Summary
Aquí, presentamos el nematodo Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar la interacción microbiana host versátil.
Abstract
Demostrar un método usando Caenorhabditis elegans como anfitrión modelo para estudiar la interacción microbiana. Microbios se introducen a través de la dieta haciendo que el intestino la ubicación primaria de la enfermedad. El intestino nemátodo estructural y funcionalmente imita los intestinos mamíferos y es transparente lo que es susceptible de estudio microscópico de la colonización. Aquí mostramos que el patógeno pueden causar enfermedad y muerte. Somos capaces de identificar a mutantes microbianos que muestran alteración de la virulencia. Su respuesta innata conservado a estreses bióticos hace C. elegans un excelente sistema para sondear facetas de interacción inmune innata de host. Mostramos que hosts con mutaciones en el gen de la oxidasa dual no pueden producir especies reactivas de oxígeno y son incapaces de resistir el insulto microbiano. Además demostramos la versatilidad del ensayo de supervivencia presentado mostrando que puede ser utilizado para estudiar los efectos de los inhibidores del crecimiento microbiano. Este ensayo también puede ser usado para descubrir factores de virulencia de hongos como dianas para el desarrollo de nuevos antifúngicos, así como proporcionar una oportunidad para descubrir otras interacciones host-microbio. El diseño de este ensayo presta bien a alto rendimiento pantallas de todo el genoma, mientras que la capacidad de gusanos de crio-conservar para uso futuro, es un modelo rentable y atractivo todo animal para el estudio.
Introduction
C. elegans se ha utilizado como organismo modelo de gran alcance para más de 50 años. En la década de 1960, biólogo sudafricano Sydney Brenner pionero en el uso de C. elegans a estudiar desarrollo neuronal, allanando el camino para un largo linaje de científicos para estudiar diversos aspectos de la biología celular y animal de nematodos. Este linaje incluye a galardonados con el Premio Nobel Craig Mello y Andrew Fire para su trabajo de ARNi1, Robert Horvitz y John Sulston por su trabajo en el desarrollo de órganos y apoptosis2,3,4, Martin Chalfie por sus trabajos sobre la proteína fluorescente verde5. Aunque este organismo modelo se ha utilizado tradicionalmente para el estudio de biología molecular y del desarrollo, en los últimos 15 años, los investigadores han comenzado a utilizar C. elegans para investigar la biología de los patógenos humanos diversos incluyendo Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericay Serratia marcescens6,7,8,9,10. Estos estudios revelaron que muchos de los mecanismos implicados en la interacción de patógenos humanos se conservan en nemátodos, pero también que hay algunos mecanismos de inmunidad que son exclusivos de este organismo modelo11,12. En la naturaleza, C. elegans se encuentra con una variedad de amenazas de los agentes patógenos presentes en el suelo y esto ha proporcionado una fuerte presión selectiva para evolucionar y mantener un sistema inmune innato sofisticado en su lumen intestinal. Muchos de los genes y mecanismos involucrados en la protección de la luz intestinal están orquestados por elementos altamente conservadas que también existen en los mamíferos superiores11,13. C. elegans , por tanto, representa un gran modelo para el estudio de patógenos gastrointestinales como Salmonella enterica14, Shigella boydii15o16de cólera del vibrión.
Aquí destacamos la notable versatilidad de C. elegans como anfitrión modelo para el estudio de agentes infecciosos tales como C. albicans. C. elegans como anfitrión modelo permite la detección de alto rendimiento de virulencia que es menos costoso y desperdiciador de tiempo que un modelo de ratón, que se utiliza comúnmente para el estudio de la candidiasis42.
En este estudio, mostramos que este modelo y el análisis de supervivencia assosiated pueden ser confiablemente utilizados para estudiar efectores inmune innata del huésped importantes para contrarrestar infecciones, determinantes patógenos que virulencia, y compuestos farmacológicos que pueden intervienen en la patogénesis. Diferentes ensayos anteriormente descritos, este método proporciona un medio de estudiar la exposición a un patógeno durante la vida del animal, desde el estado larvario a la edad adulta, en lugar de sólo la edad adulta a muerte43,44. En Resumen, nuestro C. elegans - modelo de C. albicans es una herramienta versátil y poderosa que puede utilizarse no sólo para estudiar las bases genéticas que conducen a la infección y la inmunidad, sino para identificar nuevos compuestos para la intervención terapéutica.
