Summary
Her presenterer vi en protokoll for isolering av hele, intakt musen brystkjertlene undersøke ekstracellulær matrix (EFM) uttrykk og ductal morfologi. Musen #4 abdominal kjertler ble Hentet fra 8-10 uke gamle kvinnelige nulliparous mus, fast i nøytral bufrede formalin, delt og farget med immunohistochemistry for ECM proteiner.
Abstract
Målet med denne prosedyren var å høste #4 abdominal brystkjertlene fra kvinnelige nulliparous mus for å vurdere ECM uttrykk og ductal arkitektur. Her ble en liten lomme under huden opprettet med Mayo saks, slik at separasjon av kjertler i subkutant vev fra underliggende peritoneum. Visualisering av kjertler hjelp ved bruk av 3,5 x-R kirurgisk mikro forstørrelsesglass. Pelt var invertert og låste tilbake tillater identifikasjon av intakt mammary fett pads. Hver av #4 abdominal kjertler var rett ut dissekert etter glidende skalpell bladet lateralt mellom det subcutaneous lag og kjertler. Umiddelbart etter innhøsting, kjertler ble plassert i 10% nøytral bufrede formalin for påfølgende vev behandling. Eksisjon av hele kjertel er en fordel fordi det primært eliminerer risikoen for unntatt viktige vev bred samhandling mellom ductal epitelceller og andre microenvironmental mobilnettet populasjoner som kunne bli savnet i en delvis biopsi. Ettall ulempen av metodikken er bruk av føljetong inndelinger fra fast vev som begrenser analyser av ductal morphogenesis og protein uttrykk til atskilte steder innen kjertel. Som sådan, endringer i ductal arkitektur og protein uttrykk i 3 dimensjoner (3D) er ikke lett oppnåelig. Samlet er teknikken gjelder for studier som krever helt intakt murine brystkjertlene for nedstrøms undersøkelser som utviklingsmessige ductal morphogenesis eller bryst kreft.
Introduction
Brystkreft er preget av en betydelig grad av vev fibrose1,2,3,4. Kalles ECM, denne ikke-mobil enhet finnes i varierende grad i alle vev og består hovedsakelig av en kompleks meshwork av fibrillar og ikke-fibrillar collagens og elastin glykoproteiner i tillegg til ulike signalnettverk molekyler som er sequestered i denne matrisen. Under homøostatisk forhold, er avsettelse og nedbrytning av ECM strengt kontrollert. 5 under brystet tumorigenesis, balansen av ECM avsettelse og fornedrelse blir forstyrret. Som sådan, har bryst tumorer blitt rapportert å uttrykke rikelig ECM proteiner som collagens, fibronectin og tenascin-C blant andre. 6 unormal uttrykket av disse proteinene i tillegg til økt mønstre av matrix crosslinking er dokumentert for å fremme bryst svulst progresjon og metastasering terapi motstand1,3, 4,7,8,9.
For å vurdere ECM sammensetning og ductal morfologi, ble isolering av intakt brystkjertlene utført. Her vi brukte kvinnelige nulliparous mus mangelfull for caveolin-1, en integrert membran protein som har vært knyttet til en aggressiv brystet tumor signatur10,11,12, og kontrollere kvinnelige nulliparous B6 mus. Histologiske behandling og flekker av disse vev tillatt identifikasjon av flere ECM proteiner sammen med karakterisering av ductal morfologi.
Samlet gir isolering av hele, intakt brystkjertlene forskere mulighet til å undersøke vev hele morfologiske eller cellular omveltningene svar eksogene eller endogene faktorer. Ulemper av teknikken er forbundet med analyser av 2 dimensjon (2D) vev seksjoner i motsetning til et 3D-perspektiv, som ville gi et mer komplett bilde av kompleks morfologi av ductal treet. Gitt kompleksiteten i celle-celle og celle-ECM interaksjoner som finner sted i melkekjertlene, er isolering av hele, intakt kjertler fordelaktig for effektivt analysere ductal morfologi og protein uttrykk i ulike regioner for Trouble mammary kjertel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
prosedyrer som involverer dyr fag i denne protokollen ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Philadelphia College av osteopatisk medisin og alle teknikker ble gjennomført under strenge etiske retningslinjer.
