Summary
Questo rapporto descrive un approccio semplice per indurre con successo la neurite autoimmune sperimentale (EAN) utilizzando la proteina della mielina zero (P0)180-199 del peptide in combinazione con adiuvante completo di Freund e tossina della pertosse. Vi presentiamo un paradigma sofisticato in grado di valutare con precisione l'entità dei deficit funzionali e neuropatologia che si verificano in questo EAN.
Abstract
Neurite autoimmune sperimentale (EAN) è un modello sperimentale ben apprezzato delle malattie demielinizzanti periferiche autoimmuni. Malattia EAN è indotto immunizzando topi con peptidi neurogeni di dirigere un attacco infiammatorio verso componenti del sistema nervoso periferico (PNS). Gli avanzamenti recenti hanno permesso l'induzione di EAN nella linea di mouse C57BL/6 relativamente resistente usando la proteina del myelin zero (P0)106-125 o peptidi180-199 P0 consegnati in adiuvante combinato con l'iniezione di tossina della pertosse. La capacità di indurre EAN nel ceppo C57BL/6 consente l'utilizzo di numerosi strumenti genetici che esiste su questo sfondo del mouse e permette così sofisticato studio della patogenesi della malattia e interrogatorio dell'azione meccanicistico di approcci terapeutici in combinazione con approcci transgenici. In questo studio, dimostriamo un approccio semplice per indurre correttamente EAN utilizzando il peptide di180-199 P0 in topi C57BL/6. Abbiamo anche delineare un protocollo per la valutazione dei deficit funzionali che si verificano in questo modello, accompagnato da una serie di caratteristiche neuropathological. Così, questo modello è un potente modello sperimentale per studiare la patogenesi delle neuropatie demielinizzanti periferiche umane e per determinare l'efficacia di potenziali terapie che mirano a promuovere la riparazione della mielina e proteggono da danno del nervo in autoimmune neurite.
Introduction
Neuropatie periferiche possono essere di origine genetica o acquisita, con neuropatie acquisite avendo entrambi metabolica, ischemica, infiammatorie, o tossici precipitanti. Queste malattie sono anche utilmente classificate come assonale o demyelinative in origine. Il più comune acquisita demielinizzante neuropatie periferiche sono la polineuropatia Demyelinating infiammatoria acuta (AIDP, noto anche come sindrome di Guillain-Barré, GBS) e cronica infiammatoria demielinizzante polineuropatia (CIDP)1, 2 , 3 , 4; entrambi sono patogeneticamente caratterizzati da una reazione autoimmune diretta contro la guaina di mielina, che causa demielinizzazione dei nervi periferici. In queste malattie, le cellule di T attivate attraversano la barriera del nervo e generano una reazione immune all'interno il PNS. Attivazione dei macrofagi all'interno del nervo quindi causa demielinizzazione o direttamente tramite attacco fagocitica, oppure indirettamente tramite secrete mediatori infiammatori, con conseguente disabilità clinica come paralisi e disfunzione sensitiva5. Mentre gli assoni demyelinated mantengono la capacità di essere remyelinated seguito demielinizzazione, remyelination è spesso ritardato o incompleta, con conseguente suscettibilità degli assoni nudi a danni irreversibili, che è la causa principale della clinica permanente disabilità. Attualmente, i trattamenti più efficaci sono immunomodulatori, ma nonostante la loro efficacia, in molti casi il recupero è spesso lento e ~ 25% pazienti avvertiranno i deficit funzionali residui che riducono significativamente la loro qualità di vita6, 7.