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Protocol
1. preparación de medio de crecimiento nematodo (NGM)
- para 1 L de medios de comunicación combinan agar 20 g, 2,5 g fuente de nitrógeno orgánico (e.g., bacto-peptona) y 3 g de cloruro de sodio en un matraz de 2 L. Añadir 975 mL de agua estéril.
- Agregar en una barra de agitación estéril. Si se utiliza un dispensador automático de medios de comunicación, tubería de autoclave y media durante 15 min; los medios de comunicación deben ser esterilizado para ya si es un volumen más alto.
- Establecer los medios de comunicación en remover la placa y deje para enfriar.
- Una vez que los medios de comunicación está caliente al tacto (aproximadamente 60 ° C) asépticamente añada 1 mL de 1 M MgSO 4 ● H 2 O, 1 mL de 1 M de CaCl 2, 25 mL de KPO 4 y 1 mL de colesterol de 0,5% en etanol.
- Vierta media (manualmente o por bomba automática) bajo flujo laminar en 35 x 10 mm placas de petri estériles. Deje que se seque bajo campana por 1-2 días antes de su uso.
Nota: Las placas deben guardarse a 4 ° C para evitar la contaminación.
2. Hacer un gusano Pick
- corte un pedazo de 1,5 cm de alambre de aluminio. Cuidadosamente Inserte la punta de una pipeta Pasteur aproximadamente 0,5 cm de esta longitud.
- Usando un quemador de Bunsen o lámpara de alcohol, fundir la punta de la pipeta de cristal girando lentamente en la llama hasta que el alambre se adhiere firmemente a la pipeta, sin comprometer la forma original de la punta de la pipeta.
3. Preparación de la cultura de e. coli
- utilizando un asa estéril, inocular una colonia de e. coli cepa OP50 en 200 mL de caldo Luria. Incubar durante una noche con agitación a 37 ° C.
- El cultivo líquido está listo para usar al día siguiente y pueden ser almacenada a 4 ° C cuando no esté en uso.
Nota: La cepa de e. coli, OP50, se utiliza como fuente de alimento para C. elegans. Este cultivo puede ser utilizado por hasta varios meses si se almacena a 4 ° C.
4. Esencial C. elegans mantenimiento
- semilla preparada las placas de agar NGM con e. coli por manchas aproximadamente 50-100 μl de preparados OP50 cultivo líquido en el centro de la placa de.
- Placas y déjelos secar a temperatura ambiente durante 24 h. Una vez seco, colocar las placas a 37 ° C durante la noche para un rápido crecimiento o mantener a temperatura ambiente, si se desea un crecimiento más lento.
- Añada gusanos a la placa o " trozos, " (ver protocolo paso 5 " Chunking y recogiendo gusanos "), recogiendo gusanos individualmente o colocar huevos de gusano directamente sobre la placa (ver protocolo paso 6 " huevo preparación ").
5. Chunking y recogiendo gusanos
Nota: " trozos, " se refiere a una práctica que es común en el mantenimiento de C. elegans. Se trata de cortar una sección de la placa de agar NGM que contiene gusanos y así también transferir esta pieza en un plato nuevo, transferir un gran número de gusanos en el proceso. La contaminación también puede cortar de la placa de esta manera. Cuando recogiendo gusanos, es importante mantener la integridad del agar porque gusanos pueden ser perdidos en los agujeros en el agar. Además, es importante permitir que la hoja se enfríe antes de tocar la placa para evitar fundir el agar o quema los gusanos.
- Para transferir rápidamente grandes cantidades de gusanos en las nuevas placas, cortar un trozo de agar NGM que contiene las lombrices seleccionadas con una espátula. Retirar la pieza cortada y poner cara abajo en el borde del césped de OP50 en un plato nuevo.
