Summary
여기, 우리는 전체, 그대로 마우스의 격리에 대 한 프로토콜 세포 외 기질 (ECM) 식과 ductal 형태를 조사 하는 유 방 땀 샘을 제시. 마우스 #4 복 부 동맥은 8 10 주 오래 된 여성 미 쥐, 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정, 단면화 및 immunohistochemistry ECM 단백질에 대 한 사용 하 여 스테인드에서 추출 되었다.
Abstract
이 절차의 목표는 ECM 표현과 ductal 아키텍처 평가 #4 복 유 방 동맥 여성 미 쥐에서 수확 했다. 여기, 피부 아래 작은 주머니 메이 요가 위, 수 있도록 기본 복 막에서 피하 조직 내 분 비의 분리를 사용 하 여 만들었습니다. 땀 샘의 시각화 3.5의 사용에 의해 주 었 했다 x-R 수술 마이크로 loupes. 펠트 반전 했다 그리고 고정 다시 그대로 유 방 지방 패드의 허용 식별. #4 복 부 동맥의 각각 퉁 명 스럽게 옆으로 피하 층과 동맥 사이 메스 블레이드를 슬라이딩 하 여 해 부 했다. 수확 후 즉시 분 비 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 후속 조직 처리에 배치 했다. 전체 체의 절단은 주로 제외 ductal 상피 세포 및 다른 microenvironmental 세포 인구 부분 생 검에 놓친 수 간의 중요 한 조직 차원의 상호 작용의 위험을 제거 하기 때문에 유리 하다. 방법론의 1 결점은 동맥 내의 개별 위치로 ductal morphogenesis 고 단백질 식의 분석을 제한 하는 고정된 조직에서 직렬 섹션의 사용. 이와 같이, 3 차원 (3D) ductal 건축과 단백질 식에 변경 쉽게 얻을 수 아니다. 전반적으로, 기술 발달 ductal morphogenesis 또는 유 방 암 등 하류 조사에 대 한 전체 그대로 murine 유 방 땀 샘을 요구 하는 연구에 적용 됩니다.
Introduction
유방암 조직 섬유 증1,2,,34의 상당한 정도 의해 특징입니다. ECM,이 아닌 휴대 엔터티 모든 조직에서 다양 한 각도에서 발견 하며 주로 원 및 원 비 collagens, 엘라 스 틴, 그리고 다양 한 신호 분자는 뿐만 아니라 glycoproteins의 복잡 한 채널의 구성 이 매트릭스에서 격리. 항상성 조건에서 증 착 및 ECM의 긴밀 하 게 제어 됩니다. 5 유 방 tumorigenesis, 동안 ECM 증 착 및 저하의 균형은 중단 됩니다. 이와 같이, 유 방 종양 collagens, fibronectin 다른 tenascin C 등 풍부한 ECM 단백질 표현 하 보고 되었습니다. 6 매트릭스 가교의 증가 패턴 뿐만 아니라이 단백질의 비정상적인 식 유 방 종양 진행, 전이 및 치료 저항1,3, 를 홍보 하기 위해 문서화 되었습니다 4,7,,89.
ECM 구성과 ductal 형태 평가, 그대로 유 방 땀 샘의 격리 수행 되었다. 여기, 우리 caveolin-1에 대 한 결핍 여성 미 마우스를 사용는 적극적인에 연결 되어있다는 완전 한 막 단백질 종양 서명10,,1112, 유 방 및 여성 미 b 6를 제어 쥐입니다. 조직학 처리 하 고 이러한 직물의 얼룩이 ductal 형태학의 특성화와 함께 여러 가지 ECM 단백질의 id 허용.
전반적으로, 전체, 그대로 유 방 땀 샘의 조직 전체 형태학 또는 세포 변화 발생 하는 외 인 성 또는 내 인 성 요인에 대 한 응답에서을 조사 기회 연구자를 제공 합니다. 기술의 단점 ductal 나무의 복잡 한 형태학의 더 완전 한 그림을 얻을 것 이다 3D 관점 반대로 2 차원 (2D) 조직 단면도의 분석에 연결 되어 있습니다. 유 방 동맥에서 세포-세포와 세포-ECM 상호 작용의 복잡성을 감안할 때, 전체, 그대로 샘의 격리는 ductal 형태 및 단백질 표현의 다양 한 지역에서는 murine 유를 효율적으로 분석 하기 위한 유리한 선입니다.
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Protocol
동물 과목이이 프로토콜에 관련 된 절차 검토 되었고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 Osteopathic 약의 필라델피아 대학의 승인 그리고 모든 기술에서 엄격한 실시 했다 윤리적 지침.
