Summary
ويصف هذا البروتوكول كيفية حفز الخلايا مع الببتيدات المشتقة من الميتوكوندريا، وتقييم تتالي إرسال الإشارات والتعريب والرمات-البروتينات.
Abstract
الببتيدات المشتقة من الميتوكوندريا (مدبس) هي فئة جديدة من الببتيدات التي تم ترميزها بإطارات صغيرة للقراءة المفتوحة داخل جينات أخرى معروفة لجينوم المتقدرية. وقد مدبس طائفة واسعة من الآثار البيولوجية مثل حماية الخلايا العصبية من المبرمج، وتحسين علامات التمثيل الغذائي، وحماية الخلايا من العلاج الكيميائي. هومانين كان أول حزب الألفية الديمقراطي يمكن اكتشافها وهو الببتيد درس آخر بين أسرة حزب الألفية الديمقراطي. قد اتسمت بعناية مستقبلات الغشاء ومسارات الإشارات المتلقين للمعلومات من هومانين. مدبس إضافية مثل الكلمات-ج و SHLP1-6 وقد اكتشفت في الآونة الأخيرة ولم توضيح آليات إرسال الإشارات. هنا يمكننا وصف أسلوب ثقافة القائمة على خلايا لتحديد وظيفة هذه الببتيدات. على وجه الخصوص، تقنيات تجزئة الخلية في تركيبة مع النشاف الغربية يسمح بتحديد كمي للتنشيط وازفاء جزيء إشارات هامة. في حين أن هناك أساليب أخرى لتجزئة الخلية، الموضحة هنا طريقة سهلة ومباشرة. يمكن استخدام هذه الأساليب لتوضيح إليه العمل هذه الببتيدات والعوامل العلاجية الأخرى.
Introduction
وتبين الدراسات الناشئة أن الببتيدات المشتقة من الميتوكوندريا (مدبس) تلعب دوراً هاما في سيتوبروتيكشن والايض2،،من13. فهم المسار توصيل الإشارات حضور مدبس يعطينا نظرة ثاقبة الآلية التي تعدل مدبس وظائف مختلفة. الديمقراطي التي تم تحديدها أولاً، هومانين، قد ثبت أن زيادة خارج الخلية كيناز ينظم إشارة 1/2 (ERK1/2) الفسفرة من خلال مستقبلات لها ملزمة4،5. غير تأثير المصب التنشيط ERK1/2 لا يزال مستقصاة.
تتالي ERK1/2 يعمل كوسيط أساسي في مجموعة متنوعة من العمليات الخلوية بما في ذلك الانتشار والهجرة الخلية والايض الخلوي، والبقاء على قيد الحياة والمبرمج6،،من78. لتنسق جميع هذه العمليات الخلوية متميزة، والنشاط والتعريب سوبسيلولار ERK1/2 أحكام ينظم فوسفاتاسيس والسقالة البروتينات9،10. بالإضافة إلى تعديل بوستترانسلاشونال، جولات مكوكية دينامية ERK1/2 ينظم أيضا إرسال الإشارات الدالة، والنشاط، وخصوصية11،12. هو أساسا في سيتوسول13مترجمة ERK1/2. تساعد مجموعة من البروتينات وترسيخ سقالة الاحتفاظ ERK1/2 في العناصر سيتوسكيليتال، على السطح من العضيات، أو تنتشر في السيتوبلازم13. عند التحفيز، وهو فوسفوريلاتيد ERK1/2 ويصبح ينفصل ترسيخ البروتينات، مما يتيح نقل جسد ERK1/2 إلى المقصورات سوبسيلولار الأخرى، بما في ذلك نواة، الميتوكوندريا، غولجي، و، ليسوسوميس14 15 , 16.
على الرغم من أن من المعروف هومانين لتنشيط ERK1/2 يشير إلى المسار، فقط لوحظ أن تفعيل ERK1/2 في ليساتيس خلية الإجمالي. كما هو موضح سابقا، نظراً للترجمة سوبسيلولار ERK1/2 يلعب دوراً حاسما في أثره المتلقين للمعلومات، وتحليل التعريب سوبسيلولار ومستويات إجمالي فوسفوريلاتيد ERK1/2 ضروري لتوفير فهم شامل ERK1/2 التي يسببها هومانين التنشيط وتفعيل أهداف المتلقين للمعلومات.
