופסה לח בחושך ב 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות 1 ח' להמשיך להתבונן דגימות תחת שדה רחב זריחה או מיקרוסקופיה קונפוקלית בתוך ה 24 מנסים לשלב הליך זה עם מרחביות ניקוי כדי לבדוק אם נוספת ניתן להשיג את הקצאות.
6. נתרן גופרתי Dodecyl (מרחביות) ניקוי
הערה: בהתאם האיבר פרחוני כדי להיות מנותח, על המיומנויות של החוקר לנתח דגימות מאוד רך וקטן, הטיפול מרחביות יכול להתבצע גם בעבר (עבור חוקרים מנוסים) או לאחר הקרע צעד (עבור פחות מנוסים חוקרים) על חומצה אצטית-מתנול קבוע חומר.
- השתמש הזכוכית של מכונת watch, שקופית קעורה או צינור microcentrifuge כדי דגירה דגימות ביתור או שאינם גזור ב 1% מרחביות והפתרון 0.2 N NaOH ללילה בטמפרטורת החדר.
- לטפל כי המדגם הוא רך מאוד ובעל מראה שקוף. לשטוף מספר פעמים עם מים.
הערה: שרידי הפתרון מרחביות עלול להוביל משקעים בעת הוספת מכתימים הפתרון, למשל, אנילין כחול. - לקבלת דוגמאות ללא-גזור, בצע את ההליך לנתיחה המתוארות בסעיף 2, באמצעות מים במקום 70% אתנול. לאחר לנתח את הרקמה הרצויה, להסיר את כל שאריות פסולת ואת כל המים העודפים עם נייר סופג, ולאחר מכן להוסיף 20-40 µL של פתרון מוכתמים, להמשיך עם שלב 6.5.
- לקבלת דוגמאות גזור, בזהירות להעביר את הדגימה הפתרון כביסה למקם אותו לשקופית נקי ו להוסיף 20-40 µL של פתרון מוכתמים.
- הנח בעדינות coverslip בשקופית על-ידי הורדת אותו לצדדים. הקפידו לא למעוך את ההכנה. אם הרקמה רכה מדי, במקום כל דק המפריד בין השקופית את coverslip בפינות שלו (למשל, קלטת או של coverslip שבורים), משאיר רווח קאמרית כמו בין שקופיות coverslip, כך coverslip לא לרסק את הדגימה.
- מקם כל השקופיות בתוך קופסה לח, לכסות אותו ברדיד אלומיניום, ומקם אותו ב 4 ° C לפחות 1 ח' להמשיך להתבונן הדגימה באמצעות קרינה פלואורסצנטית widefield או מיקרוסקופיה קונפוקלית בתוך 24 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תודרנית שייך למשפחת Brassicacea, הנושאת את התפרחות עם פרחים דו מיניים מסודרים בתפרחת (איור 1). כל פרח יש ארבעה עלי גביע, 4 עלי כותרת, 6 אבקנים (ארבעה ארוך וקצר שני), שחלה syncarpous המורכבת carpels שני מלידה מאוחה (איור 1F-H) מסודרים ארבעת המעגלים הקונצנטריים25,26. תודרנית יש tenuinucellate, ovules anatropous מסודרים הקודקודית placentation בשתי שורות (12-20 ovules בכל שורה) בתוך כל אחת locules שני של השחלה (סך של 45-80 ovules) (שלא פורסמו נתונים, הפניות27, 28 , 29 , 30)-כדי לבצע ניתוח השוואתי חזקים של פרח והתפתחות העובר בתוך צמח יחיד או בין צמחים שונים (כמו משכפל או טיפולים), רצוי להשתמש הפרח פתוח הראשונה כהפניה (איור 1B). בשלב זה, התפרחת (איור 1E) בדרך כלל יש בין 20 ל 30 ניצני פרחים פורש בכל שלבי ההתפתחות פרח, ו בשלבים בערך דומה אצל אנשים אחרים (נתונים שלא פורסמו). יהיה יזם יותר meristems פרח (ויוצרים בין 5 ל 20 פרחים) על ידי meristem תפרחת לאחר פתיחת הפרח הראשון. הפרחים הראשון שני עלול להראות ליקויי פוריות ו, ומכאן, שאין לכלול בניתוח.