1. 샘플 조달 및 처리
- 선택 적절 한 동물 주제와 CO 2 챔버로 장소. 이 실험에 대 한 사용 8 10 주 오래 된 여성 미 b 6. Cg-Cav1tmMIs/J와 C57BI/6J.
- 가스 흐름 30-40%로 설정. 일단 동물 가시 의식이 약 2 분 후, 추가 5 분에 대 한 전체 압력 가스 밸브를 열고
참고: CO 2 배달 중지 후 10 분 동안 (예: 가슴의 움직임) 호흡의 눈에 보이는 징후를 관찰 하 여 동물의 죽음을 확인 합니다. 동물 아직 살아있다, CO 2 챔버에 다시 삽입할 수 있습니다. 자 궁 경관 탈 구도 사용 될 수 있지만 그것은 권장 하지 않습니다 혈액 해 부 결과와 방해 하는 유 방 땀 샘 주위 누적 될 수 있습니다. - 희생, 부정사 자리에 시체를 고정 하 고 70% 에탄올과 포화.
- 집게를 사용 하 여 치 골 바로 위에 펠트를 꼬 집 고 작은 수술가 위 닉. 가 위, 회전 이동 복 부 정중 선 따라 펠트 꼬리를 잘라 두개골.
- 큰가 위 또는 한 hemostat, 퉁 명 스럽게 해 부 피하 근 막 양측, 하지 복 펑크에 주의 사용 하 여. 절 개의 원심 양쪽에 가로 여백을 따라 컷.
- 핀에 펠트 플랩 열고 다시 70% 에탄올 스프레이.
참고: 비록 70% 에탄올의 사용 허용 더 나은 시각적 구분 선와 주변 피하 조직,이 솔루션의 사용으로 인해 조직의 건조 하지 않도록 주의 해야 합니다. 건조 하지 않도록, 선 하지 4 분을 초과 하는 시간 프레임에서 제거 합니다. 70% 에탄올을 대신, 탐정 또한 조직의 건조를 피하기 위해 1 x PBS 같은 일반적인 격리 버퍼 대체할 수 있습니다. - 유선 및 관련된 피부 지방 진 피에서 무료 절단 가죽 플랩의 안쪽을 따라 #4 메스 블레이드 슬라이드 찾기 관심, 유 방 땀 샘.
참고: 외과 마이크로 loupes x 3.5 땀 샘의 쉽게 시각화에 도움이 있습니다. - 즉시 24-48 헤에 대 한 10% 중립 버퍼링된 말린의 10:1 솔루션-조직 볼륨을 포함 하는 원뿔 관에 새로 절연된 선 잠수함
참고: 연구의 의도 따라 많은 다른 fixatives 사용할 수 있습니다 paraformaldehyde, 게놈 연구, 그리고 버퍼를 보존 하는 상용 RNA에 대 한 에탄올 등. - 는 파라핀 포함을 위한 기관 프로토콜에 따라, 포함, 처리에 대 한 공급 업체에 샘플을 제출 하 고 슬라이스/슬라이드 장착. 5 µ m에서 조직 섹션.
참고: 초과 지방 주변 동맥 때문 보십시오 제거 조직의 단면을 얼룩이 지기 전에 100-200 µ m.
2. 조직 얼룩
- Immunohistochemistry
- 장소 슬라이드 열 블록에 얼룩이 질에 녹기 파라핀 1 h 58 ˚C 설정.
주의: 파라핀 왁 스를 녹는 슬라이드 해제 실행할 수 있습니다. 밀접 하 게 모니터링 하거나 결선 왁 스를 잡으려고 슬라이드 아래 닦아.
참고:이 단계는 중요 하지 않습니다 하 고 건너뛸 수 있습니다. 결과 예상 대로 되지, 하는 경우 결과 향상 시킬 수 있습니다이 단계를 다시 추가. - 품 슬라이드는 슬라이드에 포함 된 100% 자일 렌 30 분 보장 완전 한 침수에 대 한 항아리. 한번 반복.
참고:이 시점에서, 검사 수행 되어야 한다 직물 단면도 지방 조직 및 파라핀 되도록. 이면 추가 지방 조직 또는 왁 스 분명 크 실 렌에 슬라이드를 다시 침수 한다. 주의 사용 하 여이 조직의 수 축을 일으킬 수로 자일 렌을 추가 노출을 최소화. - 10 분에 대 한 100% 에탄올을 포함 하는 슬라이드 항아리에 리하이드레이션 조직 반복 한 번.
- 이동 슬라이드 10 분에 대 한 95% 에탄올을 포함 하는 슬라이드 항아리를 반복 한 번.