1. sample innkjøp og behandling
- Velg passende dyr emne og sted i en CO 2 kammer. For dette eksperimentet, bruke 8-10 uke gamle kvinnelige nulliparous B6. CG-Cav1tmMIs/J og C57BI/6J.
- Slå på gasstrømmen til 30-40%. Når Dyret er synlig bevisstløs etter ca 2 minutter, åpne gassventilen full press for en ekstra 5 min.
Merk: Bekreft dyr død ved å observere synlige puste (f.eks bevegelse av brystet) for en periode på 10 min etter opphør av CO 2 levering. Hvis dyret fortsatt i live, kan det være plassert tilbake i CO 2 kammeret. Cervical forvridning kan også brukes selv om det ikke anbefales som blod kan samle seg rundt brystkjertlene forstyrrer disseksjon og resultatene. - Etter offer, pin carcass i supine posisjon og Mette med 70% etanol.
- Klemme pelt like over skambeinet ved hjelp av pinsett og nick med liten kirurgisk saks. Roterende saksen, kuttet pelt langs ventrale midtlinjen flytte caudal til skallen.
- Med større saks eller en hemostat, rett ut dissekere subkutan fascia bilateralt, bruker forsiktig ikke for å punktere peritoneum. Skjær langs vannrette margene i begge distale ender av innsnitt.
- Pin pelt flaps åpne og spray igjen med 70% etanol.
Merk: Selv om bruk av 70% etanol tillatt bedre visuelle forskjellen mellom kjertel og de omkringliggende subkutane vev, være forsiktig for å unngå tørking av vev som følge av bruk av denne løsningen. For å unngå tørking, fjerne kjertelen i en tidsramme for ikke å overskride 4 min. Som et alternativ til 70% etanol, etterforskeren kan også erstatte en generell isolere buffer, for eksempel 1 x PBS, unngå vev uttørking. - Finne brystkjertlene av interesse, Skyv et #4 skalpell blad av pelt flaps, kutte mammary kjortelen og forbundet kutan liggende under adipose fri fra dermis.
Merk: 3,5 x kirurgisk mikro forstørrelsesglass kan hjelpe enklere visualisering av kjertler. - Umiddelbart dukke nylig isolert kjertel i konisk rør som inneholder 10:1 løsning-vev volumet av 10% nøytral bufrede formalin for 24-48 h.
Merk: Avhengig av hensikt studie, mange alternative fiksativene kan brukes som paraformaldehyde, etanol genomisk studier og kommersielt tilgjengelig RNA bevare buffere. - Følger institusjonelle protokoller for parafin innebygging, sende prøver til en leverandør for behandling, innebygging, og slicing/gli montering. Seksjon vev på 5 µm.
Merk: På grunn av overflødig adipose omkringliggende kjertel, Vurder å fjerne 100-200 µm av vev før snitting og farging.
2. Vev Beising
- Immunohistochemistry
- sted lysbilder å bli farget på varme blokk satt på 58 grader 1t å smelte parafin.
FORSIKTIG: Smelter parafinvoks kan kjøre av lysbildet. Monitor tett eller sted tørk under lysbildet å fange avrenning voks.
Merk: Dette trinnet er ikke nødvendig og kan hoppet. Hvis resultatene er ikke som forventet, legger dette trinnet tilbake kan forbedre resultater. - Incubate lysbilder i et lysbilde jar inneholder 100% xylen i 30 min sikre full neddykking. Gjentas én gang.
Merk: på dette punktet, visuell inspeksjon skal utføres for å sikre at vev deler fettvev og parafin. Hvis flere fettvev eller voks er tydelig, bør lysbildet re dyppes i xylen. Vær forsiktig for å minimere legges avsøring å xylen da dette kan føre til reduksjon av vev. - Rehydrate vev i et lysbilde glasset som inneholder 100% etanol for 10 min. gjentas én gang.
- Flytte lysbildene et lysbilde glasset som inneholder 95% etanol for 10 min. gjentas én gang.