EAN è un modello animale ampiamente usato di demielinizzanti neuropatia periferica che ha fornito le comprensioni importanti nella patogenesi e un mezzo per valutare nuovi agenti terapeutici4. Questo modello può essere indotta in specie diverse come i conigli, ratti, topi e porcellini d'India e viene indotta tramite immunizzazione con antigeni neurogeni. Tuttavia, l'induzione di EAN successo dipende in ultima analisi su una risposta immunitaria adeguata per la malattia si verifichi. In considerazione delle variazioni di specie (e inter-specie/ceppo) nella funzione immune, molteplici combinazioni di antigeni e adiuvanti sono stati sviluppati per indurre correttamente EAN. In termini di strumenti genetici murini, C57BL/6 è il più ampiamente usato; Tuttavia, il peptide di proteina P2 tradizionale 57-81 (P257-81) che provoca la malattia nel ceppo suscettibili SJL mouse8 è in grado di patogenesi illeciti portando a deficit funzionali nel ceppo C57BL/6. Fortunatamente, paradigmi di sensibilizzazione utilizzando il P0106-125 o P0180-199 peptidi, consegnato in adiuvante combinato con l'iniezione di pertosse tossina può superare questa barriera, abilitazione sofisticati strumenti genetici per essere utilizzato nella modello murino di EAN.
Qui, un metodo semplice per l'induzione di EAN nei topi C57BL/6 è presentato. Inoltre, viene fornito un approccio globale e dettagliato da cui valutare i deficit funzionali e neuropathological associati alla malattia. Il peptide di P0180–199 9 è stato scelto preferenza l' alternativa1057-81 di P0. Il modello di199 180–P0 è stato descritto per produrre meno gravi segni clinici rispetto con l' alternativa1057-81 di P0 e rischia pertanto di sostenere l'introduzione di potenzialmente perturbazioni genetiche deleterie, recuperare dalle procedure chirurgiche (ad esempio l'impianto pompa osmotica) ed è favorevole alla prova4funzione di andatura di tapis roulant. Tuttavia, i tapis roulant andatura funzione test e istologici protocolli descritti qui facilmente potrebbero essere applicati quando si studia la malattia in una variante di57-81 indotto P0.
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Protocol
tutte le procedure qui descritte sono state approvate dall'Istituto Florey di Neuroscienze e salute mentale (Melbourne cervello Centre) Comitato di etica degli animali e seguire la Australian codice di pratica per l'uso degli animali per scientifico Scopi.
1. induzione di EAN
Nota: EAN può essere indotta con successo nei topi C57BL/6 maschi di età compresa tra 6-8 settimane. Il protocollo di induzione dura 9 giorni in totale. Giorno 0 si riferisce al giorno della prima immunizzazione. Per questo protocollo, le iniezioni sono state condotte nell'ambito dell'anestesia (Vedi punto 1.1.2 qui sotto).
- On Day -1:
- preparare la tossina della pertosse (Vedi Tabella materiali) soluzione di 1,6 µ g/mL utilizzando il fosfato del mouse-isotonica sterile di 0.1 M tampone (MT-PBS).
- Amputate con isoflurano:
- posizionare il mouse (C57BL/6, uomo, 6-8 settimane) in aula amputate e regolare il flusso di ossigeno a 1 L/min.
- Accendere il vaporizzatore isoflurano, regolarlo al 2,5% per amputate e monitor di respirazione e attesa per 2 min, o fino a quando i riflessi primari (arto cornea e posteriore) sono non più reattivo
- Rimuovere il mouse dalla camera amputate e amministrare 250 µ l della soluzione di tossina della pertosse sopra tramite un'iniezione intraperitoneale (i.p.) utilizzando una siringa da 0,5 mL con ago 30 1/2 G.
- Preparare l'inoculo iniettabile per immunizzazione:
- preparare soluzione A utilizzando 2 mg/mL soluzione del peptide 180-199 P0 (con > 98% di purezza, sequenza S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) in soluzione fisiologica allo 0,9%.
- Preparare Soluzione B utilizzando 20 mg/mL soluzione della tubercolosi del micobatterio (Vedi Tabella materiali) in Freund ' adiuvante completo s (FCA, composto da: 15% mannide monoolate + 85% di olio di paraffina e 0,5 mg/mL di essiccata uccisi e secchi M Mycobacterium butyricum).
- Per rendere l'inoculo finale per via parenterale, combinare parti di uguale volume di soluzioni A e B in un battitore di perlina e mescolarli alla massima velocità per 1 minuto a temperatura ambiente.
Nota: Le soluzioni A e B possono essere mantenute come magazzino e conservate a 4 ° C per un massimo di un mese ma l'inoculo finale combinato dovrà essere preparata il giorno dell'iniezione del mouse.