- 슬라이드는 슬라이드 항아리 포함 75% 에탄올 5 분에 대 한 이동
- 슬라이드는 슬라이드 항아리 포함 50% 에탄올 5 분에 대 한 이동
- 10 m m 나트륨 구 연산 염 해결책 (pH 6.0) 핫 플레이트 또는 전자 레인지에 끓인 고 Coplin 항아리에 붓는 다.
주의: 신중 하 게 난방 솔루션을 모니터링 하 고 종 기 피하기 위하여 처리. 컨테이너는 매우 뜨거운 것입니다. 보호를 사용 하 여 화상을 피하기. - 천천히 Coplin에 장소 슬라이드 항아리, 완전 한 침수를 보장 하 고 10 분 검색 epitopes 100 ° C에서 품 어. 제거 하 고 신중 하 게 슬라이드 건조.
- 소수 표시와 함께 조직 주위에 방 벽을 그립니다. 충분 한 내 생 효소 차단 추가 (과산화 수소와 나트륨 아 지 드, 사용할 수 있는 상업적으로) 티슈 커버 하 고 10 분에 대 한 품 어
- Submerge 슬라이드 1 x 인산 염 버퍼 10 분에 대 한 식 염 수 (PBS)
- 티슈 커버 및 실내 온도 습도 챔버에 1 시간에 대 한 품 어 1 x PBS에 충분 한 나 귀 10% 혈 청 추가.
참고: 실험 수 수 일시 중지 여기 하룻밤에 4 ° C에서 습도 챔버 슬라이드를 저장 하 여. 당나귀 혈 청 최적의 착 결과를 발견 했다, 탐정 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 염소 혈 청 등 최적의 결과 결정 하기 위해 혈 청 말 다른 세라를 테스트 하실 수 있습니다. BSA를 사용 하는 경우 탐정이이 신선한 사용 하기 전에 준비 해야 한다. - 는 슬라이드에서 과잉 차단기를 가만히 따르다 고 추가 제대로 희석된 주 항 체 1% 혈 청에서 직접 조직 솔루션에 덮여 균등 하 게 보장 하는 슬라이드. 실내 온도 습도 챔버에 30 분 동안 품 어.
참고:이 단계 수 없습니다 계속 오래 시간 기간에 대 한 4에 저장 하는 습 한 챔버와 ° C. 확인이이 단계에서 적절 한 부정적인 컨트롤 (예: 없는 기본 항 체, 항 원 네거티브 조직, 등 알려진와 슬라이드) 슬라이드를 포함 해야 합니다. - 신중 하 게 약 1 mL의 diH 2 O 조직에 흐르는 슬라이드를 세척 하 고 5 분에 대 한 1 x PBS의 1 변화에 품 어
- 초과 PBS를 가만히 따르다와 조직 및 습도 챔버에 30 분 동안 품 어 충분 한 양 고추냉이 과산화 효소 레이블을 추가.
참고:이 단계에서 탐정 형광 붙일 활용된 2 차 항 체를 사용 하 여 얼룩을 진행 하실 수 있습니다. 적절 하 게 설명 하는 다음 단계를 수정 해야이 바란다면,. - 신중 하 게 약 1 mL의 diH 2 O 조직에 흐르는 슬라이드를 세척 하 고 5 분에 대 한 1 x PBS의 1 변화에 품 어
- Chromogen 솔루션 제조 업체 제안된 비율에 따라 플러스 diaminobenzidine (DAB)을 확인 하 고 소용돌이 의해 혼합.
참고: 많은 기성 품 장비는이 프로토콜에 사용 되는 것 이외에도 상용. - Decant 초과 슬라이드에서 버퍼링 하 고 조직에 직접 chromogen 얼룩의 2-3 방울 (10-50 µ L)를 추가 하 고 습 실에서 5 분 동안 품 어. 신중 하 게 조직에 흐르는 약 1 mL diH 2 O 슬라이드를 세척.
주의: DAB chromogen 매우 독성이 있다. 유해 폐기물에 떨어져 피부와 수집 흐름 얼룩의 직접 접촉을 방지.
- 장소 슬라이드 열 블록에 얼룩이 질에 녹기 파라핀 1 h 58 ˚C 설정.
- Hematoxylin 및 오신 (H & E)
- 해리스 되며 1-2 분에 대 한 수돗물에서 부드럽게 2-2.5 분 린스 슬라이드에서 슬라이드를 잠수함 chromogen 부 화 후 최종 린스 다음
참고: 조직에 물을 직접 제트를 피하기 위해 주의. - Submerge 차별화 솔루션 (0.25 mL의 70% 에탄올 100ml에 염 산의)에서 2-3 s에 대 한 슬라이드. 약 1-2 분에 대 한 수돗물에서 부드럽게 슬라이드 린스
- 30에 대 한 95% 에탄올에 60 미 린스 슬라이드 슬라이드 블루 에이전트 (4.5 mg 탄산 칼슘 100 mL 수돗물, pH 9.4 조정) 잠수함 s.