فهم العضيات الهدف من تنشيط ERK1/2، تم إجراء تجزئة سوبسيلولار تليها النشاف الغربية فوسفوريلاتيد ERK1/2. ويمكن تنفيذ هذا الأسلوب بسهولة كما أنها تستخدم معدات المختبرات القياسية والكواشف. المقصورات سوبسيلولار معزولة بدرجة نقاء عالية، مما يسمح في النتائج التي تفسر بشكل مباشر. إيمونوستاينينج ERK1/2 قد تسفر عن نتائج مماثلة. بعض المقصورات سوبسيلولار غير الثابتة نسبيا لتصور وتتطلب أساليب التثبيت وبيرميبيليزيشن الخاصة. تختلف مستويات ERK1/2 في المقصورات سوبسيلولار، وهذا الاختلاف يمكن أن تسبب الإشارات السلبية إيجابية وكاذبة كاذبة عند النظر في كل خلية ليساتيس. ولذلك، إيمونوبلوت استخدام المقصورات سوبسيلولار معزولة يعطينا فهم أفضل للتعريب ERK1/2.
براعة الأسلوب الذي يتيح إدخال تعديلات على البروتوكول للتحقيق في آثار المنشطات الأخرى بما في ذلك أخرى مدبس أو إزفاء من جزيئات إشارات أخرى مثل STAT3. مؤخرا تم ترميزها المكتشفة الصغيرة مثل هومانين الببتيدات (شلبس) من منطقة الرنا الريباسي 16S حيث يتم ترميز هومانين، ولديهم خصائص مشابهة ولكنها متميزة بالمقارنة مع حماد17. على سبيل المثال، تنشيط SHLP2 و SHLP3 ERK1/2 بعد 8 س على الرغم من أن ينشط هومانين ERK1/2 ضمن الحد الأدنى 5 دراسة الترجمة سوبسيلولار ERK1/2 ردا على الببتيدات مختلفة سيتيح لنا فهم أفضل لعلم الأحياء من هذه الببتيدات. تظهر الأدلة أظهرت أن توطين سوبسيلولار مما يشير إلى جزيئات تلعب دوراً حاسما في آثارها المتلقين للمعلومات. على سبيل المثال، STAT3 المعروف تقليديا لتكون أساسا في سيتوسول في الخلايا يستريح مترجمة، وثم أنها translocates إلى النواة لتنشيط الجينات ردا على السيتوكينات18. كما STAT3 translocates إلى الميتوكوندريا وينظم دورة TCA و إنتاج ATP19. وفيما يتعلق بالتنظيم أوتوفاجي، ينظم التعريب سوبسيلولار مختلفة من STAT3 أوتوفاجي في مختلف طرق20. على سبيل المثال، STAT3 النووية ترانسكريبتيونالي ينظم الجينات المتعلقة أوتوفاجي ويعمل المغير أوتوفاجي. STAT3 هيولى مؤثرا يحول دون أوتوفاجي بالتفاعل مع إشارات الجزيئات أوتوفاجي. يحول دون STAT3 الميتوكوندريا ويمنع ميتوفاجي بقمع أوتوفاجي الأكسدة المستحث. ولذلك، هذا الأسلوب عزل المقصورة سوبسيلولار أمر حاسم لفهم دور أخرى إشارات الجزيئات، وكذلك ERK1/2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. "معاملة الببتيد" للخلايا
- لوحة SY5Y SH 2 مليون أو خلايا HEK293 (2 × 10 6) إلى 10 سم طبق وزراعتها لمدة يومين
- اليوم (اختياري) القادم، وتغسل الخلايا مع دولبيكو خالية من المصل ' s معدلة النسر المتوسطة (دميم) وسائط الإعلام مرة واحدة واحتضانها بالمصل دميم الحرة بين عشية وضحاها إذا كان العلاج يحتاج إلى القيام به في وسائل الإعلام الحرة المصل.
