Summary
Det här protokollet beskriver hur man stimulera celler med mitokondrie-derived peptider och bedöma signalering kaskad och lokalisering av phospho-proteiner.
Abstract
Mitokondrie-derived peptider (MDPs) är en ny klass av peptider som kodas av små öppna läsning ramar inom andra kända gener av mitokondriella genomet. MDPs har en mängd olika biologiska effekter såsom skydda nervceller från apoptos, förbättra metabola markörer och skydda celler från kemoterapi. Humanin var den första MDP att upptäckas och är den mest studerade peptiden bland familjen MDP. Den membranreceptorer och nedströms signalvägar av humanin har karaktäriserats noggrant. Ytterligare MDPs såsom MOTS-c och SHLP1-6 har upptäckts nyligen och signalering mekanismerna har ännu att belysas. Här beskriver vi en cell kultur baserad metod för att avgöra funktionen av dessa peptider. I synnerhet kan cellen fraktionering tekniker i kombination med western blotting för kvantitativ bestämning av aktivering och flyttning av viktig signalmolekyl. Medan det finns andra metoder för cell fraktionering, är den beskrivs här en enkel och okomplicerad metod. Dessa metoder kan användas för att ytterligare belysa verkningsmekanismen av dessa peptider och andra terapeutiska medel.
Introduction
Nya studier visar att mitokondrie-derived peptider (MDPs) spelar viktiga roller i cytoprotection och metabolism1,2,3. Förstå signalvägen transduktion i närvaro av MDPs ger oss inblick i den mekanism genom vilken MDPs modulera olika funktioner. Den första identifiera MDP, humanin, har visat sig öka extracellulär signal-reglerade Kinas 1/2 (ERK1/2) fosforylering via dess receptor bindande4,5. Nedströms effekten av ERK1/2 aktivering är dock fortfarande underexploaterade.
ERK1/2 kaskad fungerar som en viktig medlare i en mängd olika cellulära processer inklusive spridning, cellmigration, cellulär metabolism, överlevnad och apoptos6,7,8. För att dirigera alla är dessa olika cellulära processer, verksamhet och subcellulär lokalisering av ERK1/2 hårt reglerad av fosfataser och byggnadsställning proteiner9,10. Utöver posttranslationella modifieringar reglerar den dynamiska shuttling ERK1/2 också dess signalering funktion, aktivitet och specificitet11,12. ERK1/2 är främst lokaliserade i cytosolen13. En uppsättning förankring och byggnadsställning proteiner hjälper behålla ERK1/2 i cytoskeletal element, på ytan av organeller eller diffust i cytoplasman13. Vid stimulering, ERK1/2 är fosforyleras och blir skiljas från dess ankring proteiner, vilket gör att på flyttning av ERK1/2 till andra subcellulär fack, inklusive den kärna, mitokondrier, Golgi och lysosomer14, 15 , 16.
Även om humanin är känd för att aktivera den ERK1/2 signalering utbildningsavsnitt, är aktivering av ERK1/2 endast observerats i den totala cell lysates. Som beskrivits tidigare, eftersom ERK1/2 subcellulär lokalisering spelar en avgörande roll i dess nedströms effekt, analys av både subcellulär lokalisering och de totala nivåerna av är fosforylerade ERK1/2 nödvändigt att ge en helhetsförståelse av humanin-inducerad ERK1/2 aktivering och aktivering av nedströms mål.
För att förstå de mål organeller aktiverade ERK1/2, utfördes subcellulär fraktionering följt av western blotting för fosforyleras ERK1/2. Denna metod kan enkelt genomföras som det använder vanlig laboratorieutrustning och reagenser. De isolerade subcellulär fack är av hög renhet, så att resultaten ska tolkas rakt. Immunfärgning av ERK1/2 kan ge liknande resultat. Vissa subcellulär fack är dock relativt svårt att visualisera och kräver speciella fixering och permeabilisering metoder. ERK1/2 varierar i subcellulär fack, och denna variation kan orsaka falskt positiva och falskt negativa signaler när man tittar på hela cellen lysates. Därför ger en immunoblot använder isolerade subcellulär fack oss en bättre förståelse av ERK1/2 lokalisering.
