Intero-monta schiarimento e colorazione delle silique e organi del fiore di Arabidopsis

Summary

In questo protocollo, abbiamo descritte le tecniche per la corretta dissezione di Arabidopsis fiori e silique, alcune tecniche di base di schiarimento e selezionato le procedure per intero-monta le osservazioni delle strutture riproduttive di colorazione.

Abstract

A causa di suoi strumenti formidabili per studi di genetica molecolare, Arabidopsis thaliana è una delle più importanti specie modello in biologia vegetale e, soprattutto, in biologia riproduttiva delle piante. Tuttavia, pianta morfologica, anatomica e le analisi ultrastrutturali tradizionalmente coinvolgono l'incorporamento richiede tempo e sezionamento procedure per campo chiaro, scansione e microscopia elettronica. Recenti progressi nella microscopia a fluorescenza confocale, state-of-the-art 3D computerizzata analisi al microscopio e il continuo affinamento delle tecniche molecolari per essere utilizzato su campioni di intero-monta minimamente trattati, ha portato ad un aumento della domanda di lo sviluppo di tecniche di elaborazione del campione efficiente e minimale. In questo protocollo, descriviamo le tecniche per la dissezione correttamente Arabidopsis fiori e silique, compensazione, tecniche di base e alcune procedure di macchiatura per intero-monta le osservazioni di strutture riproduttive.

Introduction

I fiori sono tra i più importanti definizione organi delle angiosperme. Piante da fiore è comparso circa 90 milioni anni fa¹e così in fretta che loro aspetto rapido è stato descritto come un "abominevole mistero" di Charles Darwin²diversificato. Gli interessi dei ricercatori di pianta in sviluppo fiorale sono diversi. Alcune ricerche si sono concentrate sulla comprensione l'origine evolutiva del fiore nel suo insieme, o l'evoluzione delle specifiche proprietà anatomiche, strutturali e funzionali di fiori^3,4,5,6 . La variazione alta in floral forma e struttura, nonché le modalità di riproduzione sessuale e asessuale affidamento su di loro, fare il fiore una struttura altamente complessa. Ciò ha portato a diversi sforzi per caratterizzare le caratteristiche strutturali e di anatomia degli organi floreali, utilizzando tecniche di microscopico dell'elettrone e della luce che potrebbero combinarsi con le indagini genetiche e molecolari⁷. Inoltre, come la fonte di frutti e semi, i fiori sono di fondamentale importanza per l'alimentazione umana e animale. Di conseguenza, la caratterizzazione dello sviluppo del fiore e frutta ha molte implicazioni per la ricerca applicata, compresa la sicurezza di cibo per una popolazione umana sempre maggiore e strategie di conservazione ecologica sotto un cambiamento di ambiente^{8 , 9 , 10}.

Lo sviluppo del fiore in Arabidopsis inizia con induzione a fiore e la trasformazione del meristema vegetativo di un meristema infiorescenza (gruppo di fiori). Primordia fiore vengono avviate lateralmente sul fianco del meristema infiorescenza¹¹. I primordi dell'organo floreale formano progressivamente in verticilli concentrici dall'esterno al centro del fiore e alla fine trasformarsi in sepali, petali, stami e carpelli⁷. Questi organi floreali soddisfano distinta nutritiva, protettiva e funzionale (ad es., attrazione impollinatore) ruoli in diverse specie vegetali, con gli organi sessuali, sostenere lo sviluppo dei gametofiti maschili e femminili, rispettivamente^{12 , 13}. i gametofiti, a sua volta, ciascuna differenziano un paio di uomo (sperma) e gameti femminili (uovo e centrale delle cellule), che uniscono al momento doppia fertilizzazione per formare la prossima generazione, lo zigote e l'endosperma primario, un terminale del tessuto di sostegno del sviluppo dell'embrione^14,15. Frutta e semi di sviluppo supportano la crescita, maturazione e conservazione dell'embrione e, alla fine, la sua dispersione. Un'ampia ricerca è stata eseguita per caratterizzare lo sviluppo dell'embrione e del fiore in diverse specie di piante, soprattutto nelle specie modello Arabidopsis^7,16,17.