- Transferencia de gusanos individualmente como se describe a continuación en el paso de protocolo 8.2, " Análisis de la supervivencia, " utilizando un gusano pick. La llama el alambre en la recogida del gusano hasta que esté rojo. Retire del fuego y deje que se enfríe durante unos segundos.
- Con el cable en la selección, raspar suavemente el césped de la cultura OP50 crecido en la placa de nuevo, cubriendo el hilo en el pico.
- La cultura viscosa que cubre la punta del alambre hace gusanos se pegan a la punta de la ganzúa, así suavemente recoger gusanos seleccionados con un movimiento de swiping.
- Una vez que las lombrices se reúnen, colocarlos en un plato nuevo deslizando suavemente la cultura en el agar. Coloque el alambre en la llama para eliminar la cultura restantes en la selección.
6. Preparación del huevo
- colocar aproximadamente 20 animales adultos (aproximadamente 2-3 días después de la eclosión, cuando se cultiva a 20 ° C) por cosecha o por trozos como se describe en el paso 5, de protocolo " Chunking y recogiendo gusanos, " en una placa sembrada con 50 Μl de cepa de e. coli, OP50.
- a recoger los huevos, inundar la placa con 10 mL de buffer M9 después de 1-2 días. Utilizando una pipeta serológica de vidrio, agitar y agitar suavemente el contenido sobre la placa de agar para lanzar huevos atascados OP50 o animales adultos. Recoger todo el líquido que contiene los huevos y adultos. Tubo de
- solución de transferencia M9 y OP50 en un cónico de 15 mL. Centrifugar el tubo cónico de 15 mL a 2.100 x g durante 2 min
- Aspirar aproximadamente 9 mL del sobrenadante sin perturbar el pellet OP50.
- Resuspender el precipitado en 2 mL de agua estéril, 1 mL de blanqueador y 1 mL de NaOH M 0.25.
- Mezclar suavemente por inversión hasta que la mayoría (aproximadamente el 70 por ciento) de los animales adultos aparece sometidas a lisis, por lo general, huevos permanecen intactos durante este tratamiento blanqueador corto debido a su cáscara. Centrifugar el tubo cónico a 990 x g durante 2 min
- Aspirar sobrenadante sin perturbar el pellet. Resuspenda el sedimento en 10 mL de buffer M9.
- Centrifugar el tubo cónico en 990 x g para 2 min aspirar sobrenadante sin pellets inquietante. Vuelva a suspender los pellets con 200 μL de buffer M9.
Nota: La preparación de huevo puede requerir múltiples ensayos. Huevos pueden ser destruidos si se exponen para blanquear demasiado. Si no salen de los huevos, disminuir la concentración de cloro en solución o disminuir la duración de la exposición a bleach.
7. Instalación de placa de infección
- distribuir 3-5 mL de YPD en un tubo de ensayo estéril y sembrar con una sola Colonia de Candida albicans utilizando un asa estéril.
- Coloque el tubo en un tambor rotatorio para aproximadamente 16-18 h a 30 ° C.
- Etiqueta un 1,5 mL tubo de microcentrífuga para contener C. albicans y otro para contener OP50. Registrar el peso de cada tubo de vacío.
- Lugar 500 μl de la noche a la mañana cultura de C. albicans en el tubo con la etiqueta C. albicans y 1.500 μl de la noche a la mañana OP50 cultura (paso 3.1) en el tubo etiquetado OP50.
- Centrifugar 10 min a 16.100 x sobrenadante de aspirado g. sin pellets inquietante.
- Resuspender cada pellet con 500 μl de agua estéril. Centrifugar durante 5 min a 16.100 x g.
- Aspirar sobrenadante sin perturbar el pellet. Registrar el peso final de los tubos del microfuge.
- Determinar el peso de cada pellet restando el peso inicial de los tubos de microcentrífuga del peso final.
- Con agua estéril, Resuspender el pellet de C. albicans a 10 mg/mL y el sedimento OP50 a 200 mg/mL. Hacer una infección principal mezcla combinando 10 μl de una solución de 50 mg/mL de estreptomicina, 2.5 μl de cultivo OP50, 0,5 μl del cultivo de C. albicans y 7 μl de agua estéril.