Mångsidigheten hos metoden möjliggör ändringar av protokollet att undersöka effekterna av andra stimulantia inklusive andra MDPs eller flyttning av andra signalmolekyler som STAT3. Nyligen kodas upptäckt små humanin-liknande peptider (SHLPs) från 16S rRNA region där humanin är kodad, och de har liknande men distinkta egenskaper i förhållande till HN17. Till exempel aktivera SHLP2 och SHLP3 ERK1/2 efter 8 h trots humanin aktiverar ERK1/2 inom 5 min. Kontrollera subcellulär lokalisering av ERK1/2 svar på olika peptider kommer att ge oss en bättre förståelse av biologi av dessa peptider. Nya bevis visade att subcellulär lokalisering av signalmolekyler spelar en avgörande roll i deras nedströms effekter. Till exempel STAT3 traditionellt är känt för att vara främst lokaliserade i cytosolen i vilande celler, och sedan det translocates in i cellkärnan att aktivera genuttryck i svar på cytokiner18. STAT3 också translocates till mitokondrier och reglerar TCA cykeln och ATP produktionen19. Angående autofagi förordning modulerar olika subcellulär lokalisering av STAT3 autofagi i olika sätt20. Till exempel kärnkraft STAT3 transcriptionally reglerar autofagi-relaterade gener och fungerar som en autofagi modulator. Cytoplasmiska STAT3 hämmar konstitutivt autofagi genom att interagera med autofagi signalmolekyler. Mitokondriell STAT3 hämmar och hindrar mitophagy genom att undertrycka oxidativ stress induced autofagi. Denna metod för isolering av subcellulär fack är därför avgörande för att förstå rollen som andra signalering molekyler samt ERK1/2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. peptid behandling till celler
- tallrik två miljoner SH-SY5Y eller HEK293 celler (2 x 10-6) i en 10 cm skålen och odla dem för 2 dagar
- (tillval) nästa dag, tvätta cellerna med serumfritt Dulbecco ' s ändrad Eagle Medium (DMEM) media en gång och inkubera med serum gratis DMEM över natten om behandlingen behöver göras i serum fria medier.
- På dag 3, upplösa S14G-humanin peptider i 0,2 µm filtreras, destillerat vatten och bereda dem som 1mM stamlösning.
Obs: Peptiderna bör lösas upp i lämpligt lösningsmedel, som kan bestämmas av sekvens som kännetecknar peptiden (t.ex., totala kostnad) och kan tillhandahållas av tillverkaren om Peptiderna är kommersiellt tillgängliga. Till exempel S14G-humanin, SHLP2, och SHLP6 och MOTS-c löses upp i vatten. Alikvotens peptiderna i en lämplig volym (t.ex., 50 μl) att undvika frysa och Tina cykler. När tinas, inte använda dem igen. - Alikvot Den pre värmde serum-innehållande eller serum-fria medier i en 50 mL konisk röret och lägga till rumstemperatur 1 mM stamlösning för att göra det till en fungerande koncentration (t.ex., 1 µM, 10 µM).
- Ersätta mediet med 6 mL peptid lösning från steg 1.4. och inkubera cellerna i lämplig mängd tid.
Obs: Välj inkubationstiden beroende på ditt tillstånd som aktiverar ERK.
2. Subcellulär fraktionering för Cytosol och Nucleus
- tvätta cellerna två gånger med 10 mL iskallt PBS, skrapa cellerna bort plattan i 5 mL iskallt PBS och överföra cellsuspensionen i en 15 mL koniska rör.
- Centrifugera cellerna vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Aspirera PBS och resuspendera pelleten i 200 µL iskall, fraktionering buffert (10 mM HEPES pH = 7,6, 3 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 5% (v/v) glycerol, 1% icke-jonisk tensid (C 13 H 22 O (C 2 H 4 O) (n), proteas/fosfatas-hämmare).
Obs: För att hålla proteinerna i deras phosphorylation status, fosfatas-hämmaren som samt proteas hämmare bör läggas nymalet och prover bör hållas på is på alla gånger. Upprepande frysning och tining cykler av prover bör undvikas. Alikvotens prover till små belopp (t.ex. 50 μg) före frysa dem vid -80 ° C. - Inkubera åter suspenderade pelleten på is för 15 min och sedan Centrifugera vid 250 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Samla supernatanten som det cytoplasmiska bråket och hålla pelleten för den nukleära bråkdel.
- Centrifugera supernatanten för att avlägsna cellulära skräp och andra föroreningar vid 18.000 x g i 10 minuter vid 4 ° C och sedan överföra supernatanten till en ny mikrocentrifug rör. Detta är andelen cytosol.