- Il giorno 0, amministrare 50 µ l di inoculo (preparazione descritta in passaggio 1.1.4) in un mouse tramite un'iniezione sottocutanea con un ago di 23 G.
Nota: L'iniezione può essere collocata tra le scapole, o tra le arti posteriori e la coda sopra il dorsum caudale. - Il giorno 1, rendono la soluzione di tossina della pertosse di 1,2 µ g/mL (in MT-PBS) e amministrare 250 µ l in un mouse via i.p. iniezione utilizzando una siringa da 0,5 mL con ago 30 1/2 G.
- Il giorno 3, ripetere passo 1.3 qui sopra.
Nota: Soluzioni Stock A e B possono essere composti e conservate a 4 ° c per un massimo di un mese. Tuttavia, l'inoculo finale iniettabile, prodotto dalla combinazione di soluzioni di riserva A e B, deve essere fatto il giorno dell'iniezione. - Il giorno 8, amministrare 50 µ l di inoculo (preparazione descritta in passaggio 1.1.4) in un mouse tramite un'iniezione sottocutanea (Vedi punto 1.2. su indicato), al sito di iniezione stesso come descritto al punto 1.2 (per ogni animale)
2. Scoring clinico
- eseguire segnando clinica quotidiana a partire il giorno 0.
- Dare ogni mouse un punteggio pari a 0, 1, 2, 3 o 4 secondo i criteri pubblicati 4. Vedere la tabella 1 per il punteggio clinico EAN.
Nota: Per coerenza, uno sforzo dovrebbe essere fatto per segnare i topi allo stesso tempo ogni giorno dal ricercatore stesso.
3. Valutazione di funzione a motore
Nota: le prestazioni del motore sono valutata in parallelo con il punteggio clinico per la stessa coorte degli animali. L'apparato di valutazione della funzione motoria deve essere collegato a un computer che dispone di un sistema di imaging funzione andatura (Vedi Tabella materiali) installato. Si raccomanda inoltre che tutti i topi da valutarsi dovrebbero essere abituati all'attività in esecuzione prima di induzione di EAN. Per effettuare questa operazione, esecuzioni di pratica (2 esecuzioni di test per topo) vengono eseguite tre giorni prima di induzione di malattia (giorno -3).
- Accendere la funzione motoria valutazione apparato ed il commutatore sul pulsante luce.
- Scruff il mouse saldamente e suoi piedi di inchiostro abbassando esso su un contenitore riempito con inchiostro rosso mentre si tiene la sua coda.
Nota: Questo passaggio è obbligatorio per il ceppo C57BL/6, ma può essere ignorato se viene utilizzato un ceppo del mouse con un colore del mantello bianco. - Posizionare il mouse nel vano piedi e impostare la velocità di tapis roulant a 15 cm/s.
- Accendere il tapis roulant e cliccare il " record " pulsante per catturare il movimento in esecuzione del mouse utilizzando la funzione di andatura sistema di imaging (Vedi Tabella materiali).
- Utilizzare un timer e misurare ogni corsa per 36 s. Dopo 36 s, interrompere la registrazione e stop il tapis roulant.
Nota: I topi che non è in grado di completare con successo l'attività in esecuzione per questo intervallo s 36 sono considerati di avere fallito. - Salvare il file video nella cartella designata.
- Ripetere i passaggi precedenti per ogni mouse per essere valutato. Testare i topi con la stessa attività in esecuzione ogni 3 giorni.
- Analizzare i file video modificati utilizzando il software per i parametri di funzione di andatura (Vedi Tabella materiali).
Nota: I dettagli di come analizzare diversi parametri del motore variano tra software così consultare il produttore ' istruzione di s prima dell'analisi. Per ottenere l'evidenza istologica di axonal e danni di mielina tramite immunoistochimica o microscopia elettronica, tessuti possono essere assunto in qualsiasi fase post funzione motoria valutazione a seconda degli obiettivi specifici della ricerca animale.