- Para las placas de control, crear una mezcla principal reemplazando el volumen de la cultura de C. albicans con agua estéril. De semilla de 20 μl de mezcla de infección o solución de control OP50 sobre las placas del centro de NGM utilizando una micropipeta.
Nota: Se necesitan aproximadamente 100 gusanos para determinar significación estadística durante el análisis. Este ensayo se ejecuta normalmente por triplicado. Por lo tanto, se hace un 3.2 x mezcla de infección, así como a 3.2 x solución de control. Estas mezclas se hacen para ser un poco sobre 3 x el original para asegurarse de que se siembra un total de 20 μl en cada plato, permitiendo espacio para error. Esta mezcla principal se crea porque la faringe del gusano es insuficiente durante las primeras etapas larvales (L1-L3) consumir C. albicans. La exposición a agentes farmacológicos como el fluconazol ( figura 3B), el agente se introduce en la mezcla de la infección. Empíricamente se determina la concentración del agente. Por ejemplo, en la figura 3B, 50 μm fluconazol está representado, sin embargo 0, 12,5, 25, 50 y 100 μm fluconazol también fueron probados usando el mismo protocolo de.
- Para las placas de control, crear una mezcla principal reemplazando el volumen de la cultura de C. albicans con agua estéril. De semilla de 20 μl de mezcla de infección o solución de control OP50 sobre las placas del centro de NGM utilizando una micropipeta.
8. Análisis del fenotipo de deforma la región Anal (Dar) y análisis de supervivencia
- Visualize el fenotipo de Dar
Nota: Dar mejor se visualiza en la fase L3 y más allá. Dar se presenta como una pequeña protuberancia en la región anal post del gusano ( figura 2A), que llega a ser más prominente con el tiempo.- Confirmar si un animal tiene Dar rápidamente tocando la placa en la etapa del microscopio de disección, animales sin Dar voluntad mover hacia atrás inmediatamente, mientras que animales con Dar cualquier necesidad repetidas rondas de tapping para invertir su dirección, o no lo hará en todo.
- Análisis de supervivencia
- preparación de huevo completo, como se describió anteriormente en el paso del Protocolo 6, " huevo preparación ". Contar los huevos bajo el alcance de la disección y diluir la solución de huevo con M9 hasta alcanza una concentración de aproximadamente 5-6 huevos sanos por μl. Utilizando una pipeta, dispensar 20 μl de muestra que contenga aproximadamente 30 huevos en plato NGM preparado, en el área entre el cultivo bacteriano y el lado de la placa (huevos y comida de gusano, OP50, están en dos lugares distintos).
- Incubar las placas a 20 ° C durante 48 h. Debajo de un microscopio de disección, cuenta el número de gusanos vivos y muertos adultos en cada plato, así como el número de gusanos con Dar. Registrar el porcentaje con Dar.
- Considerar un animal muerto si no responde al ser golpeada en la cabeza por un alambre de aluminio o golpear ligeramente en la plancha.
- Día, transferencia gusanos adultos restantes por selección como se describe en el paso 5, de protocolo " Chunking y recogiendo gusanos, " en un plato nuevo de infección o control. En este punto, si es necesario, realizar un análisis de supervivencia mediante el seguimiento del número de gusanos vivos, muertos y desaparecidos cada día.
Nota: Este ensayo puede funcionar durante dos semanas, comenzando con la preparación de huevo. Además, la solución de huevo debe no distribuirá en el cultivo bacteriano, como la solución puede contener trazas de cloro que puede matar el OP50. La solución también debe ser despachado aproximadamente 0,5 cm del borde de la placa, como huevos pueden atorarse entre los lados de la placa y el agar. Además, debido a la rápida proliferación de gusanos adultos en nuevas placas de transferencia es fundamental para separarlos de su progenie.
- Analizar la supervivencia
- analizar los resultados utilizando el software de análisis de curva de supervivencia (véase lista de materiales). Curvas de
- compara la supervivencia mediante el método de Breslow-Grehan-Wilcoxon (suponiendo que los datos de los primeros tiempos de supervivencia son más precisos que tiempos posteriores, los datos de peso por consiguiente) así como herramientas estadísticas de rango logarítmico 45.