- Flytte lysbildene et lysbilde glasset som inneholder 75% etanol i 5 min.
- Flytte lysbildene et lysbilde glasset som inneholder 50% etanol i 5 min.
- Koke 10 mM natriumsitrat løsning (pH 6.0) i en varm plate eller mikrobølgeovn og hell i Coplin jar.
FORSIKTIG: Nøye overvåke løsningen mens oppvarming og ta vare for å unngå koke. Beholder blir veldig varmt. Bruk sikringen for å unngå brannskader. - Sakte sted lysbilder til Coplin jar, sikre full neddykking, og ruge ved 100 ° C i 10 min å hente epitopes. Fjerne og nøye tørke lysbilder.
- Tegne en barriere rundt vev med merketråd hydrofobe. Legg nok endogene enzym blokkering (hydrogenperoksid og Natriumazid, tilgjengelig kommersielt) å dekke vev og ruge for 10 min.
- Submerge lysbilder i 1 x fosfat bufret saltløsning (PBS) i 10 minutter
- Legger nok 10% esel serum i 1 x PBS å dekke vev og ruge 1t ved romtemperatur i en fuktet kammer.
Merk: Eksperimentet kan pauses her ved å lagre lysbilder i fuktet kammeret ved 4 ° C over natten. Mens esel serum ble funnet for å gir optimal flekker, kan etterforskeren ønske å teste ulike sera som storfe serum albumin (BSA), geit serum eller hest serum å bestemme optimale resultater. Hvis bruker BSA, etterforskeren bør forberede denne friske før bruk. - Dekanter overflødig blokkering fra lysbildene og legge til riktig utvannet primære antistoff i 1% serum direkte til lysbilder sikrer at vevet er jevnt dekket i løsningen. Inkuber i 30 min ved romtemperatur i en fuktet kammer.
Merk: Dette trinnet kan videreføres for lengre tid varighet med fuktig kammer lagret på 4 ° C. Sørg for å inkludere riktig negativ kontroll lysbilder (f.eks et lysbilde med ingen primære antistoff, kjent antigen-negativ vev, etc.) på dette trinnet. - Forsiktig vaske lysbilder av flytende ca 1 mL av di 2 O over vev og ruge i 1 endring av 1 x PBS i 5 min.
- Dekanter overflødig PBS og legge nok pepperrot peroxidase etiketten for å dekke vev og ruge i 30 min i en fuktet kammer.
Merk: På dette trinnet etterforskeren kan ønske å gå videre til fluorescerende flekker bruker fluorescently konjugert sekundære antistoffer. Hvis dette er ønskelig, de neste fremgangsmåten bør endres tilsvarende. - Forsiktig vaske lysbilder av flytende ca 1 mL av di 2 O over vev og ruge i 1 endring av 1 x PBS i 5 min.
- Gjør diaminobenzidine (DAB) pluss chromogen løsning ifølge produsenten foreslåtte forholdet og blande av vortex.
Merk: Mange ferdige prosjektpakker er kommersielt tilgjengelige bortsett fra den som brukes i denne protokollen. - Decant overflødig buffer fra lysbildene og legge 2-3 dråper (10-50 µL) chromogen flekken direkte til vev og Inkuber i 5 min i fuktig kammer. Forsiktig vaske lysbilder med flytende ca 1 mL di 2 O over vev.
FORSIKTIG: DAB-chromogen er svært giftig. Unngå direkte kontakt med flekk med hud og samle flyt av i spesialavfall.
- sted lysbilder å bli farget på varme blokk satt på 58 grader 1t å smelte parafin.
- Hematoxylin og Eosin (H & E)
- etter endelig skylling etter chromogen inkubasjon dukke lysbilder i Harris hematoxylin for 2-2.5 min. skyll lysbilder forsiktig under vann i 1-2 min.
Merk: Sørg for å unngå direkte strålen av vann på vev. - Submerge lysbilder for 2-3 s i differensiering løsning (0,25 mL saltsyre i 100 mL 70% etanol). Skyll lysbildene forsiktig under vann i ca 1-2 min.