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Representative Results
Peptide180-199 P0 indotto EAN nei cavi di topi C57BL/6 per una malattia monofase con punteggio clinico inizio dal post di 6 giorni prima immunizzazione (dpi) e massimo punteggio gravità è osservata da 25 dpi seguita da alcuni punteggio clinico miglioramento da 40 dpi durata (Figura 1)4,9. In termini di funzione di andatura, topi cominciano a fallire in una semplice attività in esecuzione più presto 6 dpi e di 35 dpi topi hanno poca capacità di completare un semplice tapis roulant in esecuzione attività e non migliorano in capacità di marcia anche a 55 dpi4 (Figura 1). Topi indotti con EAN è diminuito progressivamente nella loro capacità di eseguire le attività in esecuzione nel corso del tempo. Errore di attività di esecuzione è osservata nell'80% dei topi, ma oltre a questo, andatura dell'arto ampliando in tapis roulant in esecuzione è un deficit funzionale chiave che non si risolve nel corso della durata di malattia4.
Ci sono diverse caratteristiche chiave neuropathological in P0180-199 indotto EAN: danni alla guaina di mielina; stress dell'assone; e nodo maggiore larghezza e danni a strutture paranodali. L'esame delle sezioni semi-sottile tratto da nervi sciatici rivela le aree di demielinizzazione (Figura 2B, frecce) rispetto al nervo sciatico da controlli sani di pari età (Figura 2A). Cosa importante, è possibile ottenere rapporti di G da immagini acquisite dalle sezioni semi-sottile nervo sciatico imaged ad alta potenza con microscopia chiara4. Tuttavia, immagini di microscopia elettronica (TEM) trasmissione ad alta potenza sono necessarie per identificare caratteristiche neuropathological specifiche come la dysmyelinaton, la lamella di mielina, il danneggiamento e segni dell'assone stress quali rigonfiamento mitocondriale (dissesto e distorsione di cristae e cristolysis parziale o totale) (Figura 2–2D). Coerente con la prova ultrastrutturale di stress dell'assone (Figura 2-2D), il modello EAN180-199 indotto P0 Visualizza anche danno assonale acuto, dimostrato da precursore di β-amiloide drammaticamente elevati espressione della proteina (APP) nei nervi sciatico (Figura 3A). Ciò non è osservata nei tessuti sani di pari età di controllo (Figura 3A). Cambiamenti neuropathological presso i nodi e il paranodes sono stati ben documentati in GBS; in particolare, l'AMAN variante11,12. Nel nostro modello murino di EAN, identifichiamo che l'allargamento dei nodi e dei disagi per il paranode è ulteriori caratteristiche neuropathological di P0180-199 indotto EAN (Figura 3B).
Figura 1: rappresentazione schematica del paradigma induzione EAN, clinico Punteggio ottenuto valutazione e capacità di esecuzione durante EAN. (A) Panoramica di induzione di EAN protocollo in topi C57BL/6, a cominciare dal 6-8 settimane di età, con schemi di (B) previsti punteggi clinici e (C) tempi di esercizio durante la malattia del corso (Vedi riferimento4). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: topi con EAN visualizzano perdita di mielina, danno della mielina e segni di stress assoni. (A) A brillante campo immagine (ingrandimento 100 X) prelevata da sezioni semi-sottile del nervo sciatico da sani di pari età di controllo. (B) un campo luminoso immagine (ingrandimento 100 X) preso da sezioni semi-sottile del nervo sciatico da topi indotti con EAN a 55 giorni post prima immunizzazione (dpi). Aree prive di mielina circondata da sottilmente myelinated assoni (frecce) indicano remyelination; Questo non è stato osservato nel tessuto ottenuto da controlli sani di pari età (Vedi A). (C), A rappresentante la microscopia fromsciatic nervi di immagine (ingrandimento inferiore 5.000 X) presa da pannello B dimostrando mielina patologia (freccia aperta) e lo stress dell'assone (Piazza di associazione che indica mitocondri gonfiati a 55 dpi). (D) un'immagine TEM di alto potere (rettangolo in C) dimostrando mitocondri gonfiati che sono indicativi dell'assone stress (teste di freccia), ma questo è assente da controlli sani di pari età (dati non mostrati). Barre di scala = 10 µm (A, B) e 500 nm (C, D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Lo stress dell'assone e patologia linfonodale è una caratteristica di P0180-199 indotto EAN. (A) su un unico piano immagini confocal (sotto ingrandimento 40x) prelevati attraverso il nervo sciatico a 55 dpi. Tessuto