Nota: Por ejemplo, en la Figura 4B -C, la supervivencia de gusanos tratados con mutantes de C. albicans es comparada con aquellos tratados con controles de tipo salvaje isogénicas o complementarystrains.
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Representative Results
Un análisis de la patogenia (figura 1) con C. albicans y C. elegans se ha descrito previamente por nuestro laboratorio17,18 y otros laboratorios19,20. Demostramos la receptividad del uso de C. elegans para el estudio de virulencia de C. albicans que demuestran que las células de C. albicans son ingeridas rápidamente por los gusanos y se acumulan en la luz intestinal causando locomoción más lento, deformado anal región (Dar) (figura 2A), hinchazón de la vulva (figura 2B), distensión del intestino (Figura 3A) y mortalidad (figura 3, figura 4). También medimos la vida de gusanos infectados como una medida cuantitativa de la aptitud. Por ejemplo, C. elegans infectados con C. albicans vivir 10-12 días en comparación con 20-22 para los controles no infectados. En C. elegans infectados con el golpe doble de C. albicans a mutante, efg1/efg1 cph1/cph1, que son dos factores de virulencia clave necesarias para la infección en ratón, ratas y humanos epiteliales modelos21, 23, nematodos sobrevivieron significativamente mayor que los controles (figura 3B). Estos experimentos sugieren que algunas de las lecciones que aprendemos en este modelo más simple sobre la virulencia de C. albicans pueden permanecer válido en mamíferos más altos y viceversa.
También demostramos que el sistema de modelo de nematodos puede ser modulados farmacológicamente (figura 3B). En presencia de fluconazol, los antimicóticos recetados con más frecuencia, gusanos con C. albicans sobrevivieron significativamente mayor que los controles. Esta prueba de experimento principio sugiere que el modelo de nematodos puede utilizarse para la detección de pequeñas moléculas. De hecho, nuestro modelo de C. elegans era instrumental en la identificación de filastatin, una pequeña molécula que inhibe varios aspectos de la virulencia de hongos24.
Fenotipos de la enfermedad y el análisis microscópico de C. elegans infección
C. elegans fueron expuestos a C. albicans en un período de seis días y observa signos de infección, la progresión de la enfermedad y la muerte. El fenotipo de Dar es más visible durante el día 4 de la prueba de supervivencia, como señaló una protuberante región anal que no es visible en los animales no infectados (figura 2A). Gusanos infectados por C. albicans también son conocidos por exhibir hinchazón en la región de la vulva (figura 2B). En ambos casos, el gusano es capaz de eliminar la infección después de llegar a esta etapa. Para poder visualizar la colonización de C. albicans en el lumen intestinal, gusanos fueron alimentados tipo C. albicans etiquetados RFP, que provocan zonas de colonización a fluorescencia roja (Figura 3A). Para producir estas imágenes, gusanos fueron anestesiados en una plataforma de agarosa al 2% que contiene azida de sodio de 0.01 M. Gusanos fueron expuestos a tipo salvaje C. albicans o RFP etiquetado C. albicansy transferidos en buffer de M9 de 5 μm en el cojín de agarosa. La almohadilla de agarosa luego se cubrió con un cubreobjetos. Gusanos eran vistos en 200 X y 400 aumentos, utilizando un microscopio invertido con capacidades de microscopía fluorescente. Las imágenes fueron creadas bajo contraste diferencial de interferencia (Nomarski) y epifluorescencia óptica. Las imágenes fluorescentes fueron realzadas utilizando el software (Figura 3A). Micrografías de la serie de tiempo de gusanos infectados determinan que C. albicans colonizaron el lumen intestinal al tercer día de ensayo17. Gusanos infectados mostraron distensión intestinal más grave que el observado en el control no infectado.