- Submerge 슬라이드 알코올 오신 2-3 분에 대 한 Y
- 조직 2 변화 1 분에 대 한 95% 에탄올의 탈수.
- 1 분에 100% 에탄올의 변경 1에서 Dehydrate 조직
- 신중 하 게 보풀 지우기와 슬라이드 건조. 적용 1 방울 (약 100-200 µ L)의 합성, 비 수, 수 지 기반 미디어를 슬라이드 및 coverslip 적용 장착.
참고: 다른 착 방법, 선출 하는 경우 다른 설치 미디어 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 탐정 선택 형광 활용 된 이차 항 체, 수성 산 더 이상적인 것. - 하룻밤 실 온에서 설정 하려면 슬라이드 허용.
- 해리스 되며 1-2 분에 대 한 수돗물에서 부드럽게 2-2.5 분 린스 슬라이드에서 슬라이드를 잠수함 chromogen 부 화 후 최종 린스 다음
- Picrosirius 레드 (PSR) 얼룩
- 스테인드 될 immunohistochemistry 프로토콜 6 단계 (50% 에탄올 담가) 따라 하는 슬라이드를 선택 합니다.
- PSR Submerge 슬라이드 1 헤에 대 한 얼룩
- 0.5% 초 산에 대 한 1-2, 얼룩을 차별화 하는 데 두 번 슬라이드 잠수함.
- 조직 2 변화 1 분에 대 한 95% 에탄올의 탈수.
- 1 분에 100% 에탄올의 변경 1에서 Dehydrate 조직
- 짧게에 대 한에 대 한 100% 크 실 렌에 잠수 하 여 슬라이드를 취소 3-4 미
- 신중 하 게 보풀 지우기와 슬라이드 건조. 적용 1 방울 (약 100-200 µ L)의 합성, 비 수, 수 지 기반 미디어를 슬라이드 및 coverslip 적용 장착.
3. 샘플 분석
α-SMA를 위한- Ductal 분석
- 선택 슬라이드 스테인드. 카메라 마운트 목적으로 가벼운 현미경을 사용 하 여 20 배 확대에서 대표 이미지 수집.
- 사용 ImageJ (NIH), 구별 및 각 이미지에 관. 이러한 수동으로 열거 될 수 있다 또는 하나 개별 덕트 숫자 점수를 할당할 수 있습니다. 숫자 점수를 할당 하려면 ImageJ 열고 플러그인을 선택 합니다. 다음 분석을 선택 하 고 드롭 다운 메뉴에서에서 셀 카운터를 선택 합니다. 초기화를 클릭 합니다 다음 덕트를 표시 하려면 1을 강조 표시 합니다. 완료 되 면, ductal 카운트를 볼 결과 선택.
참고: ductal 및 하지 혈관 구조 확인 주의. - 에 ' 설정 측정 ' 옵션, 확인 ' 경계 '와 ' 지역 ".
- Myoepithelial 구획 (α-SMA 얼룩에 의해 원조 하는 시정)에서 각 덕트 주위 선을 그리는 자유형 다각형 도구를 사용 하 여. 선택 ' 측정 ' 경계와 영역 기록.
- 다시 루멘의 내부에 ductal 상피의 꼭대기 측면을 따라 선을 그립니다 자유형 다각형 도구를 사용 하 여. 선택 ' 측정 ' 경계와 영역 기록.
- Ductal 상피의 둘레를 얻기 위하여 myoepithelial 구획의 경계에서 luminal 구획의 둘레를 뺍니다. Ductal 상피의 영역을 얻기 위해 myoepithelial 구획의 지역에서 luminal 구획의 영역을 뺍니다.
- Immunohistochemistry 분석
- ImageJ 등 피지 스위트 분석 소프트웨어에 명시 이미지를 업로드.
참고:이 프로토콜 분석 ImageJ IHC 도구 상자 플러그인을 사용 하 여 얼룩에 대 한 단계를 간략하게 설명. - 는 플러그인 메뉴에서 IHC 도구 상자를 엽니다. 에 " 선택 모델 " 열립니다, 적절 한 얼룩을 선택 하는 콤보 상자 (즉, H-DAB, PSR, 등). 선택은 " 색상 " 얼룩을 옵션. 이 결과 창이 열립니다.