da topi EAN Visualizza drammaticamente elevata espressione di APP co-localizzati con segni che indicano di β-III tubulina (un marcatore di neuroni) di axonal stress. (B) ad alta potenza Z-proiezioni (ingrandimento 100 X) di paranodes macchiato con un anticorpo contro Caspr nelle sezioni del nervo sciatico. Nei nodi dai topi di EAN, c'è un aumento della distanza tra adiacente paranodes che indica come nodo ampliando. Inoltre, nodale patologia quale rottura della struttura di paranode può essere osservato nei topi di EAN ma è assente da controlli sani di pari età. Barre di scala = 10 µm (A) e 5 µm (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Punteggio ottenuto | Criteri | Note e commenti di criteri di valutazione |
| 0 | Normale mouse | |
| 1 | Meno vivace o lathery | Tale valutazione è effettuata in risposta a condizioni normali di manipolazione, topi in genere prima mostrano segni di attività ridotta a da 5 giorno post immunizzazione |
| 2 | Paresi di coda o | Paresi di coda è valutata tramite il test del colpo di coda (sfogliando la coda). |
| Paresi arto mite | Paresi arto mite si riferisce a topi trascinare loro ventre a terra quando si cammina su una superficie piana | |
| 3 | Coda di paresi + paresi arto lieve o | Lieve atassia è valutato come qualsiasi difficoltà nella camminata normale |
| Paresi + lieve atassia di coda o | ||
| Paresi arto mite + lieve atassia | ||
| 4 | Atassia severa | L'atassia severa è identificato da atipico indietro camminando, combinato con la paresi dell'arto, paresi arto mite o coda paresi |
Tabella 1: EAN clinica Punteggio paradigma.
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Discussion
Questo rapporto descrive un metodo semplice per indurre EAN utilizzando il peptide di180-199 P0 in topi C57BL/6, consentendo la quantificazione dei principali deficit neuropathological e funzionale in topi indotti con EAN. Distinto per il protocollo di induzione di EAN descritto qui è l'uso dell'anestesia durante l'esecuzione le iniezioni di immunizzazione. L'uso dell'anestesia isoflurano migliora notevolmente la capacità di garantire che il volume totale dell'inoculo viene iniettato per via sottocutanea nella posizione desiderata con il minimo errore e stress agli animali.
Topi inizierà a visualizzare segni clinici della malattia da dpi 64 utilizzando questo metodo di induzione di EAN. Tuttavia, l'esordio della malattia come misurato dal punteggio clinico precedentemente è stata segnalata per accadere da dpi ~ 109,10. Mentre questa differenza di esordio della malattia come determinato dal punteggio clinico potrebbe essere parzialmente a causa di diversi criteri di punteggi clinici, è più probabile ha spiegato mediante l'uso di differenti adiuvanti nell'inoculo per induzione di EAN. Questo protocollo utilizza adiuvante completo di Freund, una contenente M. butyricum, che è integrato con M. tuberculosis. Altri studi utilizzano l'adiuvante di Freund completato solo con M. tuberculosis in iniettato inoculo contenente il P0180-199 peptide9,10 per l'immunizzazione.
In questo protocollo, offrendo via i.p. l'iniezione della tossina di pertosse è consigliato preferenza endovenosa (i.v.) iniezione in vena di coda. Esso ha dimostrato che la modalità di consegna di pertosse non altera significativamente l' insorgenza o la progressione di malattia4, ma la scelta di consegnare per via i.p., al contrario di vena caudale i.v., è motivata dalla mitigazione del rischio e un tentativo di ridurre il possibilità di errore di funzionamento. Frequentemente, coda vena i.v. le iniezioni sono tecnicamente più impegnativo rispetto con le iniezioni di un volume uguale. Precedentemente è stato indicato che l'uso della tossina di pertosse come adiuvante è necessaria per indurre EAN quando si utilizza il P0180-199 peptide9. È interessante notare che, il lavoro precedente ha indicato che dimezzare la dose di pertosse delineato in questo metodo, è sufficiente per illecito EAN misurato dal punteggio clinico, neuropatologia e andatura allargamento durante tapis roulant in esecuzione4. Tuttavia, diminuendo la dose di tossina della pertosse utilizzato in durante EAN induzione influenza significativamente in esecuzione capacità e topi salterini significativamente migliore presso il tapis roulant in esecuzione attività quando EAN è indotta con metà della dose di pertosse descritte nel presente metodo 4.