- Dukke lysbilder i blå agent (4,5 mg kalsiumkarbonat i 100 mL vann, pH tilpasset 9.4) for 60 s. skyll lysbilder i 95% etanol for 30 s.
- Submerge lysbilder i alkoholholdige eosin Y for 2-3 min.
- Tørke vev 2 endringer av 95% etanol for 1 min.
- Dehydrate vev i 1 endre av 100% etanol i 1
- Nøye tørke lysbilder med en lofri tørke. Bruke 1 dråpe (ca 100-200 µL) av syntetiske, ikke-vandig, harpiks-baserte montering media skyve og bruker dekkglassvæske.
Merk: Hvis en annen flekker metode ble valgt, en annen monterer medier kan være nødvendig. For eksempel hvis etterforskeren valgte et lysstoffrør-konjugerte sekundære antistoff, en vandig mount ville være mer ideelt. - Tillate lysbilder å sette over natten i romtemperatur.
- etter endelig skylling etter chromogen inkubasjon dukke lysbilder i Harris hematoxylin for 2-2.5 min. skyll lysbilder forsiktig under vann i 1-2 min.
- Picrosirius rødt (PSR) Beising
- merker lysbildene bli farget og følger immunohistochemistry protokollen gjennom trinn 6 (50% etanol suge).
- Submerge lysbilder i PSR flekken for 1 h.
- Dukke lysbilder i 0,5% eddiksyre for 1-2 s, to ganger for å skille flekken.
- Tørke vev 2 endringer av 95% etanol for 1 min.
- Dehydrate vev i 1 endre av 100% etanol i 1
- Fjerne lysbilder ved kort submerging i 100% xylen for om 3-4 s.
- Nøye tørke lysbilder med en lofri tørke. Bruke 1 dråpe (ca 100-200 µL) av syntetiske, ikke-vandig, harpiks-baserte montering media skyve og bruker dekkglassvæske.
3. Prøve analyse
- Ductal analyse
- Velg lysbilder farget for α-SMA. Bruke lys mikroskop utstyrt med et kamera montert mål, samle representant bilder med 20 X forstørrelse.
- Bruke ImageJ (NIH), skille og telle kanaler i hvert bilde. Dette kan listes manuelt eller en kan tilordne en numerisk score til individuelle kanaler. Hvis du vil tilordne en numerisk score, åpne ImageJ og velg Plugins. Neste Velg analyser og velg cellen Counter fra rullegardinmenyen. Klikk Initialiser og markere Type 1 for å starte merking kanaler. Når ferdig, Velg resultater å vise ductal greven.
Merk: ta vare for å bekrefte strukturer er ductal og ikke vaskulære. - i ' sette mål ' alternativer, sjekk ' ytre ' og ' området ".
- Bruker verktøyet polygoner, tegne en linje rundt hver rør i myoepithelial rommet (synlighet hjulpet av α-SMA flekken). Velg ' mål ' og registrere omkretsen og arealet.
- Igjen ved hjelp av verktøyet polygoner tegne en linje langs apikale ductal epitel i indre av lumen. Velg ' mål ' og registrere omkretsen og arealet.
- Trekke omkretsen av luminal rommet fra omkretsen av myoepithelial rommet for å få omkretsen av ductal epitel. Trekke fra området av luminal kupé fra området av myoepithelial kupé å få området ductal epitel.
- Immunohistochemistry analyse
- laste opp brightfield bilder til en analytisk programvare, for eksempel ImageJ eller FIJI Suite.
Merk: Denne protokollen beskriver fremgangsmåten til farging analyse bruker ImageJ og IHC verktøykassen plugin. - Åpne IHC verktøykassen Plugin-menyen. I den " Velg modell " kombinasjonsboksen som åpnes, og velg riktig flekk (i.e. H-DAB, PSR, etc.). Velg den " farge " alternativet å isolere flekken. Dette vil åpne en resultatvinduet.
Merk: Denne metoden er egnet hvis et protein rundt ligger i de ekstracellulære eller cytosolic mellomrommene, eller er bundet til plasma membranen. Hvis protein rundt kjernefysiske, velge " kjerner " be plugin å analysere bildet for positivt farget atomkjerner. - Bruke fargen Chooser Skyv for å sikre riktig isolasjon flekken uten bakgrunn inkludering eller overdreven flekken utelukkelse.