참고:이 메서드는 관심사의 단백질 extracellular 또는 cytosolic 공간에 있는 또는 원형질 막에 바인딩된 경우 적절 한. 관심사의 단백질 핵 이면 선택 " 핵 " 긍정적으로 얼룩진된 핵에 대 한 이미지를 분석 하는 플러그인을 묻는 메시지가 표시 됩니다. - 를 사용 하 여 색상 선택기 슬라이드 배경 포함 또는 과도 한 얼룩 제외 없이 얼룩의 적절 한 절연.
참고: 자동 모드 얼룩을 감지할 수 없거나 허용 이미지 귀착되 지 않는다, 그릴 사각형 관심 영역 (ROI)는 확인 된 이상 스테인드 영역. IHC 도구 상자 창에서 선택 " 기차 " 적절 한 대상에 플러그인 직접. - 16 비트 이미지를 변환합니다. 이동 이미지 → 유형 → 16 비트.
- 임계값 이미지입니다. 이동 이미지 → 조정 → 임계값을 자동.
- 길이 할당 이미지에서 눈금 막대 바로 위에 선 ROI를 그려서 이미지 측정 비율을 설정 합니다. 눈금 막대를 설정 하려면로 이동 분석 → 비율 설정. 길이 (예: 120 픽셀 당 50 µ m)의 원하는 단위 당 픽셀 수를 입력.
- 결과 영역을 측정 하 고 회색 값을 의미. 이동 분석 → 설정 측정 클릭 하 여 측정을 수집 분석 → 측정.
- ImageJ 등 피지 스위트 분석 소프트웨어에 명시 이미지를 업로드.
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Representative Results
여성 쥐 유 방 땀 샘의 5 쌍 있다. 특히, 자 궁 경부 분 비 (#1), 흉부 동맥 (#2 및 #3), 한 쌍의 복 부 동맥 (#4), 그리고 사 타 구니 동맥 (#5) (그림 1A)의 1 쌍의 두 쌍의 한 쌍이입니다. 여기, 우리는 그들은 쉽게 식별 #4 분 비 고립. 일부 경우에 # 4와 #5 분 비 했다 격리 함께 둘 사이의 구분이 어려웠다. 그대로 #4 복 부를 격리 하기 위해 유 방 땀 샘, 펠트는 고정 되었고 신중 하 게 화살표 (그림 1B)에 표시 된 #4 땀 샘의 위치를 드러내는 기본 복 막에서 분리. #4 샘 excised 신중 하 게 되었고 어떤 잔여 피하 또는 근육 직물의 존재에 대 한 검사. 이들은 우리의 고립 된 샘 (그림 1C) 식별, 우리는 조직 되지 제거 된 단면 전에 조직 블록에서 샘 fibronectin 스테인드 실질적으로 더 많은 피하 조직 참고 않았다 (예: 표면) (그림 1D) 땀 샘 조직에서 조직의 100-200 µ m에서 블록 단면 (예: 깊은) (그림 1E) 전에 제거 된 대. 외 인 성 또는 내 인 성 요인에 대 한 응답에서 유선 섬유 증 조직의 더 나은 이해를 얻기 위하여 조사에 섬유 증을 비교 하실 수 있습니다 동맥의 깊은 상처 대 표면. 다른 분석에 대 한 조직 조각화 및 얼룩 경우 상당한 피하 및 근육 조직에 진행은 동맥 해 부를 수행 하기 전에 반 조직 블록 섹션에 탐정에 대 한이 유리할 수 있습니다.
절연, 다음 분 비 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린에 고정, 처리 되었고 얼룩에 대 한 구분. 관심의 다른 단백질 뿐만 아니라 콜라겐 식을 분석 하는 데 사용 되는 단계는 그림 2A에서 묘사 된다. ECM 단백질 콜라겐, fibronectin tenascin C에서 대표 샘플 그림 2B에 나와 있습니다. 각 이미지에 화살표 (그림 2B)이이 조직에 덕트의 존재를 보여줍니다.