Herramientas genéticas y farmacológicas para el estudio de la infección
A continuación, probamos el modelo utilizando la modulación genética y farmacológica. Probamos también factores de virulencia anteriormente documentado que regulan hyphal transición de C. albicans25 y se han demostrado para ser importante en las infecciones en vivo de ratones y nematodos20,26 . Probamos la capacidad de sobrevivir la infección causada por C. albicans efg1/efg1 cph1/cph1 doble mutante. de los gusanos Efg1 es un factor de transcripción altamente conservadas y un componente esencial de la vía metabólica de AMP cíclico/proteína quinasa A (PKA). En C. albicans esta vía regula la morfogénesis hyphal27, blanco opaco28y un arsenal de factores de virulencia principales de conmutación. Estos factores de virulencia incluyen Hwp1 y Hwp2, dos proteínas de la pared celular de levadura específicos involucrados en la adhesión y formación de biopelículas, Eap1, una adhesina de pared celular implicado en la Unión a células epiteliales humanas29y Sap5, una enzima hidrolítica en invasión de tejido epitelial30. Cph1 es un factor de transcripción que regula muchos procesos metabólicos incluyendo apareamiento, filamentación y formación de biopelículas y se ha demostrado que juega un papel crítico en el daño de las células epiteliales31 y epitelio humano reconstruido21 . Interrupción de cualquiera de estos genes tiene un impacto importante en la virulencia y la interrupción simultánea de ambos en los resultados de cph1/cph1efg1/efg1 reducción dramática virulencia en diversos modelos animales, incluyendo ratones25, Drosophila 32, pez cebra33,34 y34de la polilla. El mutante doble cph1/cph1efg1/efg1 es considerado por la comunidad de C. albicans como la cepa insipidez por definición y el estándar de oro para la validación de los sistemas del nuevo modelo. La Δ efg1y cph1Δ solo mutantes mostraron disminución Dar (~ 10% y 50%, respectivamente) en comparación con el tipo salvaje cognado, mientras que el mutante doble efg1Δ cph1Δ no pudo sacar el Dar respuesta17. Estos resultados recapitulan el patrón de virulencia en ratones, donde el mutante de cph1∆ se atenúa un poco, el mutante de efg1∆ es significantly atenuado, y la doble mutante es completamente avirulentas25. Gusanos infectaron con efg1 cph1/cph1 / efg1C. albicans doble mutante vivieron significativamente más que los controles (p < 0.01 para prueba estadística Log Rank y Breslow, n = 60) lo que sugiere que estos dos genes se requieren para C. albicans virulencia contra C. elegans (figura 3B).
Con el fin de explorar la posibilidad de utilizar nuestro modelo de C. elegans para la detección de drogas potenciales, probamos el efecto de la adición de fluconazol en el resultado final de la infección. Se utilizó una variedad de diferentes concentraciones de fluconazol y encontraron que 50 μm nos proporcionaba los resultados más significativos. Gusanos infectados con C. albicans y 50 fluconazol μm (figura 3B) vivieron significativamente más que los controles (p < 0.01 en prueba estadística Log Rank y Breslow, n = 60). Esta concentración se determinó empíricamente (véase la nota al final del paso del Protocolo 7, "placa de infección establece"). Estas prueba de experimentos principio demostró que nuestro modelo de nematodos puede usarse para proyección antihongos de molécula pequeña. El modelo de hecho fue el descubrimiento de filastatin, una pequeña molécula que inhibe varios aspectos de la virulencia de hongos que se están realizando más estudios preclínicos24. Por consiguiente, nuestro análisis es conveniente para explorar las estrategias de la virulencia de C. albicans y agentes farmacológicos.