Analisi al microscopio precoce dello sviluppo del fiore erano basati su elaborazione del campione richiede tempo e osservazione tecniche, come la paraffina o l'incorporamento di resina e di sezionamento, combinato con la luce o la microscopia elettronica. Queste tecniche microscopiche tradizionale sono stati spesso utilizzate in combinazione con le indagini genetiche molecolari, quali analisi microscopiche di mutanti, la localizzazione di RNA tramite l'ibridazione in situ o immuno-rivelazione di proteine. Recenti progressi nella microscopia di fluorescenza grandangolari e confocale, nelle analisi di immagine computerizzata 3D in state-of-the-art e il continuo perfezionamento dei metodi molecolari che può essere utilizzato su campioni di intero-monta minimamente trattati, ha portato ad un'esigenza di tecniche di elaborazione del campione efficiente e minimale che sono preferenzialmente favorevoli ad analisi quantitative. Negli ultimi anni, significativi progressi compiuti nello sviluppo di tecniche di compensazione sull'esemplare animale intero-monta. Che rendono il campione trasparente utilizzando i reagenti di zucchero-base acquosa o di urea (ad es., scala, SeeDB, CUBIC)^18,19,20, o rimuovendo selettivamente i lipidi (usando il detersivo SDS) dopo incorporamento di campioni in idrogel stabili; la rimozione dei lipidi può essere raggiunto mediante diffusione passiva (ad esempio, modifica chiarezza protocollo²¹, patto-PARS-cerchi²²) o attivamente mediante elettroforesi (originale chiarezza protocollo²³ e ACT-PRESTO²⁴). Incoraggiato da questo progresso veloce, alcune tecniche derivate stanno emergendo anche per utilizzo in impianti.

In questo articolo di metodi focalizzato sul modello Arabidopsis, descriviamo la procedura per la corretta dissezione di boccioli di fiori, fiori e giovani silique e lo schiarimento dei campioni del intero-monta per la diversa colorazione e utilizzando le procedure di osservazione classica o un recente metodo di compensazione basati su SDS. Vengono forniti esempi per amido, callosio e macchiatura della cromatina. Anche se queste procedure potrebbero essere necessario ulteriori miglioramenti e adeguamenti quando utilizzato con altre specie, ci auguriamo di che essi porranno le basi per ulteriori ricerche su questi metodi semplici ma fondamentali che sono il punto di partenza di molti progetti di ricerca.

Protocol

1. fiore e anemofila fissazione

1. Silique da piante e fiori raccolto sincronizzate all'apertura del primo fiore.
   Nota: Nelle circostanze sperimentali utilizzati qui, piante iniziano la fioritura circa 21 giorni dopo il trapianto da piastre di Murashige e Skoog (MS) al suolo. Semi sono stratificate per 3 – 4 giorni a 4 ° C e germinato/coltivate su piastre di MS a 22 ° C/16 h luce e 18 ° C/8 h scura per 8 a 10 giorni, prima del trapianto le piantine sul suolo ricco di sostanze nutritive in vasi tenuti sotto le stesse condizioni (Figura 1). Il numero delle ripetizioni dipende l'obiettivo specifico della ricerca, ma è consigliabile un minimo di 5 infiorescenze (da 5 piante individuali) per ogni trattamento. Se i fiori sono l'unità sperimentale, si raccomanda un minimo di 10 fiori per replicare.
2. Tagliare le infiorescenze o fiori (Figura 1E-H) utilizzando forbici piccole (ad es., forbicine per le unghie) e metterli immediatamente in un tubo del microcentrifuge (per la fissazione di infiorescenza/fiore singolo) o un tubo conico (per le fissazioni collettive) che contiene appena fatta di Carnoy, metanolo/acido acetico o FPA50 fissativi (a seconda dell'applicazione, vedere di seguito) sul ghiaccio.
   Nota: I campioni dovrebbero essere completamente sommerso nel fissativo.
3. Lasciare il tessuto all'interno il fissativo per 4 h a tutta la notte a 4 ° C.
   Nota: L'infiltrazione di vuoto può essere utilizzato per accelerare la penetrazione del fissativo nel tessuto, ma questo può essere dannoso per preservare la struttura del tessuto. Gli autori non implementano infiltrazione vuoto.
4. Rimuovere il fissativo, aggiungere abbastanza etanolo al 70% per coprire i campioni e restituirli a 4 ° C per almeno 24 h; campioni possono rimanere a tempo indeterminato in questa soluzione. Dopo la rimozione dell'etanolo, procedere immediatamente alla fase successiva; dissezione o schiarimento di SDS.