Merk: Hvis automatisk modus ikke finner flekken eller fører ikke akseptabel bilder, tegne et kvadrat område av interesse (ROI) over en identifisert farget regionen. IHC verktøykassa, Velg " tog " til direkte plugin til riktig mål. - Konvertere bildet til 16-biters. Gå til bilde → Type → 16 bit.
- Terskel bildet. Gå til bilde → justerer → automatisk terskelen.
- Angi målskalaen bildet ved å tegne en linje ROI direkte over baren skala i bildet deretter tilordne lengden. Hvis du vil angi skala, gå til analyser → angi skalaen. Skriv inn antallet piksler per ønsket enheten lengde (f.eks 120 piksler per 50 µm).
- Måle resulterende området og mener grå verdi. Gå til analyser → sette mål og samle målingen ved å klikke analyser → mål.
- laste opp brightfield bilder til en analytisk programvare, for eksempel ImageJ eller FIJI Suite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kvinnelige mus har 5 par brystkjertlene. Det oppstår et par cervikal kjertler (#1), to par thorax kjertler (#2 og #3), et par av abdominal kjertler (#4) og 1 par lysken kjertler (#5) (figur 1A). Her isolerte vi #4 kjertler som de er lett identifiserbare. I noen tilfeller var både #4 og #5 isolert sammen som skillet mellom to var vanskelig. For å isolere intakt #4 abdominal brystkjertlene, pelt var festet og nøye skilt fra underliggende peritoneum, avslørende plasseringen av #4 kjertler angitt med en pil (figur 1B). #4 kjertlene var nøye forbrukeravgift og inspisert for tilstedeværelsen av eventuelle gjenværende subkutan eller muskel vev. Selv om disse ikke var identifiserbare i vår isolerte kjertler (figur 1C), vi oppmerksom vesentlig mer subkutant vev i fibronectin-farget glands fra vev blokker der vev ikke var blitt fjernet før snitting (f.eks overfladisk) (figur 1D) versus kjertler i som 100-200 µm vev fra vevet blokk hadde fjernet før snitting (f.eks dyp) (figur 1E). For å få en bedre forståelse av vev fibrosis melkekjertlene svar eksogene eller endogene faktorer, etterforskeren ønsker å sammenligne fibrosis overfladisk versus dype kutt av kjertel. For andre analyser, kan det være en fordel for etterforskeren til delen vev blokken i to før fortsetter til vev kutting og flekker hvis betydelige subkutan og/eller muskelvev finnes følgende kjertel disseksjon.
Etter isolasjon, kjertler var fast i 10% nøytral bufrede formalin, behandlet og delt til farging. Trinnene for å analysere kollagen uttrykk i tillegg til andre proteiner av interesse er avbildet i figur 2A. Representative utvalg fra ECM proteiner kollagen, fibronectin og tenascin-C er vist i figur 2B. Pilene i hver av bildene viser tilstedeværelse av kanaler i disse vev (figur 2B).