덕트의 형태학 상 특징을 계량, 그것은 손상 된 조직 및 덕트 측정 하지 않은 부적당 한 처리 발생할 수 있으므로 주의 조직학 섹션을 치료 하는 것이 중요. 부적절 한 처리의 예 조직, 부적절 한 온도에서 버퍼를 사용 하 여 또는 프로토콜에 지정 된 것 보다 시간이 더 긴 기간에 대 한 초 산 나트륨 시트르산 등 거친 버퍼에서 조직 샘플을 떠나에 직접 버퍼 또는 물 실행 수 수 있습니다. 조직 단면도 조직 손상이 발생 했습니다의 예로 그림 3A에 표시 됩니다. 여기, 조직에 광범위 한 손상 (그림 3A) 덕트에서 파손 지점으로 쉽게 관찰할 수 있습니다. Ductal 구조의 분석을 위해이 섹션을 사용할 수 없습니다. 그대로 조직 표본 측정 및 정량에 있는 덕트의 예로 그림 3B에 표시 됩니다. 여기, 덕트 되지 않습니다만 주변 fibronectin 스테인드 기질, 특징 (그림 3B) 덕트의 루멘을 일렬로 세우는 상피 세포의 인구 밀도의 존재에 의해 특징 또한. 개발 하는 동안 마우스 유선 포함 단일 덕트에서 형성 하는 일련의 분기 및 각 estrous 사이클 회귀를 겪 습 더 복잡된 ductal 트리는 측면 보조 분기 새싹에서 출생 하는 것이 중요 하다 13. 비록 우리가 촬영 하지 않은 고려 사항으로이 실험에서 동물의 estrous 주기, 탐정 ductal 숫자 estrous 사이클의 독립에 대 한 정보를 얻기 위하여 그렇게 하실 수 있습니다. 탐정은 Caligioni14 는 estrous 주기의 단계 결정 될 수 있다 가시 프로토콜 이라고 합니다. 덕트 측정, 관련 조직학이 단원의 여러 ductal 구조의 존재 여러 독특한 덕트 나타내는 되지 않습니다 하지만 오히려 더 개발된 ductal 트리 ductal 파생물에서 결과 나타내는. 덕트, 열거할 하나 조직 섹션에서 개별 덕트 번호를 할당 하는 이미지 분석 소프트웨어 ImageJ (NIH) 등을 사용할 수 있습니다. 탐정 발달 이상이 나 병 적인 상태를 나타내는 수 있는 ductal 번호 변경으로 덕트를 열거 하실 수 있습니다. 우리의 연구에 관하여 우리 탈 식 인슐린 성장 팩터 같은 성장 인자 (IGF-1), ductal 마우스의 알려진된 중재자를 드라이브 수 caveolin-1의 손실에 관련 덕트, ductal 파생물의 결과의 증가 수를 믿고 성장 15입니다.
그대로 덕트의 존재 이외에 여러 가지 덕트 분기, fibronectin 스테인드 섹션 (그림 3C)에서 화살표로 표시 된 포함 되어 있습니다. 이 분석을 위해 이러한 ductal 분기 하지 별도 ductal 구조로 고려 되어야 한다. 평가 하 고 덕트 측정, 하는 동안 그것은 혈관 구조에서 덕트를 구별 하는 것이 중요입니다. 혈관 구조 하지만 확인할 수 있습니다 한 핵, 감염은 구조 지표 적혈구 (RBC)의 존재에 의해 뿐만 아니라 루멘, 안 감 내 피 단층의 존재에 의해 루멘 (그림 3D) 내. 루멘 내의 감염은 구조의 존재 RBC 나타내고 맥 관 구조를 제안, 비록 조직 섹션에 걸쳐 선 수집 중 RBC의 변위 가능 하다. 그것은 내 피 마커 CD31를 사용 하 여 혈관 구조를 확인 하는 것이 좋습니다. CD31로 얼룩진 조직학 섹션의 예는 (그림 3D) 표시 됩니다. Ductal 원주 및 면적 측정 하기 위해서는 벡터 ImageJ (NIH)에서 myoepithelial 국경 (둘레)와 α-SMA 얼룩진 조직 섹션에서 luminal 국경에 할당할 수 있습니다. Α-SMA, 평활 근 세포의 마커 라인 덕트는 myoepithelial 세포 얼룩으로 사용 되었다. 표시 된 이미지에서 빨간 선 파란 선 보여 luminal 테두리 (그림 3E) myoepithelial 국경을 보여 줍니다. 회로도에 표시 된 기질과 luminal 구획 사이 지역 총 실질 조직 플러스 ductal 상피 세포 (그림 3E)에 의해 점유 하는 영역입니다.