2. dissezione sotto lo stereomicroscopio

1. Messo appena fatte etanolo al 70% in vetro di un orologiaio, collocato su un piccolo piatto di Petri per supporto.
2. Posto l'infiorescenza/fiore/anemofila su questo appena reso fissativo e sezionare sotto lo stereomicroscopio usando pinze e una siringa con un ago.
   1. Utilizzare di un orologiaio vetro o un dispositivo simile che consente di essere totalmente coperto con etanolo (consigliato) per la dissezione delle infiorescenze e lacerando organi floreali di fiori maturi (sepali, petali e stami può essere sezionato in questa fase i campioni ) per evitare il rischio di campioni secchi.
3. Sezionare la silique e piccoli boccioli di fiori su una diapositiva come descritto di seguito.
   1. Mettere da parte il vetro di orologiaio con campioni pre-trattati e utilizzare una normale diapositiva per la dissezione finale.
   2. Spostare il campione di interesse alla diapositiva e aggiungere 10 µ l di etanolo al 70%. Lavora velocemente sulla dissezione finale e aggiungere 10 µ l di etanolo, se necessario, per mantenere il campione umido senza liquido in eccesso.
   3. Per il rilascio di granuli di polline da stami, vedi punto 5.1. Per la dissezione carpelli ed ovuli, seguire la procedura descritta nella Figura 2. Questa procedura si applica a tutte le fasi di sviluppo del carpello, compresa la fase di sviluppo di silique verde.
      Nota: Non aggiungere etanolo se c'è sufficiente al riporto di etanolo dal movimento dei campioni; campioni molto piccoli di dissezione è molto più facile in una minima quantità di liquido. Tenere sempre solo gli organi di interesse (sepali, petali, stami, carpelli, ovuli, semi o grani di polline) sulla diapositiva. Questa procedura garantisce uno spessore uniforme tra la diapositiva e il vetrino coprioggetti, corrispondente allo spessore dell'organo in esame, risultante in una maggiore omogeneità e quindi l'efficienza per gli esami al microscopio (maggior numero di esemplari di destinazione sullo stesso piano focale).
4. Utilizzare un piccolo pezzo di carta assorbente per assorbire e rimuovere quanto più etanolo come possibile. Rapidamente, procedere al passaggio successivo (sezione 3, 4 o 6) prima il campione si asciuga fuori.

3. base di idrato di cloralio schiarimento e combinato di schiarimento-colorazione

Nota: I migliori risultati per schiarimento basati su cloralio idrato si ottengono con FPA50 fissata materiale.

1. Posto 20 µ l di soluzione di compensazione (cloralio idrato/glicerolo, modificato medio di Hoyer, 4½ di Herr o soluzioni IKI-4½ di Herr) sulla diapositiva esemplare-cuscinetto. Usando un paio di siringhe con aghi hypodermal, posizionare i campioni secondo le necessità di ridurre lo spazio tra di loro e lanciando quelli dove l'organo di interesse si affaccia verso il basso. Rimuovere qualsiasi bolla d'aria rimanente utilizzando l'ago.
2. Abbassare un vetrino coprioggetti lateralmente e delicatamente posizionarlo, premendo molto delicatamente e attendere che la soluzione di schiarimento riempie lo spazio in mezzo. Aggiungere la soluzione di compensazione minima, se necessario, per riempire tutto lo spazio sotto il vetrino coprioggetti.
3. Porre il vetrino su un supporto per diapositive e lasciarlo sotto la cappa. Procedere per le osservazioni al microscopio dopo almeno 4 ore e durante i seguenti 4 – 5 giorni.

4. combinato Alexander di colorazione e Herr 4½ schiarimento delle antere

Nota: Il protocollo originale di Alexander si basa sul rilascio di granuli di polline sulla diapositiva prima della colorazione. Un efficiente e più informativo, Alexander macchiatura e procedura di cancellazione è la colorazione dei granuli di polline maturi all'interno antere maturi ma non deiscenti per volta.