ניקוי תודרנית פרחים ואיברים פרחוני באמצעות מבוססי קלוראל-הידרייט סליקה פתרונות31,32, כולל 4½ של אדון ניקוי פתרון33, בדרך כלל הוצא להורג בעוון (ניגודיות התערבות דיפרנציאלית DIC) ניתוח מיקרוסקופי של פרח, silique, העובר ופיתוח (איור 3 א-J). הפתרון 4½ מומלץ במיוחד עבור ניתוח התפתחות אבקן ועבור האיברים הדורשים יכולת ניקוי חזק יותר. כמה פתרונות מבוססי קלוראל-הידרייט משמשים למטרה כפולה של ניקוי ולאחר מכתים בעת ובעונה אחת; זהו המקרה של אלכסנדר המקורית34 ופתרונות של מר איקי-4½35,36 . אלכסנדר מכתים נמצא בשימוש נרחב תודרנית להעריך אבקה הפלה. אלכסנדר ששונה ואינפורמטיבי יותר להכתים הליך37 הוא מכתים כל פורים המכיל גרגירי אבקה בוגרת. הליך זה דורש קרחת האחורי המאבקים באמצעות הפתרון של הר 4½ (איור 3 K-L). טכניקות צביעת אחרים המשמשים מינים שונים עשוי לספק אומדן טוב יותר של אבקה הכדאיות (למשל, התגובה fluorochromatic באמצעות diacetate fluorescein, צביעת callose, עמילן, DNA ו RNA של בדיקות אנזימטי באמצעות חמצון-חיזור צבעי)38,39,40. עם זאת, רוב שיטות אלה להעריך היבט מסוים של תבואה אבקה זה אולי לא בהכרח לתאם עם האבקה ופריון, חשוב, אבקה. הערכה של יכולת נביטה אבקה, ואת יכולתו אפקט הפריה והגדרת זרעים ייתכן38–מדויקת יותר40. הליך פינוי מכתים הרבה פחות בשימוש היא איקי-4½ של מר, המשלבת פתרונות ניקוי מכתים עמילן. מלבד צביעת עבור עמילן (איור 4), הליך זה יכול לשמש למטרות ניקוי כללי בכל פעם חדות גבוהה היא הצורך (למשל, איור 3A, E).
שילוב של auramine calcofluor משמש הצמח רבים מינים41 בו-זמנית עלול להכתים את האבקה exine ו- intine (איור 5A). רוב אלה ואחרים צבעם מכתים רכיב סלולרי אחד, ומכאן, אמור לשמש בשילוב עם טכניקות תיוג ישירה יותר כגון גאס או קווים סמן מתויג fluorescently, נוגדנים או הכלאה בתוך באתרו . הם עשויים להציג גם מרובים עירור, ספקטרום הפליטה. . דאפי, לעומת זאת, יותר ספציפי, משמש בדרך כלל כדי כתם כפולות כרומטין, כרומוזום42 במהלך המיוזה, בצע אבקה פיתוח43, מלבד וביישומיה סעפת כמו counterstain עבור הגרעין. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להגדיל את עוצמת מכתימים כדי לקבל תצוגה מפורטת יותר של כרומטין הזרע ואת הגרעינים וגטטיבי על-ידי הסרת מכנית של exine (איור 5B-C). טכניקה זו אמנם מאוד מועיל עבור אלו המעוניינים בביצוע ניתוח מפורט של כרומטין, כרומוזומים ומבנה גרעינית, הסרת מכני exine עשוי להשפיע על הארגון התבואה אבקה, כך התוצאות להיות לפרש בזהירות.
רוב צבעי פלורסנט אלה משמשים ללא פינוי מוקדמת של הרקמה; אך במקרים מסוימים, הם תואמים את ישבנה ניקוי על שקופית44מבוססי קלוראל-הידרייט. מרחביות ניקוי לאחרונה שימש בתור ניקוי ריאגנט במחקר מהחי והצומח, הוכח להיות תואם עם הליכים שונים מוכתמים widefield פלורסצנטיות, מיקרוסקופיה קונפוקלית (mPS-פיי45 צמחים, בהירות23, ברית22 או מעשה-פרסטו24 בבעלי חיים). באמצעות מרחביות-NaOH ניקוי לפני אנילין כחול מכתים (איור 5D-H), הצלחנו להשיג נגישות גבוהה יותר רקמות פנימיות, כמו גם יותר-צביעת עבור callose בתוך רקמות פרחוני (איור 5I-L). תוצאות דומות התקבלו עבור calcofluor (נתונים לא מוצג).