For å kvantifisere morfologiske funksjoner i kanaler, er det viktig å behandle histologiske delene med forsiktighet som feil håndtering kan føre skadet vev og kanaler som ikke er målbare. Eksempler på uriktig håndtering kan kjøres buffere eller vann direkte på vev, bruker buffere ved en feil temperatur eller forlate vevsprøver i harde buffere som natriumsitrat og eddiksyre for en lengre periode enn i protokollen. Et eksempel på en vev del skaden oppstod i vev som vises i Figur 3A. Her, kan omfattende skade på vev lett observeres brekkasje punkter i kanalene (Figur 3A). Del kan ikke brukes for analyser av ductal strukturer. Et eksempel på en intakt vev prøven hvor ledningskanalene er målbare og kvantifiserbare vises i Figur 3B. Her ledningskanalene er ikke bare preget av det omkringliggende fibronectin-farget stroma, men er også preget av tilstedeværelsen av et tett befolket av epitelceller fôr lumen av kanaler (Figur 3B). Det er viktig å merke seg at under utvikling, musen melkekjertlene inneholder en enkelt rør ved fødselen fra som lateral sekundære grener spire, danner en mer komplisert ductal treet som gjennomgår en rekke forgrening og regresjon med hver estrous syklus 13. selv om vi ikke har tatt i betraktning estrous syklusen dyrene i disse eksperimentene, etterforskeren ønsker for å få informasjon om ductal tall uavhengig av estrous syklusen. Etterforskeren kalles en protokoll av Caligioni14 der scenen av estrous syklusen kan bli synlig bestemt. Med hensyn til kvantifisere kanaler, tilstedeværelse av flere ductal strukturer i inndelingene histologiske er ikke indikativ av flere unike kanaler, men heller antyder et mer utviklet ductal tre skyldes ductal utvekst. For å nummerere kanaler, kan man bruke en analyseprogramvare som ImageJ (NIH) for å knytte et nummer til individuelle kanaler i en vev-delen. Etterforskeren kan vil nummerere kanaler som endringer i ductal tall, som kan være tegn på utviklingsmessige unormalt eller en patologisk tilstand. Med hensyn til vår studie tror økt antall kanaler, et resultat av ductal utvekst, vi er knyttet til tap av caveolin-1 som kan kjøre avvikende uttrykket av vekstfaktorer som insulin vekstfaktor 1 (IGF-1), kjent bare for musen ductal vekst 15.
Foruten tilstedeværelsen av intakt kanaler inneholde flere kanaler grener, angitt med piler i en fibronectin-farget delen (Figur 3C). For denne analysen, bør disse ductal grenene ikke anses som en separat ductal struktur. Mens evaluerer og måler kanaler, er det viktig å skille kanaler fra vaskulære strukturer. Vaskulære strukturer kan ikke bare bli identifisert ved tilstedeværelse av en endotelial monolayer lining lumen, men også av tilstedeværelsen av en kjernefysisk, eosinophilic strukturer indikativ av røde blodlegemer (RBC) innen lumen (Figur 3D). Selv om tilstedeværelsen av eosinophilic strukturer i lumen angir RBC og antyder blodkar, er forskyvning av RBC under kjertel samling av vev deler mulig. Det anbefales å bekrefte vaskulære strukturer ved hjelp av endothelial merket CD31. Et eksempel på en histologiske delen med CD31 vises (Figur 3D). For å kvantifisere ductal omkrets og areal, kan vektorer i ImageJ (NIH) tilordnes skissere myoepithelial grensen (omkrets) og den luminal grensen i α-SMA-farget vev-delen. Α-SMA, en markør av glatt muskelceller, ble brukt som den flekker myoepithelial cellene hvilken linje kanaler. I bildet som vises, viser den røde linjen myoepithelial grensen mens den blå linjen viser luminal grensen (Figur 3E). Området mellom stromal og luminal seksjonene, vises i skjemaet, er et område okkupert av totale stromal vevet pluss ductal epitelceller (Figur 3E).
