Een eenvoudige benadering voor het opwekken van experimentele Autoimmune Neuritis in C57BL/6 muizen voor functionele en neuropathologische evaluaties
Summary
Dit verslag schetst een eenvoudige benadering om succesvol experimentele autoimmune neuritis (EAN) met behulp van de myeline proteïne nul peptide180-199 (P0) in combinatie met de Freund compleet adjuvans en kinkhoest toxine. We presenteren een verfijnde paradigma staat nauwkeurig de beoordeling van de omvang van functionele tekorten en Neuropathologie die zich voordoen in deze EAN.
Abstract
Experimentele autoimmune neuritis (EAN) is een goed gewaardeerd experimentele model van perifere demyeliniserende auto-immuunziekten. EAN ziekte wordt veroorzaakt door het immuniseren van muizen met neurogene peptiden aan direct een inflammatoire aanval naar onderdelen van het perifere zenuwstelsel (PNS). Recente ontwikkelingen hebben de inductie van EAN in de relatief resistent C57BL/6 muis lijn met behulp van myeline eiwit nul (P0)106-125 of P0180-199 peptiden geleverd in adjuvans gecombineerd met de injectie van pertussis toxine ingeschakeld. De capaciteit voor het opwekken van EAN in de stam van de C57BL/6 kunt voor het gebruik van de vele genetische hulpmiddelen die bestaan op de achtergrond van deze muis en dus de geavanceerde studie van de pathogenese van de ziekte en de ondervraging van de mechanistische actie van roman therapeutics in combinatie met transgene benaderingen. In deze studie tonen we een eenvoudige benadering van EAN met behulp van de P0180-199 peptide in C57BL/6 muizen met succes te induceren. Ook schetsen wij een protocol voor de beoordeling van functionele tekorten die zich bij dit model wordt begeleid door een matrix van neuropathologische kenmerken voordoen. Dit model is dus een krachtig experimenteel model om te bestuderen van de pathogenese van menselijke perifere demyeliniserende neuropathieën en voor het bepalen van de werkzaamheid van potentiële therapieën die gericht zijn op bevordering van myeline reparatie en bescherming tegen schade aan de zenuwen in auto-immuunziekten neuritis.
Introduction
Melding gemaakt van perifere neuropathieën kunnen genetische oorsprong of verworven, met de verworven neuropathieën hebben beide metabole, ischemische, inflammatoire of giftige neerslagmiddelen. Deze ziekten zijn ook nuttig ingedeeld als axonale of demyelinative oorsprong. De meest voorkomende verworven demyeliniserende melding gemaakt van perifere neuropathieën Acute inflammatoire demyeliniserende polyneuropathie (AIDP zijn, ook bekend als het syndroom van Guillain-Barré, GBS) en chronische inflammatoire demyeliniserende polyneuropathie (CIDP)1, 2 , 3 , 4; beide zijn pathogenetically gekenmerkt door een auto-immune reactie gericht tegen de myelineschede, waardoor demyelinisatie van de perifere zenuwen. In deze ziekten, geactiveerde T-cellen Kruis het bloed zenuw barrière en genereren een immune reactie binnen de PNS. Activering van macrofagen binnen de zenuw dan veroorzaakt demyelinisatie via fagocytische aanval direct noch indirect via secreted inflammatoire mediatoren, resulterend in klinische handicaps zoals verlamming en sensorische dysfunctie5. Terwijl demyelinated axonen de mogelijkheid om te worden remyelinated na demyelinisatie behouden, remyelination wordt vaak vertraagd of onvolledig, resulterend in de gevoeligheid van de naakte axonen tot onherstelbare schade, welke is de belangrijkste oorzaak van permanente klinische handicap. Op dit moment de meest effectieve behandelingen zijn immunomodulerende, maar ondanks hun werkzaamheid, in veel gevallen het herstel is vaak traag en ~ 25% patiënten beleeft resterende functionele tekorten die aanzienlijk hun levenskwaliteit6verminderen, 7.
EAN is een veel gebruikte diermodel van demyeliniserende perifere neuropathie die waardevolle inzichten in de pathogenese en een middelen ter beoordeling van nieuwe therapeutische agenten4heeft. Dit model kan worden opgewekt in verschillende soorten zoals konijnen, ratten, muizen en cavia’s, en wordt veroorzaakt door immunisatie met neurogene antigenen. Echter, uiteindelijk de succesvolle EAN-inductie hangt af van een passende immuunrespons voor ziekte optreden. Gezien de soorten (en intersite-species/stam) variaties in immune functie, hebben meerdere combinaties van antigenen en hulpstoffen ontwikkeld om met succes het induceren van EAN. In termen van lymfkliertest genetische hulpmiddelen is de C57BL/6 de meest gebruikte; de traditionele P2 eiwit peptide 57-81 (P257-81) waardoor de ziekte in de voor de ziekte vatbare SJL muis stam8 is echter niet in staat om illegale pathogenese leidt tot functionele tekorten in de stam van de C57BL/6. Gelukkig, overgevoeligheid paradigma’s met behulp van de P0106-125 of P0180-199 peptides, geleverd in adjuvans gecombineerd met de injectie van pertussis toxine kunt overwinnen deze barrière, waardoor geavanceerde genetische hulpmiddelen om te worden gebruikt in de lymfkliertest EAN model.
Hier wordt een eenvoudige methode voor de inductie van EAN in de C57BL/6 muizen gepresenteerd. Daarnaast vindt u een gedetailleerde aanpak om te evalueren van de functionele en neuropathologische tekorten die is gekoppeld aan de ziekte. De P0180–199 peptide9 werd gekozen boven de P057-81 alternatieve10. Het P0180–199 model is beschreven voor de productie van minder ernstige klinische symptomen in vergelijking met de alternatieve P057-81 10, en daarom kunnen weerstaan van de invoering van potentieel schadelijke genetische verstoringen, herstellen van chirurgische procedures (zoals osmotische pomp implantatie), en is vatbaar voor loopband gait functie4testen. Echter kunnen de loopband gait functie tests en histologische protocollen beschreven hier gemakkelijk worden toegepast bij de studie van de ziekte in een P057-81 geïnduceerde variant.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit verslag schetst een eenvoudige methode om te induceren EAN met behulp van de P0180-199 peptide in C57BL/6 muizen, waardoor de kwantificering van belangrijke neuropathologische en functionele tekorten in muizen geïnduceerde met EAN. Verschillende bij het protocol van de EAN-inductie hier beschreven is het gebruik van verdoving tijdens het uitvoeren van de immunisatie injecties. Het gebruik van Isofluraan verdoving verbetert sterk de mogelijkheid om ervoor te zorgen dat het totale volume van entmateriaal su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DGG is een NHMRC Peter Doherty en Multiple sclerose onderzoek Australië (MSRA) vroege carrière Fellow. JLF wordt ondersteund door een MSRA Postdoctoral Fellowship. Dit werk werd gesteund door de Australian National Health en medische onderzoek Raad (NHMRC) project #APP1058647 aan JX verlenen.
Materials
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy–update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