איור 1: תמונות של פרחים וצמחים תודרנית . (י-ם) תודרנית צמחים בשלבים שונים של מחזור החיים: רוזט לפני הפרגה (A), בפתיחה פרח הראשונה (B), עם ראשי ו מספר התפרחות משנית (C) ו בסוף הפריחה (D). (E) בתפרחת אופיינית של תודרנית תפרחת עם פרחים בשלבים התפתחותיים שונים, התבגרות acropetally. (F-H) פרח תודרנית ב anthesis, הממחישות self-pollination (אבקן לגעת הסטיגמה ושחרור גרגרי אבקה). דמויות E-H הם המוקד ערימות של 36, 53, 42 ו 32 תמונות, בהתאמה, באמצעות כלי תוכנה (למשל, הליקון המוקד). F-H מייצגים אותו הפרח איפה עלי גביע אחד, שני עלי הכותרת, אבקן קצר הוסרו ב- H. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: כיצד לנתח שחלה, ovules. (1-3) המקום שחלה בשקופית עם כמות מינימלית של 70% אתנול וביו -מיקום הידיים כפי שהיא מתוארת בציור. הופכים את גזירת הבאות 1-3 כיווני שצוין על-ידי החיצים האדומים. השתמש את המחט עם הפתח הפונה כלפי מעלה, הרחק את ovules חתכים 2-3. (4-6) לסובב את שחלה 180 מעלות כפי שמוצג, הבנאים 4-6 כמו החתכים הראשונים. (7) הסרת המסתמים: להשתמש המחט עם פתיחת מופנות כלפי מטה להניחה מתחת ovules, להחליק את המחט במהירות ימינה לאורך השוליים שסתום. עבור carpels גדול (anthesis ואילך), או עם כמה מומחיות לנתיחה, אחד יכול להחליף שלב זה על-ידי וחזור על שלבים 2 ו- 5 בצד השני של שחלה. (8-9) להסיר את הסטיגמה בסגנון, את עוקץ עם שארפ חותך באמצעות המחט עם פתיחתו הצידה ולא הרחק ovules. (10) הפוך קטן חדה לחתוך על הרקמה שידור רמת באחד שתי הקיצוניויות. (11) השתמש המלקחיים את המחט כדי להפריד את שני החצאים. (12) בעדינות בעזרת המלקחיים את המחט, הפוך שורה אחת של ovules כדי להשיג שתי שורות מקבילות. לחלופין, במקום שתי שורות אנכית עם replum שוכב מעל ודחף בעדינות כלפי מטה לאורך replum כדי להפיץ את שתי השורות ביצית משני צדדיו. שניים משוטחים אבל עדיין מחוברת שורות של ovules לאחר ניקוי ולאחר מכתים עם הפתרון של איקי-4½ של אדון מוצגים איורים של התוצאה של הקרע. גודל ברים = מיקרומטר 80 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: סליקה מבוססי קלוראל-הידרייט עם או בלי צביעת במהלך הפיתוח פרח. (א) א צעיר פרוח ניצן. (B-E) אבקן הפיתוח עם אמא microspore תאים בציטוקינזה (B), tetrads של microspores (C), אבקה מיטוזה גרגרי אבקה (D), tricellular (E). (F-J) שחלה המכיל ovules עם megaspore אמא תאים (חץ) לפני המיוזה (F ו- G) ובמהלך meiotic prophase אני (H), עם שק העובר binuclear (חץ) (אני), ועל ההפריה (J). הערה את עקבות צינור אבקה (חץ) בתוך האזור micropylar של שלייה, J. (K-L) אלכסנדר ששונה הוא מכתים של פורים עם מלא (K) או מופחתת הכדאיות אבקה עקב עומס חום (L). הערה את הציטופלסמה ריק והצורות לא סדיר של גרגרי אבקה מופלים בתוך locules בצרכן בל' תודרנית פראי-סוג Col-0 הצטרפותן. ניקוי או צביעת: 4½ של אדון עבור B-D ו- F-J, אדון של איקי-4½ עבור A ו- E, ושינית את אלכסנדר צביעת עבור K-L. גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: עמילן dynamics ובמהלך פרח מוקדם זרע פיתוח. נציג תוצאות הממחישות תחלופת עמילן דינמי במהלך הפיתוח פרח. (A-C) הגל השלישי של עמילן amylogenesis/amylolysis במהלך השלבים האחרונים של פיתוח אבקן תיאר לאחרונה39. (D-G) התוצאות נציג של