그림 1 : 조직학 분석에 대 한 전체, 그대로 유 방 땀 샘의 절연. (A) 동물 희생, 다음는 펠트는 신중 하 게 제거 하 고 다시 진 피와 복 막 사이 있는 유 방 동맥을 노출 고정. 회로도 자 궁 경부 (#1)의 상대 위치를 보여줍니다 흉부 (#의 2, 3), 복 (#4) 및 사 타 구니 (#5). (B) #4 복 부 동맥, 동물 해 부에 표시 된, 빨간색 화살표로 표시 분리 했다. (C) 미 여성 b 6 마우스에서 고립 된 #4 복 부 동맥의 대표적인 예입니다. (D)를 조직 했다 제거 되지 전에 단면 (예: 표면) 파라핀 블록에서 동맥에서 상당한 피하 조직 ECM 단백질 fibronectin에 대 한 얼룩이 지기 다음 분명 했다. (E) Considerab히 적은 피하 조직 및 실질 조직의 얼룩이 더 fibronectin는 100-200 µ m 조직의 단면 (예: 깊은) 이전 파라핀 블록에서 제거 된 동맥에서 관찰 되었다. 조직학 단면도 대표 샘플에서 이다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Histological 처리 및 얼룩. 조직학 처리에 사용 되는 단계 (A) 도식 표현입니다. 다른 일련의 단계 콜라겐 식의 분석을 위해 이용 되었다. (B) ECM 단백질 콜라겐, fibronectin과 여성 미 caveolin-1 부족 한 동물의 분 비에서 tenascin C의 대표 이미지. 콜라겐, fibronectin과 tenascin-C에 대 한 화살표 덕트를 일렬로 세우는 밀도 기질을 나타냅니다. PSR: Picrosirius 레드입니다. Fn: fibronectin. 10-c: tenascin c 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: ductal 구조의 분석. (A) 섹션 스테인드 fibronectin 광범위 한 조직 손상을 보여 줍니다. 이것은 나누기 ductal 구조 (화살표)의 존재에 의해 표시 됩니다. (B) 섹션 스테인드 fibronectin 상피 세포의 하나 이상의 레이어 및 주변 기질 루멘의 존재에 의해 표시 된 그대로 ductal 구조의 존재를 보여 줍니다. 화살표는 개별 ductal 구조를 나타냅니다. (C) fibronectin 스테인드 이미지 화살표와 함께 표시 됩니다 있는 ductal 분 지의 존재를 강조 표시 합니다. 이러한 큰 ductal 구조의 루멘과 연속성 note (D) 혈관 구조 (빨간색 화살표), 셀의 단일 층과-nucleated 감염은 구조를 나타내는 붉은 혈액 세포의 존재에 의해 특징은 덕트 (검은색 화살표)와 근접에서 자주 관찰 된다. 낮은 확대에 왼쪽 이미지에 표시 되 고 해당 고배율 이미지 오른쪽에 표시 됩니다. 이러한 이미지는 H로 얼룩진 했다 &와 tenascin. CD31 혈관 구조를 일렬로 세우는 내 피 세포에 대 한 긍정적인 표식으로 사용 되었다. 표시 하는 것은 큰 혈관 구조는 CD31에 긍정적인 세포 혈관의 루멘을 안 감 볼 수 있습니다. 낮은 확대에 왼쪽 이미지에 표시 되 고 해당 고배율 이미지 오른쪽에 표시 됩니다. (E) Ductal 둘레 α SMA 스테인드 이미지 벡터 (에 표시 된 빨간색) 동안 ductal 지역 luminal 구획 외곽선을 벡터 (파란색으로 표시)을 사용 하 여 측정 되었다 myoepithelial 구획을 윤곽을 사용 하 여 측정 했다. 기질 및 luminal 구획 사이 지역 ductal 지역으로 분류 되었다. 눈금 막대 = 50 µ m. ductal 구조는 경계 및 영역 측정 영역을 강조 표시의 개략도. 10-c: tenascin c 그림 E에 조직학 섹션에서 수정 된: 톰슨 C 외. 16 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
신문에서 우리 그대로 마우스 유 방 땀 샘: ECM 표현과 ductal 형태학의 다운스트림 조직학 분석을 분리 하는 기법을 설명 했습니다. Ductal 형태학의 분석, 관련이 방법론 ductal 아키텍처 기반으로 얼룩진된 조직학 섹션의 신속한 조사를 수 있습니다. Ductal 분석의 다른 방법 염료 ductal 트리의 시각화 수 있도록 기술적으로 도전적이 고 많은 시간이 소요 될 수 있는 방법의 주사에 의존 합니다.
유방암, ECM 비정상적인 수를 보고 되었습니다. 1 , 2 , 6 , 9 특히 ECM의 풍부 그리고/또한 cross-linking 패턴의 변화 보고 된 종양 진행, 전이 및 치료 저항3,4,6,7에 영향을 ,,89. 또한, ECM 환경에서 변화 또한 ductal 상피 세포 형태학 및 확산17, 잠재적으로 종양 개시를 선호 하는 상황에 이르는 변경 보고 되었습니다. ECM 식 caveolin-1의 손실 다음 ductal 형태에 변화를 평가 하기 위해 caveolin-1 부족 한 동물 모델을 활용 하 고, 하는 동안 하나 어떤 마우스 모델에서이 방법론을 적용할 수 있습니다. ECM 식 패턴 및 ductal 아키텍처 평가, 다운스트림 조직학 분석에 대 한 전체, 그대로 유 방 동맥을 분리 하는 기술을 설명 합니다. 결과이 방법론에서 나왔고 ECM 표현과 선 형태학의 강력한 분석. 우리는 그 분석 ECM 식, 특히 fibronectin 표면 조직의 100-200 µ m 단면 이전 선의 섬유 증의 더 완전 한 그림을 굴복 얼룩 제거 되었습니다 섹션에서 발견. 또한, 우리는 반대로 BSA 혈 청 당나귀의 사용 더 나은 품질 조직학 샘플 있는 일반적인 얼룩은 실질적으로 감소를 굴복 발견.