- في اليوم 3، حل الببتيدات S14G-هومانين في 0.2 ميكرون تصفيتها، والماء المقطر وتشكيل لهم كحل الأسهم 1 مم-
ملاحظة: يجب حل الببتيدات في المذيب المناسب، الذي يمكن تحديده من خلال خصائص تسلسل الببتيد (مثلاً، تهمة الشاملة) وقد تقدمها الشركة المصنعة إذا الببتيدات متوفرة تجارياً. على سبيل المثال، S14G-هومانين، SHLP2، و SHLP6، والكلمات-ج تذوب في الماء. الكوة الببتيدات في حجم مناسب (مثلاً، 50 ميكروليتر) تجنب تجميد وإذابة الجليد في دورات. وبمجرد مذاب، عدم استخدامها مرة أخرى. - قاسمة المحتوية على المصل المعالجون مسبقاً أو وسائط خالية من المصل في 50 مل مخروطية أنبوب وإضافة درجة حرارة الغرفة 1 مم حل الأسهم لجعله بتركيز عمل (مثلاً، 1 ميكرومتر، 10 ميكرون).
- استبدال الوسائط مع الحل الببتيد 6 مل من الخطوة 1، 4. واحتضان الخلايا للمقدار المناسب من الوقت-
ملاحظة: اختيار وقت الحضانة تبعاً لحالتك التي ينشط إيرك.
2. تجزئة سوبسيلولار سيتوسول ونواة
- تغسل الخلايا مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني المثلج وتتخلص من الخلايا خارج اللوحة في 5 مل من برنامج تلفزيوني المثلج، ونقل تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل.
- الطرد المركزي الخلايا في ز x 500 لمدة 5 دقائق في 4 ° C.
- نضح برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق بيليه في 200 ميليلتر من المثلج، تجزئة العازلة (10 مم هيبيس pH = 7، 6، 3 مم مجكل 2، 10 مم بوكل، والغليسيرول 5% (v/v)، 1% الفاعل غير الأيونية (ج 13 ح 22 س (2 ح ج 4 س) n)، مثبطات البروتياز/الفوسفاتيز).
ملاحظة: للحفاظ البروتينات في مركزها الفسفرة، مثبط الفوسفاتيز كما ينبغي كذلك في حوزتي إضافة مثبطات الطازجة وينبغي أن تظل عينات على الجليد في جميع الأوقات. تكرار التجميد والذوبان ينبغي تجنب دورات للعينات. عينات الكوة إلى كمية صغيرة (مثلاً 50 ميكروغرام) قبل تجميدها في-80 درجة مئوية. - احتضان بيليه إعادة علقت في الثلج لمدة 15 دقيقة والطرد المركزي في 250 g x لمدة 5 دقائق ثم في 4 ° C.
- جمع المادة طافية الكسر هيولى وإبقاء بيليه للكسر النووية.
- الطرد المركزي المادة طافية إزالة الحطام الخلوية والملوثات الأخرى في 18,000 س ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية ومن ثم نقل المادة طافية في أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة. هذا هو الكسر سيتوسول-
- ريسوسبيند بيليه في 200 ميكروليتر يغسل المثلج العازلة (10 مم هيبيس الأس الهيدروجيني = 7.6، 1.5 مم مجكل 2، 420 مم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 25% (v/v)، يدتا 0.2 مم، مثبطات البروتياز/الفوسفاتيز) والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية في 250 x ز
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت لاستخراج المثلج، النووية ميكروليتر 100 (20 مم حبيس الأس الهيدروجيني = 7.6، 1.5 مم مجكل 2، 420 مم كلوريد الصوديوم، والغليسيرول 25% (v/v)، يدتا 0.2 مم، مثبطات البروتياز/الفوسفاتيز) و sonicate 10 مرات (5 s في 10 s إيقاف، أمبير 30%). في مدت
- أجهزة الطرد المركزي في 18,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة. هذا هو الكسر النووية.
- Quantify كمية البروتين مقايسة اتفاق التعاون الأساسي باستخدام
3. "كسر Mitochondrial الخام"
- تغسل الخلايا الموجودة في كل طبق 10 سم مع 10 مل من برنامج تلفزيوني المثلج، إضافة 5 مل المثلج برنامج تلفزيوني، وفصل الخلايا باستخدام مكشطة خلية.