הגל עמילן ייחודי את התבואה אבקה לשיא של amylogenesis בשלב bicellular. (H-N) התוצאות נציג של עמילן דינאמיקה של ovules בשלב megaspore אמא תא (H), בפיתוח הנשי gametophytes (קיי-K), במהלך התפתחות מוקדמת של זרע (רק לאחר ההפריה ב L, האנדוספרם binucleate ב M , octant עובר שלב ב- N). Col-0 פראי-סוג תודרנית להצטרפות לאיחוד. גודל ברים = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: כמה קלאסית מכתים נהלי פלורסצנטיות מיקרוסקופ ואת השפעת מרחביות-סליקה. (א) Calcofluor-Auramine מכתים במהלך ההבשלה אבקה איפה intine הוא מוכתם כחול (calcofluor), exine ירוק כהה (Auramine). (בג) הסרה מכנית של exine, דאפי מכתים של גרגרי אבקה tricellular. (ד-ה) תמונות נציג תפרחת לפני (ד, כפי התאוששה מקבע) ואחרי מרחביות ניקוי (E-H). הערה את השקיפות של הרקמה המאפשר התבוננות להערכת בתוך הגזע תפרחת (G), את עוקץ וניצן (H). (-J) צביעת עבור callose ב microspores בשלב דטרמיניזם בתוך האבקן כחול אנילין. השווה את הבהירות ואת עוצמת ההכתמה בין הלא-זמנים תוססים מסומנת לפלט (אני), את בצרכן מרחביות-והפנים (J). (K) כחול מרחביות-והפנים, אנילין בצרכן ויטראז'ים עם microspores במהלך אבקה מיטוזה א הערה את synchrony של גרגרי אבקה רבים בשלב זה locules שני אלה. כחול מרחביות-והפנים, אנילין (L) מוכתם ביצית לאחר ההפריה. שימו לב callose מכתים את שרידי הנביטה, קליפת הזרע. Col-0 פראי-סוג תודרנית להצטרפות לאיחוד. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר (A-C, I-L); 1 מ מ (D-H). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קיומו של ניצני פרחים רבים בתוך תפרחת בודדת של תודרנית, המתפרסות על-פני כל שלבים התפתחותיים של פרח, מציע הזדמנות ייחודית ללימודי מכוון אפיון אפקט של טיפול או תכונה התפתחותית בו זמנית על פני בשלבים שונים של פיתוח פרח. נקודת התייחסות טובה בין מיני צמחים בודדים הוא פתיחת הפרח הראשון של התפרחת הראשי. צמחים מטופלים בצורה כזאת, כי הפריחה מסונכרנים ככל האפשר (למשל, 3 – 4 ימים ריבוד ב 4 ° C הגדלת נביטת הזרעים סינכרונית, ולכן אפילו יותר פריחה), וצמחים רק לפתוח את הפרח הראשון שלהם באותו יום הם נלקח כאצווה להפיץ בין טיפולים ומשוכפלת; אצוות מוכן על ימים רצופים יכול לשמש כדי לשכפל את הניסוי. בעקבות ההליך הזה, ניתוח השוואתי עמידים יותר, שליטה על וריאציות סביבה התפתחותית בתוך ובין צמחים, ניתן לבצע.
שילוב הכתם של Lugol עם פתרון סליקה של אדון אפשרה לנו לא רק כדי לשפר את הניגודיות בדגימות שנוקה לעומת פתרונות סליקה קלאסי, אלא גם כדי לאפיין dynamics עמילן במהלך התפתחות העובר פלאוואר, דיווחו לאחרונה עבור תודרנית 46. באמצעות הליך פשוט, הצלחנו לפענח את קיומו של גל חדש של עמילן amylogenesis-amylolysis במהלך הפיתוח בצרכן, וכדי לתאם עמילן dynamics עם שינויים כלליים לביטוי של גנים מעורבים קידוד חלבונים חילוף החומרים עמילן וסוכר. ניתוח זה הראה כי GPT6 הוא translocator של סוכר-פוספט מ ציטוזול כדי amyloplasts של עמילן סינתזה. התוצאות המפורטות בדינמיקה עמילן ברקמות שונות פותחת את האפשרות של אפיון אחרות הגנים החשובים בחילוף החומרים עמילן, וכדי לטפל שאלות לא פתורות בנוגע פחות למדה, אבל חשוב שלבי התפתחות הצמח. יוד מבוססי עמילן מכתים אינה כמותית, יש השלמה עם שיטות אחרות46.