Ductal 건축의 분석에 대 한 섹션 있는 조직을 그대로 덕트는 파손 점, 부적 절 한 조직 처리의 결과 포함 및 단면, 하는 것은 분명 중요 하다. 또한, 그것은 올바르게 ductal 분기, 조사, 측정 하실 수 있습니다 다른 매개 변수 및 그들의 단층 endothelium에 의해 쉽게 확인 될 수 있는 혈관 구조와 내 감염은 구조를 구별 하는 것이 중요 합니다 CD31와 얼룩 뿐만 아니라 루멘입니다. 동안 덕트 섹션 다양 한 ECM 단백질, myoepithelial 마커 αSMA 및 H 물에서 관찰 되었다 & E counterstaining는 덕트, 덕트의 열거의 세포질 구성 요소 강조 표시 하 고 모든 연결된 지점 h 달성입니다 & E 얼룩진된 조직 섹션 혼자입니다. Ductal morphogenesis의 자세한 분석 또는 사전 종양 약 또는 종양 약 병 변의 존재의 분석, 조사 confocal 영상 라이브 전 비보 조직 평가에 활용 하실 수 있습니다. 이 경우 전체 동맥 excised 됩니다 같은 기술은 고정 및 제거 단계를 처리 하는 조직으로 적용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 중요 한 단계 수술 마이크로 loupes 뿐만 아니라 #4 복 부 동맥의 정확한 식별을 사용 하지만 또한 overlying 피부를 기본 복 막 동맥의 해 부를 허용의 사용을 포함 합니다. 상당한 피하 조직과 근육의 조직학 얼룩에 지방 관련 간섭 감소. 또한, 더 나은 동맥에 ECM 식 변경 식별, 하 우리 발견 잔여 지방 조직 제거 하는 것을 도운 조직 블록의 100-200 µ m를 제거 하는 데 유용. 전체 유선 격리 기질 단백질 표정 및 ductal morphogenesis 넓은 변화 조직에 정보를 제공, 비록 설명된 기술 직렬 섹션의 분석에서 고정 제한, 파라핀 조직 포함. Ductal에 어떤 변화 정도 설정 하려면 분기 생겼다, 라이브, 전 비보 조직의 전체 마운트 이미징 필요가 있을 것 이다. 여기, 조사 선 특정 단백질 상호 작용을 연구 하거나 사용 하는 이미징18이전 ductal 나무를 조명 하는 염료를 사용자 정의 조건부 형광 기자 활용형 디자인 Cre Lox를 사용할 수 있습니다. 이것 이외에, 더 선 전체에 관심사의 단백질의 분석 것 할 거 서쪽 오 점 또는 질량 분석 또는 immunoprecipitation (클립) 또는 chromatin cross-linking 같은 다른 높은 처리 기술 사용 immunoprecipitation (칩)입니다. 이 경우 전체 땀 샘 것 수 해 부, 작은 조각으로 sectioned 및 다운스트림 분석에 대 한 적절 하 게 처리. 또한, 하나의 조직 단면도에 형광 이미징을 사용할 수 있습니다. 이 기술은 여러 단백질과 같은 조직에서 단백질 식 공동 지역화 분석에 대 한 이상적인 것입니다.
요약 하자면, 우리 전체, 그대로 유 방 땀 샘의 급속 한 격리를 제공 하 고 조직학 처리 및 ductal 분석에 더 자세한 정보를 제공 하는 기술을 설명 합니다. 이 기술의 미래 응용 프로그램 ECM 표현과 ductal 형태학 종양 베어링 동물에서에 관련 된 변화 조사 수 있습니다. 또한, 콜라겐 방향과 섬유 직경, 조직 밀도 분석 하는 데 유용 수 있는 정보 분석 PSR 스테인드 섹션에도 수행할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 동물 검 시와 선 격리 지원에 대 한 4 월 간 계 및 박사 로저 Broderson를 각각 인정 하 고 싶습니다. 이 작품에 대 한 자금 지원 Osteopathic 약의 필라델피아 대학 센터에서 만성 장애의 노화 한다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
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