Il deficit del motore osservato in questo modello EAN P0180-199 peptide indotto è accompagnato e sostenuto da forte evidenza neuropathological. In precedenza, è stato dimostrato che è abbastanza sensibile per rilevare le alterazioni nella severità di malattia che è derivato da dimezzare la dose di tossina della pertosse durante l'induzione di EAN quantificare l'entità del danno della mielina. Qui, altri segni distintivi di EAN come axonal stress e disagi alle strutture di nodo/paranodali sono identificati, risultante in una serie di indicatori quantitativi neuropathological per P0180-199 indotto EAN. In questo modo per gli esami più prudenti di neuropatologia durante la valutazione di processi di malattia, o l'efficacia di nuovi agenti terapeutici. Eccitante, queste valutazioni neuropathological possono essere correlate ai valori di lettura funzionale nel tentativo di fornire intuizioni più profonde e una migliore comprensione del rapporto tra il deficit di funzione che sono una caratteristica di questo modello di EAN e neuropatologia. Oltre all'analisi neuropathological e test di funzione andatura utilizzato in questo studio, altre valutazioni funzionali come la misura della velocità di conduzione del nervo sono suggeriti al fine di cogliere pienamente i risultati della funzione degli interventi terapeutici utilizzando Questo modello.
EAN è un modello sperimentale potente e comunemente utilizzato per esaminare il demyelination periferico e remyelination, con i nervi sciatici e cauda equina essendo più frequentemente studiati i nervi periferici. Il principale vantaggio di EAN è che provoca un deficit motorio riproducibili e quantificabili, consentendo così l'analisi di neuroprotezione e mielina riparazione da una prospettiva clinica. Inoltre, il danno della mielina è acuta e riproducibile permettendo così un'analisi dettagliata della mielina e danno assonale dal punto di vista istopatologico.
Mentre EAN modello rappresenta un emozionante mezzo sperimentale per indagare demielinizzanti neuropatia periferica, non ci sono limitazioni potenziali, nonché le sfide tecniche. È importante apprezzare la natura di eterogeneità di demielinizzanti neuropatia periferica in esseri umani, che coinvolge una complessa interazione tra il sistema immunitario e PNS. La sfida attuale è che un modello animale di EAN fedelmente non può imitare tutti i suoi aspetti. Infine, vi sono notevoli variazioni inter-specie e Inter-ceppo per quanto riguarda la gravità della malattia e la progressione del modello EAN. Ad esempio, abbiamo trovato che nel complesso il EAN indotta in topi C67/B6 è meno severo che il EAN indotto in ratti Lewis (dati non pubblicati). All'interno lo stesso sforzo, c'è anche differenza di genere. Nostri dati non pubblicati indicano che il modello EAN indotta nei topi C57/B6 maschio è più riproducibile rispetto quella indotta nei topi femmina, tuttavia, il motivo esatto su cui si fonda questa differenza di genere non è chiaro.
In conclusione, abbiamo segnalato un protocollo che consente un'induzione robusta e rapida del modello EAN in di topo maschio C57/B6. La combinazione di punteggio clinico e valutazione della funzione motoria con gli studi di neuropathological fornisce uno strumento strategico per lo studio della neuropatia periferica da prospettive sia cliniche e patologiche di demyelinating. D'importanza, promuove gli studi futuri sui meccanismi di terapie destinate a riparazione della mielina dei nervi periferici utilizzando approcci di topo transgenico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi per quanto riguarda questo lavoro.
Acknowledgments
DGG è un NHMRC Peter Doherty e sclerosi multipla ricerca Australia (MSRA) precoce carriera Fellow. JLF è supportato da una borsa di studio post-dottorato di MSRA. Questo lavoro è stato supportato dal Australian National Health e progetto del Consiglio di ricerca medica (NHMRC) concedere #APP1058647 JX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
References
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