1. Scegliere appena raccolte boccioli di fiori che sta tentando di aprire con antere non deiscenti.
   Nota: Non prendere più giovani germogli di fiore perché Alexander macchiatura è inteso per i grani di polline maturi e non macchia in modo efficiente i granuli di polline immaturi. È consigliato un minimo di 5 fiori per trattamento raccolto dalle infiorescenze e diverse piante.
2. Preparare una piastra a 96 pozzetti con soluzione di abbastanza Alexander per sommergere il bocciolo di un fiore. Esporre le antere rimuovendo i sepali e petali e immergerli nella soluzione di Alexander. Mantenere i campioni sotto la cappa per 1 – 3 h.
3. Sostituire la soluzione di Alexander con soluzione 4½ di Herr e posizionare la piastra multi-pozzetto sotto la cappa per un'incubazione overnight.
4. Usando il forcipe, spostare delicatamente i boccioli dei fiori sgomberati su una nuova diapositiva. Poiché può verificarsi alcune riporto soluzione di Alessandro, è possibile utilizzare una carta assorbente per rimuovere tanto schiarimento soluzione possibile.
5. Sezionare gli stami e rimuovere tutti gli altri tessuti. Seguire i passaggi nella sezione 3 utilizzando soluzione 4½ di Herr.

5. rimuovere l'esina da granelli di polline

Nota: Si consiglia di utilizzare il fissativo di Carnoy per colorazione DAPI.

1. Seguire le procedure di fissazione e sezionamento descritte nelle sezioni 1 e 2. Ormai, uno dovrebbe avere uno a molti stami su diapositiva all'interno di una minima quantità di etanolo al 70%.
2. Utilizzare una carta assorbente per eliminare l'etanolo in eccesso e aggiungere 5-10 µ l di soluzione di DAPI. Utilizzando un paio di siringhe con aghi, rilasciare i grani di polline all'interno di quella piccola quantità di soluzione (ad esempio, utilizzare una siringa per immobilizzare lo stame e l'altro di rilasciare i grani di polline). Se la soluzione si asciuga, aggiungere un altro 5 µ l di DAPI.
3. Rimuovere tutti i detriti dello stamen è un passo fondamentale, tale che solo i granuli di polline sono lasciati tra il vetrino e il coprioggetto.
4. Porre un coprivetrino sulla diapositiva esemplare-cuscinetto abbassando lateralmente e aggiungere la quantità minima di soluzione DAPI necessaria a riempire lo spazio. Posizionare un dito indice il coprivetrino e senza schiacciare troppo tanto fare un rapido, costante e breve movimento scorrevole.
   Nota: Per misurare la forza necessaria e l'ampiezza del movimento scorrevole, questo passaggio dovrebbe essere praticato più volte, verificando i risultati ogni volta sotto il microscopio.
5. Se necessario, aggiungere soluzione DAPI e posto la diapositiva in una finestra di umida al buio a 4 ° C per 15 min a 1 h. procedere per osservare i campioni sotto fluorescenza grandangolari o microscopia confocale entro 24 h. tentare di combinare questa procedura con SDS compensazione per verificare ulteriormente migliorare menti possono essere ottenuti.

6. sodio dodecil solfato (SDS) di compensazione

Nota: A seconda dell'organo floreale da analizzare e sulle competenze del ricercatore di sezionare esemplari molto morbidi e piccoli, il SDS trattamento può essere effettuato sia prima (per ricercatori esperti) o dopo la dissezione passo (per meno esperti i ricercatori) il metanolo-acetico fissata materiale.