Estudio de la respuesta innata del anfitrión
A continuación, hemos querido estudiar las defensas recíproca del huésped frente a patógenos, ya que se conservan aspectos de esta inmunidad innata en mamíferos11,35. Es bien conocido que C. elegans produce ROS a ambas infecciones bacterianas y fungicidas18,36,37 como parte de su mecanismo de defensa. ROS tienen un efecto biocido en invadir organismos y juega un papel importante en la inmunidad innata. zcf15/zcf15 hiper sensibilidad a ROS en vitro nos llevó a la hipótesis de que su virulencia reducida en C. elegans era debido a una capacidad reducida para soportar que el host genera ROS. Para probar nuestra hipótesis, se determinó la capacidad de zcf15/zcf15 para matar gusanos del tipo salvaje o gusanos con una capacidad para producir ROS. Representante C. albicans mutante zcf15 que es sensible a especies reactivas de oxígeno (Figura 4A) mostradas reducida virulencia de tipo salvaje C. elegans. C. elegans responde a la ingestión del patógeno mediante la producción de ROS extracelular en la luz intestinal mediante Ce-Duox1, una NADPH oxidasa codificada por el gen bli-3. Durante la producción de ROS, las células intestinales también producen antioxidantes intracelulares vía DAF-16 para proteger a sus propios tejidos de la ROS dañinos efectos36,38. CE-Duox1 es una proteína con un dominio N-terminal de peroxidasa, dominio de NADPH-oxidasa superóxido-generación C-terminal y dos sitios de unión a calmodulina central39. Sobre la infección microbiana, esta proteína utiliza NADPH citosólico para generar ROS tóxicos extracelular en la luz intestinal para contrarrestar la infección. A lo largo de una serie de análisis bioquímicos en un estudio de 2009, Jain et al demostró que ROS se producen abundantemente sobre la infección por levaduras y que bli-3 la pérdida de función a través de bli-3(e767) reduce considerablemente la capacidad de los nemátodos para producir ROS. Como se muestra en la Figura 4B, gusanos con zcf15/zcf15 sobrevivieron significativamente más de tipo salvaje o cepas complementadas (p < 0.01 por el test log-rank) que indica que ZCF15 es necesaria para la virulencia. Sin embargo, cuando nos desafió a ROS-deficiente C. elegansbli-3(e767), se obtuvo la cinética de matanzas que fueron comparables entre zcf15/zcf15, tipo salvaje y complementa tensión (figura 4). Esta evidencia indica que zcf15/zcf15 no matar nematodos si no se compromete la capacidad del hospedador para producir ROS. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que ZCF15 es necesaria para plena virulencia y que este gen probablemente participa en la capacidad del patógeno para resistir host genera ROS. A lo mejor de nuestro conocimiento, éste es la primera vez que ZCF15 se ha demostrado para ser implicados en la patogenicidad y resistencia de ROS.
Figura 1: Representación esquemática de la infección de C. elegans . C. elegans son expuestos a una mezcla de cepa de e. coli OP50 y un patógeno y observan durante un período de 4 días después de alcanzar la edad adulta por signos de infección y la progresión de la enfermedad.
Figura 2: fenotipos de la enfermedad. (A) región anal deformados (Dar) es visible (indicado con una flecha) como hinchazón en la región post anal de gusanos infectados (panel derecho) cuatro días post exposición. Los gusanos en el panel izquierdo son no infectados y sirven como un control. (B) un subconjunto (~ 15%) de infectados gusanos mostrar una hinchazón de la vulva (panel de la derecha, indicado con una flecha) en comparación con gusanos control no infectado (panel de la izquierda) que representa la muerte matricidal de infección diseminada. Todas las imágenes fueron tomadas como se describe en los resultados representativos18.
Figura 3: C. albicans - modelo de C. elegans es susceptible de manipulación microscópica y puede modular farmacológicamente y genéticamente. (A) C. albicans etiquetadas con acumulación de RFP en la infección de nematodos lumen intestinal día 3 post. Las células de levadura son ingeridas rápidamente por los gusanos y se acumulan en la luz intestinal completamente intacta, indicando que son capaces de sobrevivir la trituración mecánica de la faringe. Imágenes fueron tomadas como se describe en los resultados representativos18. (B) las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier de nematodos con tipo C. albicans, cph1/cph1efg1/efg1 doble mutante o de tipo salvaje C. albicans + 50 μm del fluconazol en comparación con control no infectado de gusanos.