ملاحظة: استخدم أطباق 10 سم ثلاث خلايا للحصول على عائد جيد من الميتوكوندريا "الغربية النشاف". - نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل، والجمع بين كل من ثلاثة أطباق 10 سم في أنبوب مخروطي 15 مل واحد.
- الطرد المركزي الخلايا في 600 x ز لمدة 10 دقائق في 4 ° C.
- نضح برنامج تلفزيوني وإعادة تعليق بيليه في 1 مل من الميتوكوندريا المثلج عزلة المخزن المؤقت (10 ملم تريس-الممسحات، 1 مم اجتا/تريس، 200 ملم السكروز، ضبط على درجة الحموضة = 7.4).
- مجانسة الخلايا مع السكتات الدماغية 25 من الخالطون 2 مل مع مدقة تترافلوروايثيلين المغلفة في مدت
ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة للحفاظ على سلامة mitochondrial وتعظيم عائد الكسر المتقدرية. ينبغي أن يكون الأمثل العدد من السكتات الدماغية لكل نوع من الخلايا. بريكول الخالطون قبل بدء الإجراء. - نقل هوموجيناتي إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي والطرد المركزي أنه في ز 600 x لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية لإزالة الأنوية والخلايا غير منقطعة.
- جمع المادة طافية، وأنه نقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة، والطرد المركزي في س 7,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 ° C.
ملاحظة: بيليه فضفاض وجمع المادة طافية بعناية وحاول أن لا تخل بيليه. - إزالة المادة طافية وتعليق إعادة بيليه مع 200 ميكروليتر من الميتوكوندريا المثلج عزلة المخزن المؤقت، ونقل الحل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة. الطرد المركزي الأنبوب في 7,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 ° C.
- كرر الخطوة 3.8 لغسل بيليه. فإنه ليس من الضروري لنقل المادة طافية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة في هذه الخطوة.
- إزالة المادة طافية من بيليه غسلها وإعادة تعليق بيليه الذي يحتوي على الميتوكوندريا مع 50 ميكروليتر من المخزن المؤقت للمعهد الملكي-
- إينكوباتي تعليق على الجليد للحد الأدنى 10
- الطرد المركزي بتعليق في 16,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 ° C.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة. هذا هو الكسر المتقدرية.
- تحديد مقدار البروتين باستخدام مقايسة اتفاق التعاون الأساسي.
4. الغربية النشاف "البروتينات" الخاصة والرمات
- القيام التفريد جل الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide (8-16% premade جل) ونقل البروتين إلى غشاء PVDF 4-
- احتضان الغشاء مع جيش صرب البوسنة 5% في تبسة (0.1% 20 بوليسوربيت) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة منع المواقع الخلفية غير محددة ملزمة.
ملاحظة: للكشف عن البروتين فوسفوريلاتيد، كتلة الغشاء مع جيش صرب البوسنة ليس من الحليب. الحليب يحتوي على الكازين، فوسفوبروتين وفيرة، مما يؤدي إلى ارتفاع غير محدد إشارة- - احتضان الغشاء مع جسم الأولية (مكافحة-والرمات-ERK1/2) عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- وفي اليوم التالي يغسل الغشاء مع تبسة (0.1% بوليسوربيت 20) ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
- احتضان الغشاء مع جسم الثانوي (HRP أرنب المضادة) ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
- يغسل الغشاء مع تبسة (0.1% بوليسوربيت 20) ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
- احتضان الغشاء مع الحل القامة وصورة الغشاء في محلل الصورة.
- قطاع الغشاء مع تجريد المخزن المؤقت لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ويغسل الغشاء مع تبسة ثلاث مرات للحد الأدنى 5
- كرر الخطوات من 4.2 إلى 4.7 استخدام جسم ERK1/2 مجموع المضادة.