1. Utilizzare il vetro di un orologiaio, un vetrino concavo o un tubo del microcentrifuge per incubare i campioni sezionati o non sezionato in SDS 1% e 0,2 N NaOH soluzione durante la notte a temperatura ambiente.
2. Maneggiare con cura perché il campione è molto morbido e ha un aspetto trasparente. Risciacquare più volte con acqua.
   Nota: I resti della soluzione SDS potrebbero portare a precipitazioni durante l'aggiunta di soluzione colorante, ad esempio, anilina blu.
3. Per campioni non sezionato, seguire la procedura di dissezione descritta nella sezione 2, utilizzando acqua invece di etanolo al 70%. Dopo dissezione del tessuto desiderato, rimuovere eventuali residui e detriti e l'acqua in eccesso con carta assorbente, quindi aggiungere 20 – 40 µ l di soluzione colorante e procedere con il passaggio 6.5.
4. Per i campioni sezionati, spostare il campione dalla soluzione di lavaggio e posizionare su un vetrino pulito e aggiungere 20 – 40 µ l di soluzione colorante.
5. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetto sul vetrino abbassando lateralmente. Fare attenzione a non per schiacciare la preparazione. Se il tessuto è troppo morbido, luogo qualsiasi sottile separatore in tra il vetrino e il coprioggetto agli angoli (ad es., nastro o un vetrino coprioggetto rotto), lasciando uno spazio di cameristica tra diapositiva e il vetrino coprioggetti, tale che il vetrino coprioggetto non schiacciare il campione.
6. Inserire tutte le diapositive all'interno di una casella di umida, coprirlo con un foglio di alluminio e posizionarlo a 4 ° C per almeno 1 h. Procedi per osservare il campione utilizzando widefield fluorescenza o microscopia confocale entro 24 h.

Representative Results

Arabidopsis appartiene alla famiglia Brassicacea, cuscinetto infiorescenze con fiori bisessuali disposti in un corimbo (Figura 1). Ogni fiore ha quattro sepali, petali di quattro, sei stami (quattro lunghi e due brevi) e un sincarpio gineceo costituito da due carpelli congenitamente fuse (Figura 1F-H) disposti in verticilli concentrici quattro^25,26. Arabidopsis ha tenuinucellate, anatropous ovuli disposti in placentazione parietale in due righe (12-20 ovuli in ogni riga) all'interno di ogni i due loculi dell'ovaia (un totale di 45-80 ovuli) (dati non pubblicati e riferimenti^{27, 28 , 29 , 30}). al fine di intraprendere analisi comparative robuste dello sviluppo dell'embrione e del fiore all'interno di un singolo impianto o tra piante diverse (come repliche o trattamenti), si consiglia di utilizzare il primo fiore aperto come riferimento (Figura 1b). in questa fase, l'infiorescenza (Figura 1E) ha solitamente fra 20 e 30 boccioli di fiori che coprono tutte le fasi dello sviluppo del fiore e in fasi più o meno simili in altri individui (dati non pubblicati). Più dei meristemi fiore (formando tra 5 e 20 fiori) saranno avviati da meristema infiorescenza dopo il primo fiore aperto. I primi due fiori potrebbero mostrare difetti di fertilità e, quindi, non devono essere inclusi nell'analisi.

Fiori di Arabidopsis e organi floreali utilizzando basati su cloralio idrato di compensazione compensazione soluzioni^31,32, compreso 4½ di Herr compensazione soluzione³³, viene comunemente eseguito per (contrasto differenziale di interferenza Analisi al microscopio di DIC) dello sviluppo dell'embrione, anemofila e fiore (Figura 3A-J). La soluzione 4½ è specificamente consigliato per analizzare lo sviluppo di stame e per gli organi che richiedono capacità di schiarimento più forte. Alcune soluzioni basate su cloralio idrato sono utilizzate per il duplice scopo di sgombero e macchiatura simultaneamente; Questo è il caso per^{34 dell'originale Alexander} e IKI-4½^35,36 soluzioni di Herr. Alexander la macchiatura è ampiamente usato in Arabidopsis per valutare l'aborto di polline. Un Alexander modificate e più informativo che macchia procedura³⁷ è a macchiare tutto antere contenenti granuli di polline maturi. Questa procedura richiede una radura posteriore delle antere utilizzando soluzione 4½ di Herr (Figura 3 K-L). Altre tecniche di colorazione utilizzate in diverse specie vegetali potrebbero fornire una migliore stima della redditività di polline (ad es., la reazione fluorochromatic utilizzando diacetato di fluoresceina, macchiatura per callosio, amido, DNA, RNA e test enzimatici utilizzando coloranti di redox)^38,39,40. Tuttavia, la maggior parte di queste tecniche valutare un aspetto specifico del grano di polline che potrebbe non necessariamente correlato con vitalità di polline e, soprattutto, la fertilità del polline. Una valutazione della capacità di germinazione del polline e la sua capacità per effetto di fertilizzazione e impostare semi potrebbe essere più accurata^38–40. Una procedura di schiarimento di colorazione molto meno utilizzata è IKI-4½ di Herr, che combina soluzioni di compensazione e amido-macchiatura. Oltre a macchiatura per amido (Figura 4), questa procedura utilizzabile per scopi di schiarimento generale ogni volta che un contrasto più elevato è necessario (ad esempio, Figura 3A, E).