- Återsuspendera pelleten i 200 μL iskall tvättbuffert (10 mM HEPES pH = 7,6, 1,5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glycerol, 0,2 mM EDTA, proteas/fosfatas-hämmare) och centrifugera vid 250 x g under 5 minuter vid 4 ° C
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 μL iskall, nukleära extraktion buffert (20 mM HEPES pH = 7,6, 1,5 mM MgCl 2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glycerol, 0,2 mM EDTA, proteas/fosfatas-hämmare) och Sonikera 10 gånger (5 s på, 10 s ««««off, 30% amp.) på ice.
- Centrifugera vid 18.000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifug rör. Detta är den nukleära bråkdel.
- Kvantifiera mängden protein med en BCA-analys
3. rå mitokondriell fraktion
- tvätta cellerna i varje 10 cm skålen med 10 mL iskallt PBS, tillsätt 5 mL iskallt PBS och lossa cellerna använder en cell skrapa.
Obs: Använd tre 10 cm rätter av celler för att få en bra avkastning av mitokondrier för Western Blotting. - Överföra cellsuspensionen i en 15 mL koniska rör och kombinera alla från tre 10 cm rätter i en 15 ml koniska tube.
- Centrifugera cellerna vid 600 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Aspirera PBS och resuspendera pelleten i 1 mL iskallt mitokondrier isolering buffert (10 mM Tris-moppar, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM sackaros, justera till pH = 7.4).
- Homogenisera cellerna med 25 slag med en 2 mL Homogenisatorer med polytetrafluoreten belagda mortelstöt på ice.
Obs: Detta steg är avgörande för att upprätthålla mitokondriernas integritet och maximera avkastningen av den mitokondriella fraktionen. Antal slag bör optimeras för varje celltyp. Precool homogenisatorn innan du startar proceduren. - Överföra Homogenatet i en mikrocentrifug rör och centrifugera det 600 x g under 10 minuter vid 4 ° C ta bort kärnor och obruten celler.
- Samla supernatanten, överföra den till en ny mikrocentrifug rör och centrifugera det 7000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
Obs: Pelleten är lös, samla supernatanten med omsorg och försök att inte störa pelleten. - Ta bort supernatanten, resuspendera pelleten med 200 μL av iskall mitokondrier isolering buffert och överför lösningen till en ny mikrocentrifug rör. Centrifugera röret vid 7000 x g under 10 minuter vid 4 ° C.
- Upprepa steg 3.8 att tvätta pelleten. Det är inte nödvändigt att överföra supernatanten till ett nytt mikrocentrifug rör i det här steget.
- Ta bort supernatanten från tvättade pelleten och resuspendera pelleten som innehåller mitokondrier med 50 μL av RIPA bufferten.
- Inkubera suspensionen på is för 10 min.
- Centrifugera suspensionen vid 16 000 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
- Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifug rör. Detta är den mitokondriella fraktionen.
- Kvantifiera mängden protein med en BCA analys.
4. Western Blotting för Phospho-specifika proteiner
- utföra en SDS-polyakrylamid gelelektrofores (8-16% premade gel) och överföra proteinet till en PVDF membran 4.
- Inkubera membranet med 5% BSA i TBST (0,1% polysorbat 20) i 30 min i rumstemperatur att blockera bakgrund ospecifika bindningsställen.
Obs: För fosforyleras protein detektering, blockera membranet med BSA inte mjölk. Mjölk innehåller kasein, en riklig phosphoprotein, vilket resulterar i hög ospecifik signal. - Inkubera membranet med den primär antikroppen (anti-phospho-ERK1/2) vid 4 ° C över natten.
- Nästa dag, tvätta membranet med TBST (0,1% polysorbat 20) tre gånger för 5 min i rumstemperatur.
- Inkubera membranet med sekundära antikroppar (anti-kanin HRP) för 1 h i rumstemperatur.
- Tvätta membranet med TBST (0,1% polysorbat 20) tre gånger för 5 min i rumstemperatur.
- Inkubera membranet med ECL lösning och bild membranet i bild analysatorn.
- Strip membranet med strippar buffert under 15 minuter vid rumstemperatur och tvätta membranet med TBST tre gånger för 5 min.
- Upprepa steg 4,2 till 4,7 använder anti totalt ERK1/2 antikroppen.