- للتحقق من نقاء كل جزء، تشغيل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي وتنفيذ إيمونوبلوتس استخدام الأجسام المضادة للاعتراف بعلامات لكل حجرة (مثلاً، B1 لمين لنواة، جابده سيتوسول، و TOM20 الميتوكوندريا)-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدام الإجراء المعروضة هنا، نحن تعامل الخلايا HEK293 و SH SY5Y مع ميكرو 1 و 100 ميكرومتر S14G-هومانين، هومانين قوية تناظرية21، على التوالي، في استكمال وسائل الإعلام للفترات الزمنية المشار إليها (الشكل 1A و الرقم 1 ب). ثم درسنا شكل إجمالي وفوسفوريلاتيد ERK1/2 في منتدى المجالس الرومانسية202/Tyr204 من مستخلصات البروتين الكلي. S14G-هومانين العلاج أظهرت زيادة في الفسفرة ERK1/2 في به التنظيمية Thr202/Tyr204 الموقع. تعريب سوبسيلولار من ERK1/2 دوراً هاما في وظيفتها إرسال الإشارات، لا سيما في الحصول على خصوصيته. فهم هدف تفعيل S14G-هومانين-بوساطة ERK1/2، نحن تحليل توطين إجمالي سوبسيلولار وفوسفوريلاتيد ERK1/2 بعد العلاج S14G-هومانين. في الخلايا HEK293، ازدادت إيرك فوسفوريلاتيد في كلا السيتوبلازم والنواة، ولكن ليس في الميتوكوندريا (الشكل 2أ). من المثير للاهتمام، انخفض إيرك فوسفوريلاتيد في السيتوبلازم والنواة، والميتوكوندريا في الخلايا SH SY5Y (الشكل 2ب). هذه النتائج تشير إلى أن الفسفرة إيرك S14G-هومانين-بوساطة قد تلعب دوراً مختلفاً في أنواع الخلايا المختلفة والظروف المختلفة. لذلك يتعين إجراء المزيد من الدراسات لتحليل توطين الفسفرة S14G-هومانين-بوساطة من ERK1/2 في المقصورات الأخرى سوبسيلولار، كما فوسفوريلاتيد ERK1/2 translocates إلى النواة، الميتوكوندريا، اندوسوميس/ليسوسوميس، و الأغشية المختلفة.
رقم 1: S14G-هومانين يزيد الفسفرة ERK1/2 في الخلايا HEK293 و SH-SY5Y- التقدير الكمي والممثل البقع الغربية التنشيط إيرك في الخلايا HEK293 (أ) و (ب) ش-SY5Y. مجموع ليساتيس خلية عقب ميكرومتر (A) 1 أو 100 ميكرومتر (ب) S14G-هومانين العلاج في دميم وتستكمل مع 10% FBS ليدل فترات زمنية كانت إيمونوبلوتيد استخدام مكافحة-والرمات-ومجموع-إيرك 1/2 (Thr202/Tyr204). وقد تم تعديل هذا الرقم من كيم وآخرون 4 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: فوسفوريلاتيد ERK1/2 هو مترجم سيتوسول ونواة أخرى المقصورات سوبسيلولار على العلاج S14G-هومانين في خلايا HEK293 و SH-SY5Y- الممثل البقع الغربية عرض الترجمة سوبسيلولار ERK1/2 (n = 3). (أ) HEK293 الخلايا تعامل مع 1 ميكرومتر S14G-هومانين. سيتوسوليك (15 ميكروغرام)، النووي (15 ميكروغرام و 50 ميكروغرام)، وكانت الميتوكوندريا (15 ميكروغرام) ليساتيس إيمونوبلوتيد استخدام جسم إيرك والرمات والمجموع. (ب) ش-SY5Y الخلايا تعامل مع 100 ميكرومتر S14G-هومانين. وتم الحصول على كسور المتقدرية 30 دقيقة بعد العلاج S14G-هومانين. وكانت ليساتيس (15 ميكروغرام) سيتوسوليك والنووية المتقدرية إيمونوبلوتيد استخدام جسم إيرك والرمات والمجموع. جسم Tom20 مكافحة مكافحة-جابده، "ب" لمين المضادة، استخدمت كعلامات الكسر سيتوسوليك، والنووية، الميتوكوندريا، على التوالي. وقد تم تعديل هذا الرقم من كيم وآخرون 4- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: المخازن المؤقتة سيتوسول، النووي، وكسر المتقدرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن أثبت أن يحدث التنشيط ERK1/2 الببتيد بوساطة هومانين في نوعين من خلايا مختلفة، وتعريب سوبسيلولار لتنشيط ERK1/2 يمكن أن تختلف تبعاً للظروف (مثلاً، جرعة الببتيد والنقطة الزمنية، والخلية نوع). وقد ثبت أن هومانين إشارات عن طريق مستقبلات مختلفة اثنين22،23، مما قد يفسر الاختلافات في الإشارات بين خطوط الخلايا اثنين، فضلا عن الحاجة إلى جرعات مختلفة من هومانين. لم تدرس الآثار الفسيولوجية لهذا تماما، بل أنها قد تشير إلى إحدى الآليات الممكنة للردود الأنسجة تعتمد على حماد.