מחקר מחפש שיפור ניקוי נהלים התואמים למיקרוסקופיה פלורסצנטיות החריפה בשנים האחרונות, בעיקר בתחום בעלי חיים. למרות מחקר צמח השדה נמצא בפיגור, ניקוי במידה רבה מסתמך על פתרונות סליקה מסורתי לניתוח DIC (למשל, פתרונות מבוססי-הידרייט, בנזיל בנזואט, dibutyl פתלאט, אינדיקטורים)31 ,33,47,48, בעידודה ההתקדמות מהירה בתחום בעלי חיים, כמה טכניקות דומות מתגלים באמצעות אוריאה - (למשל, ClearSee49 ועוד50), ו 2, 2' thiodiethanol מבוססת על ניקוי הליכים51,52. כאן, אנו מראים כי השימוש של הנוזל מרחביות בשילוב עם NaOH מעבד את הרקמה שקוף ומשפר את כמה קרינה פלואורסצנטית קלאסית מכתים כמו אנילין כחול עבור callose ו- calcofluor עבור תאית. בהתבסס על תוצאות מבטיחות אלה, התקדמות דומה להסרת סלקטיבי מבוססי מרחביות ליפידים ניתן לצפות בשטח המפעל בעתיד הקרוב. מאז תאי צמחים יש קירות התא נוקשה נעדרים בתאי בעלי חיים, ראש המנזר הטבעה ב hydrogels לא יהיה הכרחי, כמו במקרה של בשביל לרקמות חיות. צבעי פלורסנט ו fluorophores המשמש סמן גנטי קווים אחרים עשויים להיות לבדיקה באמצעות הליך פינוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת ציריך, הפורום הישראלי לאנרגיה מארי קירי גרנט (מענק. לא. TransEpigen-254797 אל A.H.), גרנט מתקדם של המועצה האירופית למחקר (מענק. לא. MEDEA-250358 אל U.G.), ומחקר ופיתוח טכנולוגיה פרוייקט (גרנט MecanX כדי U.G.) מ- SystemsX.ch, היוזמה שוויצרי במערכות ביולוגיות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Materials | |||
| Ethanol | Scharlau | ET00102500 | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Methanol | Scharlau | ME03062500 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Glycerol | Roth | 3783.1 | |
| Gum arabic | Fluka | 51198 | |
| Lactic acid | Fluka | 69773 | |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution) |
| Clove oil | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xylene | Roth | 4436.1 | |
| Iodine | Fluka | 57665 | |
| Potassium iodide | Merck | 5043 | |
| Malachite Green | Fluka | 63160 | |
| Fuchsin acid | Fluka | 84600 | |
| Orange G | Sigma | 7252 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate | Applichem | A1047,1000 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Fluorescent brightener 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Aniline blue | Merck | 1275 | |
| MS medium | Carolina | 19-57030 | |
| Nutrient-rich substrate | Einheitserde | ED73 | |
| Watch maker's glass | No specific brand | ||
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Syringe | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| Preparation needle | BD | BD Microlance 304000 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| Coverslips | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Humid box | A plastic box with damp paper towel and slide supports inside | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Fixatives | |||
| Carnoy's (Farmer's) fixative | Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml) | ||
| Methanol/acetic acid fixative | 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water | ||
| FPA50 fixative | Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| Clearing solutions | |||
| Chloral hydrate/glycerol | Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Modified Hoyer | Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Herr's 4½ clearing fluid | Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| SDS/NaOH solution | Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution. | ||
| SDS stock solution | 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water. | ||
| NaOH stock solution | 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water | ||
| Combined clearing and staining solutions | |||
| Herr's IKI-4½ | To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis. | ||
| Alexander staining | Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material. | ||
| Staining solutions | |||
| Calcofluor solution | Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution. | ||
| Auramine solution | Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution | ||
| Calcofluor-Auramine mixture | Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine. | ||
| DAPI solution | DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm. | ||
| Sodium phosphate buffer (0.1 M) | Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7) | ||
| Aniline blue solution | 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining. |
References
- Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
- Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
- Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
- Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
- Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
- Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).
- Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127 (2010).
- Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
- Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
- Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
- Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
- Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
- Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
- Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075 (2006).
- Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
- Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
- Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
- Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
- Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
- Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
- Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).
- Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).
- Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
- Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
- Herr, J. M. Jr Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
- Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).
- Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
- Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
- Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
- Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
- Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129 (2009).
- Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
- Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
- Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
- Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
- Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
- Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
- Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107 (2016).