- För att kontrollera renheten av respektive fraktion, köra SDS-PAGE och utföra immunoblots med hjälp av antikroppar erkänner markörer för varje fack (t.ex., Lamin B1 för nucleus, GAPDH för cytosol, och TOM20 för mitokondrier).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda proceduren presenteras här, vi behandlas HEK293 och SH-SY5Y celler med 1 μM och 100 μM S14G-humanin, en potent humanin analoga21, respektive i komplett media för de angivna tidsperioderna (figur 1 och figur 1 B). vi sedan granskade totala och fosforyleras form av ERK1/2 på Thr202/Tyr204 från totalprotein extrakt. S14G-humanin behandling visade ökad fosforylering av ERK1/2 vid dess reglerande Thr202/Tyr204 webbplats. Subcellulär lokalisering av ERK1/2 spelar en viktig roll i sin signalering funktion, särskilt i att få dess särart. För att förstå målet för S14G-humanin-medierad ERK1/2 aktivering, Vi analyserade subcellulär lokalisering av totalt och fosforyleras ERK1/2 efter S14G-humanin behandling. I HEK293 celler, den fosforylerad ERK ökat den både i cytoplasman och kärnan, men inte i mitokondrierna (figur 2A). Intressant, minskade fosforylerad ERK i cytoplasman, nucleus och mitokondrier i SH-SY5Y celler (figur 2B). Dessa resultat tyder på att S14G-humanin-medierad ERK fosforylering kan spela en annan roll i olika celltyper och olika villkor. Därför ytterligare studier krävs för att analysera localizationen av S14G-humanin-medierad fosforylering av ERK1/2 i andra subcellulär fack, som fosforyleras ERK1/2 translocates i kärna, mitokondrier, endosomes/lysosomer, och olika membran.
Figur 1: S14G-humanin ökar fosforyleringen av ERK1/2 i HEK293 och SH-SY5Y celler. Kvantifiering och representant western blotting av ERK aktivering i (A) HEK293 och (B) SH-SY5Y celler. Summa cell lysates följd av (A), 1 µM eller (B) 100 µM S14G-humanin behandling i DMEM kompletteras med 10% FBS för den angivna tidsperioder var immunoblotted med anti-phospho - och totalt-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204). Denna siffra har ändrats från Kim et al. 4 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Fosforyleras ERK1/2 är lokaliserad till cytosolen, kärnan och andra subcellulär fack vid S14G-humanin behandling i cellerna HEK293 och SH-SY5Y. Representativa western blotting visar ERK1/2 subcellulär lokalisering (n = 3). (A) HEK293 celler behandlades med 1 µM S14G-humanin. Cytosoliska (15 µg), kärnkraft (15 µg och 50 µg), och mitokondrie (15 μg) lysates var immunoblotted med phospho - och totalt-ERK antikroppen. (B) SH - SY5Y celler behandlades med 100 µM S14G-humanin. Mitokondriell fraktioner erhölls 30 min efter S14G-humanin behandling. Cytosoliska, nukleära och mitokondrie (15 µg) lysates var immunoblotted med phospho - och totalt-ERK antikroppen. Anti-GAPDH, Anti-Lamin B, anti-Tom20 antikroppar användes som de cytosoliska, kärnkraft, mitokondriella fraktion markörerna, respektive. Denna siffra har ändrats från Kim et al. 4. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Tabell 1: Buffertar för cytosol, kärnkraft, och mitokondriell fraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här, visat vi att humanin peptid-medierad ERK1/2 aktivering sker i två olika celltyper och subcellulär lokalisering av aktiverade ERK1/2 kan vara olika beroende på villkor (t.ex., det dos av peptid, tidpunkt och cell typ). Det har visats att humanin signaler genom två olika receptorer22,23, vilket kan förklara skillnaderna i signalering mellan de två cellinjer, liksom kravet på olika doser av humanin. De fysiologiska effekterna av detta har inte helt klarlagd men det kan tyda på en möjlig mekanism för vävnad beroende Svaren till HN.
Fosforylering av ERK1/2 spelar en avgörande roll i ERK1/2 signalering och phosphorylation status av ERK1/2 visar dynamiska förändringar. Det är viktigt att optimera villkoren för att hitta när ERK1/2 är fosforyleras under en specifik skick/stimulans. För att uppnå detta, prova olika stimulering villkor (t.ex., dos och medium) och genomföra tidsförlopp hitta när den högsta nivån av fosforylering uppnås. En majoritet av studierna har bara fokuserat på ERK1/2 fosforylering i totala cell lysates. Resultaten får dock föreskriva begränsad funktionell information ERK1/2 kan interagera med olika mål och modulera olika nedströms cascades i specifika subcellulär fack. Därför ger undersöker subcellulär lokalisering av fosforylerade ERK1/2 en bättre förståelse av ERK1/2 aktivering roll.