الفسفرة ERK1/2 يلعب دوراً حاسما في إشارة ERK1/2 وحالة الفسفرة ERK1/2 يبين التغيرات الدينامية. من المهم تحسين الظروف للبحث عن عندما يتم فوسفوريلاتيد ERK1/2 تحت شرط معين/حافز. لتحقيق هذا الهدف، حاول تحفيز مختلف الظروف (مثلاً، والجرعة والمتوسطة) وإجراء دورات الوقت للبحث عن عندما يتم تحقيق أعلى مستوى من الفسفرة. معظم الدراسات ركزت فقط على الفسفرة ERK1/2 في خلية الإجمالي ليساتيس. ومع ذلك، قد توفر النتائج المعلومات الوظيفية المحدودة ERK1/2 يمكن أن تتفاعل مع أهداف مختلفة وتعدل الشلالات المتلقين للمعلومات المختلفة في المقصورات سوبسيلولار محددة. دراسة الترجمة سوبسيلولار فوسفوريلاتيد ERK1/2 يعطي بالتالي، إلى فهم أفضل لدور التنشيط ERK1/2.
تجزئة سوبسيلولار بعد التنشيط ERK1/2 يمكن استخدامها كمصدر لمزيد من الدراسة (مثلاً، إيمونوبريسيبيتيشن co) لتحديد الأهداف المصب رواية لأنه يمكن أن تثري تجزئة سوبسيلولار لأهداف المتلقين للمعلومات من ERK1/2. يمكن تطبيق هذا الأسلوب للجزيئات الأخرى مما يشير إلى أن يتم ذوبانها في أماكن مختلفة سوبسيلولار على المحفزات بعد تحسين الظروف.
على الرغم من أن قد اقترحت أساليب مختلفة لعزل الميتوكوندريا في العقود الماضية، وهناك تلوث جزئي من المقصورات الأخرى سوبسيلولار. طريقة العزل المتقدرية الخام المقترحة هنا يحتوي أيضا على كمية محدودة من المواد الملوثة في السيتوبلازم. ما مقدار التلوث الصغيرة، نرى أنه لا يزال أسلوب صالح للكشف عن توطين ERK1/2 في الميتوكوندريا عند التنشيط. الببتيدات ليست بالضرورة مستقرة في الحل، من الصعب في بعض الأحيان للحفاظ على التناسق بين التجارب. يمكن التأكد من أن مختبرين الصغيرة لحل الببتيد لتجنب آثار تجميد أذاب وتحسين اتساق النشاط الببتيد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
نحاس كوهين هو المساهم واستشاري لكلفن كوبر, Inc. ين عملت كمستشار لشركة كوبر
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها أليسون/عفر "زمالات ما بعد الدكتوراه" في "برنامج بحوث الشيخوخة" إلى سيك، ومنح جائزة مؤسسة جلين، والمعاهد الوطنية للصحة للكمبيوتر (1P01AG034906، 1R01GM 090311، 1R01ES 020812). تظهر كافة المؤلفين في الفيلم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
References
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
- Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
- Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
- Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).
- Cagnol, S., Chambard, J. -C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
- Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
- Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
- Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
- Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
- Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
- Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
- Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
- Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
- Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
- You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
- Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).