Una combinazione di auramina e calcofluor è usato in molte specie di pianta⁴¹ a macchiare simultaneamente l'esina polline e intine (Figura 5A). La maggior parte di questi e altri coloranti chimici non si colorano di un singolo componente cellulare e, quindi, dovrebbero essere usati in combinazione con tecniche di etichettatura più dirette come GUS o linee marcatore fluorescente-etichettate, anticorpi o ibridazione in situ . Potrebbe mostrano anche più eccitazione e spettri di emissione. DAPI, al contrario, è più specifico e viene solitamente utilizzato a macchiare la cromatina e cromosoma spread⁴² durante la meiosi e a seguire lo sviluppo polline⁴³, oltre alle sue molteplici applicazioni come un colorante di contrasto per il nucleo. Qui, ci mostra come l'intensità di colorazione può essere aumentato per ottenere una visualizzazione più dettagliata della cromatina degli spermatozoi e nuclei vegetativi rimuovendo meccanicamente l'esina (figura 5B-C). Anche se questa tecnica è molto utile per coloro che sono interessati a eseguire analisi dettagliate della cromatina, cromosomi e struttura nucleare, asportare meccanicamente l'esina potrebbe influenzare l'organizzazione del grano di polline, tale che i risultati devono essere interpretati con cautela.

La maggior parte di questi coloranti fluorescenti vengono utilizzata senza previo schiarimento del tessuto; ma in alcuni casi, sono compatibili con un posteriore deselezionando la diapositiva⁴⁴basati su cloralio idrato. SDS di compensazione è stato recentemente utilizzato come reagente nella ricerca animale e vegetale di compensazione e ha dimostrato di essere compatibili con differenti procedure di macchiatura per widefield fluorescenza e microscopia confocale (mPS-PI⁴⁵ in piante e chiarezza²³, PATTO²² o ACT-PRESTO²⁴ in animali). Utilizzando un SDS-NaOH compensazione prima dell'anilina blu colorazione (Figura 5-H), siamo riusciti a raggiungere maggiore accessibilità all'interno dei tessuti, così come una migliore colorazione per callosio all'interno dei tessuti floreali (Figura 5I-L). Risultati simili sono stati ottenuti per calcofluor (dati non mostrati).