Subcellulär fraktionering efter ERK1/2 aktivering kan användas som en källa till ytterligare en studie (t.ex., co-immunoprecipitation) för att identifiera roman nedströms mål eftersom den subcellulär fraktioneringen kan berika för nedströms mål av ERK1/2. Denna metod kan tillämpas på andra signalmolekyler som är flyttad till olika subcellulär fack vid stimuli efter optimering av villkor.
Även om olika metoder att isolera mitokondrierna har föreslagits under de senaste decennierna, finns det delvis smitta från andra subcellulär fack. Den råa mitokondriella isolering metod som föreslås här innehåller också begränsad mängd cytoplasman föroreningar. Mängden föroreningar är liten, anser vi att det fortfarande är en giltig metod för att upptäcka localizationen av ERK1/2 in i mitokondrierna vid aktivering. Peptider är inte nödvändigtvis stabil i lösning, är det ibland svårt att behålla överensstämmelsen mellan experiment. Var noga med att göra små delprover av peptid lösning för att undvika frysning-tining effekter och öka enhetligheten i peptid aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Pinchas Cohen är en aktieägare och konsult för CohBar, Inc. Kelvin Yen har fungerat som konsult för CohBar, Inc.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av en Ellison/AFAR postdoktorsstipendium i Aging Research Program till Postvagn, och en Glenn Foundation Award och NIH bidrag till PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). Alla författare visas i filmen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p44/42 MAPK (ERK1/2) | Cell signaling | 9102 | Dilution 1:1,000 |
| phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2)(Thr202/Tyr204) | Cell signaling | 4370 | Dilution 1:1,000 |
| Lamin B1 | Cell signaling | 12586 | Nuclear Marker, Dilution 1:1,000 |
| GAPDH | Cell signaling | 5174 | Cytoplasmic marker, Dilution 1:2,000 |
| Tom20 | Santa cruz | SC-17764 | Mitochondria marker, Dilution 1:2,000 |
| anti-Rabbit-HRP conjugated | Cell signaling | 7074 | Dilution 1:30,000 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 89900 | |
| 100 mm Culture Dish | ThermoFisher SCIENTIFIC | 12556002 | |
| HNG peptide | Genescript | ||
| 25mm sylinge filter | ThermoFisher SCIENTIFIC | 09-719A | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP151-100 | |
| EDTA | Sigma | 3609 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Tris-base | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP152-1 | |
| HCL | Sigma | H1758 | |
| PBS | Lonza | 17-512F | |
| Cell Scraper | FALCON | 353085 | |
| Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 78440 | |
| Thomas Pestle Tissue Grinder Assemblies with Smooth Pestles | Thomas Scientific | 3432S90 | |
| Tween-20 | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP337-500 | |
| BSA | ThermoFisher SCIENTIFIC | BP1600-100 | |
| 8-16% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BIO RAD | 4561104 | |
| Mini Trans-Blot Module | BIO RAD | 1658030 | |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BIO RAD | 1704150 | |
| Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit | BIO RAD | 1704272 | |
| Clarity Western ECL Blotting Substrates | BIO RAD | 1705060 | |
| Restore Western blot stripping buffer | ThermoFisher SCIENTIFIC | 21059 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11965-092 | |
| Sonicator, Medel: FB120 | ThermoFisher SCIENTIFIC | 695320-07-12 |
References
- Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance. J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).
- Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action. PloS one. 4 (7), 6334 (2009).
- Lee, C., Yen, K., Cohen, P. Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides. Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).
- Kim, S. J., Guerrero, N., et al. The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus. Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Zhang, W., Liu, H. T. MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells. Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).
- Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. MAP kinases and cell migration. J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).
- Cagnol, S., Chambard, J. -C. ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence. FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).
- Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
- Morrison, D. K., Davis, R. J. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals. Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).
- Wainstein, E., Seger, R. The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles. Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).
- Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus. Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).
- Kolch, W. Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).
- Horbinski, C., Chu, C. T. Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death. Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).
- Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization. Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).
- Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases. Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).
- Cobb, L. J., Lee, C., et al. Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers. Aging. 8 (4), 796-809 (2016).
- Ihle, J. N. The Stat family in cytokine signaling. Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).
- Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism. Sci. Rep. 6 (1), 39517 (2016).
- You, L., Wang, Z., et al. The role of STAT3 in autophagy. Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).
- Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults. The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).
- Ying, G., Iribarren, P., et al. Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor. J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).
- Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).