Figura 4. ZCF15 se requiere para soportar C. elegans genera ROS. (A) ZCF15 es responsable de tipo salvaje resistencia a paraquat, que se conoce para generar especies reactivas de oxígeno. Tipo salvaje, knockout o complementa las cepas fueron cultivadas en cultivo líquido durante la noche y resuspendido en OD = 1. Las culturas eran cada diluido 1:5 y plateado YPD o YPD que contiene paraquat 1 mM. C. elegans producir ROS vía bli-3 para combatir patógenos que invaden la luz intestinal38. (B) curvas de supervivencia de Kaplan-Meier muestran que ZCF15 eliminación limita la matanza de gusanos de tipo salvaje. (C) curva de supervivencia Kaplan-Meier de la muestra las mismas tasas de supervivencia entre zcf15/zcf15, tipo salvaje y tensión complementa cuando infectaron a ROS-deficiente C. elegansbli-3(e767) .
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Discussion
Los métodos de ensayo de infección de C. elegans y supervivencia sobre exposición de por vida a C. albicans que hemos descrito pueden ser modificados para probar otro patógeno. Cultivos líquidos de otra bacteria u hongo pueden hechos y alimenta a C. elegans de manera similar. Además, pueden ensayarse la serie infecciones exponer primero la larva a un patógeno como se describe, y luego transferir los animales en un nuevo plato que contiene un patógeno independiente después de alcanzar la edad adulta.
Durante la realización de este ensayo, es importante prestar mucha atención a tiempo. En primer lugar, al terminar la preparación del huevo con el fin de la cosecha de huevos para el ensayo, es crítico para limitar la cantidad de tiempo que los huevos están expuestos para blanquear. La cantidad de tiempo necesario para disolver los adultos en la solución de cloro para liberar los huevos varía. Inmediatamente después de administrar la solución de lejía, la solución de gusano debe verse estrechamente bajo un microscopio de disección. Una vez que aproximadamente el 70% de los gusanos se han desintegrado, la solución debe ser centrifugada. Si huevo preparación no producen huevos viables, disminuir la concentración de cloro o la duración de la exposición al cloro. En la realización de este ensayo, también es crucial que se preste atención a transferencia gusanos adultos sobre placas nuevas según sea necesario para no confundir sujetos del estudio con su progenie. Limitar el número de huevos que plateó al inicio del ensayo a 25-30 huevos debe evitarlo así. Finalmente, transferencia de gusanos adultos en las placas nuevas con frecuencia disminuye también las posibilidades de gusanos arrastrándose por los lados de la caja Petri y morir.
Hemos utilizado Caenorhabditis elegans como anfitrión modelo para estudiar las relaciones patógenas o comensales entre microbios o un microbio y su huésped. Nuestro sistema puede ser utilizado como una herramienta para estudio microbiano o microbio host interacción a nivel celular y molecular usando métodos genéticos hacia adelantados y hacia atrás, sino también para explorar nuevas moléculas para la intervención terapéutica. Hemos demostrado la versatilidad de este sistema mediante la realización de una pantalla genética para identificar genes que contribuyen a la virulencia40, aquellos vinculados a microbiana fitness41, los que median la respuesta del huésped a microbios17, 18, así como usando el modelo de aplicaciones de alto rendimiento para droga descubrimiento24. Este es un buen modelo para el uso de estudiantes porque no necesita infraestructura costosa para mantener las colonias, teniendo en cuenta que los animales pueden ser crio-preservadas para futuras aplicaciones. Finalmente, esto proporciona un perfecto "mediador" para estudios en vitro y en modelos murinos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue realizado en y apoyado por el Instituto Politécnico de Worcester.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (granulated, bacterilogical grade) | Apex BioResearch Products | 20-248 | |
| Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) | Genesee Scientific | 59-1M32P | |
| Axiovision Zeiss Inverted Microscope | Axiovision Zeiss | ||
| Bacto-Peptone | Fisher BioReagants | BP1420-500 | |
| C. elegans strain Bli-3 | Caenorhabditis Genetics Center | Bli-3(e767) CB767 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP51-250 | |
| Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% | Sigma | C8667-25G | |
| Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) | FIsherBrand | 14-961-33 | |
| Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) | Nikon Instrument Inc. | ||
| E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) | GraphPad Software | ||
| LB Broth (Miller's) | Apex BioResearch Products | 11-120 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Wildtype C. albicans SC5314 | ATCC | SC5314 | |
| Wildtype C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center | N2 |
References
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