Figura 1: Fotografie di fiori e piante di Arabidopsis . (A-D) Piante di Arabidopsis nelle diverse fasi del ciclo di vita: Rosetta prima di bullonatura (A), alla prima apertura di fiore (B), con primario e alcune infiorescenze secondarie (C) e alla fine della fioritura (D). (E) il corimbo tipica di un Arabidopsis infiorescenza con fiori alle varie fasi di sviluppo, maturazione acropetally. (F-H) Un fiore di Arabidopsis all'antesi, illustrando autoimpollinazione (stame toccando lo stigma e il rilascio di granuli di polline). Figure E-H sono cariche di concentrazione di 36, 53, 42 e 32 immagini, rispettivamente, assemblati utilizzando uno strumento software (ad es., Helicon Focus). F-H rappresentano lo stesso fiore dove un sepalo, due petali e un breve stame sono state rimosse in H. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: come sezionare un gineceo ed ovuli. Mani di (1-3), posto il gineceo su una diapositiva con una minima quantità di etanolo al 70% e la posizione come raffigurato nel disegno. Fare taglia 1-3 di seguito le direzioni indicate dalle frecce rosse. Utilizzare l'ago con l'apertura rivolta verso l'alto e lontano gli ovuli per tagli 2-3. (4-6) ruotare il carpello 180 gradi, come mostrato e fare tagli 4-6 come i primi tre tagli. (7) rimuovere le valvole: utilizzare l'ago con l'apertura rivolta verso il basso, posizionarlo sotto gli ovuli e spingere l'ago rapidamente a destra lungo il margine della valvola. Per più grande carpelli (antesi e successivi), o con qualche esperienza di dissezione, uno può sostituire questo passaggio ripetendo i passaggi 2 e 5 sul lato opposto del carpello. (8-9) rimuovere lo stigma-stile e il peduncolo con sharp tagli utilizzando l'ago con la sua apertura laterale e lontano dagli ovuli. (10), fare un piccolo forte tagliare il tessuto di trasmissione livello in uno dei due estremi. (11) utilizzare il forcipe e l'ago di lacerare le due metà. (12) utilizzando le pinze e l'ago, capovolgere delicatamente una fila di ovuli per ottenere due file parallele. In alternativa, posizionare le due righe in verticale con il replum che si trova sopra e spingere delicatamente verso il basso lungo il replum per diffondere le due righe di ovulo su entrambi i lati. Due appiattito ma ancora attaccato righe di ovuli dopo schiarimento e colorazione con soluzione di IKI-4½ di Herr vengono mostrati come un'illustrazione del risultato della dissezione. Scala bar = 80 µm Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: compensazione basata su cloralio idrato con o senza colorazione durante lo sviluppo del fiore. (A), A giovane germoglio di fiore. (B-E) Sviluppo di stame con madre microspora cellule nella citochinesi (B), tetradi di microspore (C), mitosi polline grani di polline (D) e tricellular (E). (F-J) Gineceo contenenti ovuli con le cellule madri megaspora (freccia) prima della meiosi (F e G) e durante la Profase Meiotica I (H), con un sacco embrionale vacuolizzato (freccia) (io) e al momento della fecondazione (J). Nota la traccia di un tubo di polline (freccia) all'interno della regione micropylar dell'ovulo in J. (K-L) Alexander modificate di macchiatura delle antere con il pieno (K) o ridotto l'attuabilità di polline a causa di stress da calore (L). Si noti il citoplasma vuoto e forme irregolari di granelli di polline abortiti entro i locules antera in adesione di Arabidopsis L. selvaggio-tipo Col-0. Compensazione o colorazione: 4½ di Herr B-D e F-J, Herr di IKI-4½ per A ed Ee modificato Alexander macchiatura per K-L. Barre di scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: amido dinamiche durante il fiore e presto lo sviluppo del seme. Risultati rappresentativi che illustrano il fatturato di amido dinamico durante lo sviluppo del fiore. (A-C) La terza ondata di amido amylogenesis/amylolysis durante le ultime fasi di sviluppo di stame descritto di recente,³⁹. (D-G) Risultati rappresentativi dell'onda unica amido del grano di polline con un picco di amylogenesis nella fase bicellular. (H-N) Risultati rappresentativi delle dinamiche di amido in ovuli nella fase cellula madre megaspora (H), nello sviluppo di gametofiti femminili (K) e durante lo sviluppo iniziale del seme (appena dopo la fecondazione in L, endosperma binucleata in M e stadio embrionale ottante in N). Adesione di Arabidopsis selvaggio-tipo Col-0. Scala bar = 20 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: alcuni classici che macchia le procedure per la microscopia a fluorescenza e l'effetto di SDS-schiarimento. (A) Calcofluor-auramina macchiatura durante la maturazione del polline dove la intine è macchiato blu (calcofluor) e l'esina intensamente verde (auramina). (B-C) Rimozione meccanica della Esina e colorazione DAPI tricellular granelli di polline. (D-H) Immagini rappresentative di un'infiorescenza prima (D, come recuperato dal fissativo) e dopo SDS compensazione (E-H). Notare la trasparenza del tessuto che permette l'osservazione del sistema vascolare all'interno lo stelo dell'infiorescenza (G) e il peduncolo di bocciolo di fiore (H). (-J) Blu anilina macchiatura per callosio in microspore nella fase tetrade entro lo stame. Confrontare la chiarezza e l'intensità della colorazione tra il non-SDS deselezionata antera (io) e l'antera SDS-deselezionata (J). (K), An SDS-deselezionata e anilina blu macchiato antera con microspore durante la mitosi polline nota la sincronia di molti granelli di polline in questa fase in questi due loculi. (L) An SDS-deselezionata e anilina blu macchiato ovulo dopo la fecondazione. Nota callosio colorazione nei resti del tubetto pollinico e nel tegumento. Adesione di Arabidopsis selvaggio-tipo Col-0. Barra della scala = 20 µm (A-C,-L); 1 mm (D-H). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L'esistenza di molti boccioli di fiori all'interno di una singola infiorescenza di Arabidopsis, che coprono tutte le fasi di sviluppo del fiore, offre un'opportunità unica per studi mirati alla caratterizzazione di un effetto di un trattamento o una caratteristica inerente allo sviluppo contemporaneamente attraverso le diverse fasi dello sviluppo del fiore. Un buon punto di riferimento tra le diverse singole piante è l'apertura del primo fiore dell'infiorescenza principale. Piante sono trattate in modo tale che la fioritura è sincronizzato, per quanto possibile (per esempio, 3 – 4 giorni stratificazione a 4 ° C massimizza la germinazione del seme sincrona e quindi più uniforme fioritura) e solo le piante che si aprono il loro primo fiore nello stesso giorno sono preso come un batch da distribuire tra trattamenti e repliche; batch pronti nei giorni successivi può essere utilizzato per replicare l'esperimento. Seguendo questa procedura, più robuste analisi comparative, controllando per variazioni ambientali e di sviluppo all'interno e tra le piante, possa essere eseguita.

Combinazione di macchia di Lugol con soluzione di schiarimento di Herr ha permesso non solo di migliorare il contrasto nei campioni sgomberati rispetto alle soluzioni di schiarimento classica, ma anche per la caratterizzazione dinamica di amido durante lo sviluppo dell'embrione e del fiore, come recentemente riportato per Arabidopsis ⁴⁶. utilizzando questa semplice procedura, siamo stati in grado di svelare l'esistenza di una nuova ondata di amido amylogenesis-amylolysis durante lo sviluppo dell'antera e di correlare amido dinamiche con cambiamenti globali nell'espressione di geni che codifica le proteine coinvolte nel metabolismo di zuccheri e amidi. Questa analisi ha mostrato che il GPT6 è il translocator del zucchero-fosfato dal cytosol ai amiloplasti per la sintesi di amido. I risultati dettagliati sulle dinamiche di amido in vari tessuti apre la possibilità di caratterizzare altri geni importanti nel metabolismo di amido e di affrontare questioni irrisolte riguardanti meno studiati ma importanti fasi di sviluppo della pianta. Macchiatura di amido iodato non è quantitativa e dovrebbe essere integrata con altri metodi⁴⁶.

Ricerca di ricerca per una migliore compensazione procedure compatibili con microscopia di fluorescenza ha intensificato negli ultimi anni, soprattutto in campo animale. Anche se il campo di ricerca della pianta è in ritardo, e compensazione in gran parte si basa su soluzioni di compensazione tradizionale per l'analisi DIC (ad es., soluzioni basate su cloralio idrato, benzoato di benzile, ftalato di dibutile e salicilato di metile)^{31 ,33,47,48}, incoraggiati dai veloci progressi realizzati nel campo animale, alcune tecniche simili stanno emergendo utilizzando urea - (ad es., ClearSee⁴⁹ e altri⁵⁰), e 2, 2'-thiodiethanol-base di compensazione procedure^51,52. Qui, indichiamo che l'uso del detergente SDS in combinazione con NaOH rende il tessuto trasparente e migliora alcune procedure, come ad esempio Anilina blu per callosio e calcofluor per cellulosa di colorazione di fluorescenza classica. Basato su questi risultati promettenti, simili progressi nella rimozione selettiva basata su SDS dei lipidi possono essere previsto nel campo pianta nel prossimo futuro. Poiché le cellule vegetali hanno pareti cellulari rigide che sono assenti nelle cellule animali, previo l'incorporamento in idrogeli potrebbe non essere necessario, come è il caso per tessuti animali. Altri coloranti fluorescenti e fluorofori utilizzati nelle linee di marcatore genetico potrebbero essere analizzati mediante questa procedura di compensazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.