Figur 1 : Isolering av hele, intakt brystkjertlene for histologiske analyser. (A) følge dyr offer, pelt var forsiktig fjernet og låste tilbake for å avsløre brystkjertlene ligger mellom dermis og peritoneum. Skjematisk viser de relative plasseringene til livmorhalskreft (#1), thorax (#'s 2 og 3), mage (#4) og lysken (#5) kjertler. (B) The #4 abdominal kjertler, vises i dissekert dyret og markert med røde piler, ble isolert. (C) representativt eksempel på #4 abdominal kjertler isolert fra nulliparous kvinnelige B6 mus. (D) betydelig subkutant vev fra kjertler som vev ikke hadde blitt fjernet fra parafin blokken før snitting (f.eks overfladisk) var tydelig etter farging for ECM protein fibronectin. (E) Considerably mindre subkutant vev og mer fibronectin farget stromal vev ble observert fra kjertler som 100-200 µm av vev hadde blitt fjernet fra parafin blokken før snitting (f.eks dypt). Histologiske delene er fra representative utvalg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Histological behandling og farging. (A) skjematisk fremstilling av trinnene for histologiske behandling. En annen serie med trinn ble benyttet for analyser av kollagen uttrykk. (B) representant bilder av ECM proteiner kollagen, fibronectin og tenascin-C fra kjertler kvinnelige nulliparous caveolin-1 mangelfull dyr. Pilene for kollagen, fibronectin og tenascin-C angir det tette stroma fôr ledningskanalene. PSR: Picrosirius rød. FN: fibronectin. Ti-C: tenascin-C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: analyser av ductal arkitektur. (A) en fibronectin farget delen illustrerer omfattende vevsskade. Dette er preget av tilstedeværelsen av pauser i ductal strukturer (piler). (B) en fibronectin farget delen illustrerer tilstedeværelsen av intakt ductal strukturer som er preget av tilstedeværelsen av lumen omgitt av ett eller flere lag av epitelceller og en omkringliggende stroma. Pilene angir individuelle ductal strukturer. (C) en fibronectin-farget bilde høydepunkter tilstedeværelsen mellom ductal som angis med piler. Merk kontinuiteten av disse med lumen større ductal struktur. (D) vaskulære strukturer (røde piler), preget av en enkelt lag av celler og tilstedeværelsen av en nucleated eosinophilic strukturer indikativ av røde blodceller, er ofte observert i nærheten med kanaler (svart pil). Lav forstørrelse er vist i bildet til venstre og en tilsvarende forstørring bilde vises til høyre. Disse bildene var farget med H & E og tenascin-C. CD31 ble brukt som en positiv markør for endotelceller fôr vaskulære strukturer. Vist er stor Vaskulær struktur som CD31 positive celler, vises fôr lumen av fartøyet. Lav forstørrelse er vist i bildet til venstre og en tilsvarende forstørring bilde vises til høyre. (E) Ductal omkrets ble målt i et α-SMA-farget bilde med en vektor (vist inne rød) skissere myoepithelial rommet mens ductal området ble målt ved hjelp av en vektor (vist i blått) skissere luminal rommet. Regionen mellom seksjonene stromal og luminal var klassifisert som ductal området. Skala bar = 50 µm. skjematisk av en ductal struktur som fremhever områder som omkretsen og arealet ble målt. Ti-C: tenascin-C. Tallet E histologiske delen ble endret fra: Thompson C et al. 16 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I papiret, har vi beskrevet en teknikk for å isolere intakt musen brystkjertlene for nedstrøms histologiske analyser av ECM uttrykk og ductal morfologi. Med hensyn til analyser av ductal morfologi kan denne metodikken rask etterforskning av ductal arkitektur basert på farget histologiske deler. Andre metoder for ductal analyser er avhengige av injeksjoner av fargestoffer aktivere visualisering av ductal treet, metoder som kan være teknisk utfordrende og tidkrevende.
I brystkreft, har ECM blitt rapportert å være unormal. 1 , 2 , 6 , 9 spesielt endringer i overflod og/eller cross-linking mønstre av ECM har blitt rapportert å påvirke svulst progresjon og metastasering terapi motstand3,4,6,7 ,8,9. I tillegg har endringer i ECM miljøet også blitt rapportert å endre ductal epithelial celle morfologi og spredning17, kan føre til en situasjon favoriserer svulst innvielse. Mens vi benyttet en caveolin-1 mangelfull dyr modell for å vurdere endringer i ECM uttrykk og ductal morfologi etter tap av caveolin-1, kan en bruke denne metodikken i noen musemodell. For å vurdere ECM uttrykk mønstre og ductal arkitektur, beskriver vi en teknikk for å isolere hele, intakt brystkjertlene for nedstrøms histologiske analyser. Resultater fra denne metodikken gitt robuste analyser av ECM uttrykk og kjertel morfologi. Vi fant analysere ECM uttrykket, spesielt fibronectin, fra inndelinger som 100-200 µm av overfladisk vev ble fjernet før snitting og flekker gitt et mer komplett bilde av kjertel fibrose. I tillegg fant vi at bruk av esel serum i motsetning til BSA gitt bedre kvalitet histologiske prøver som ikke-spesifikk farging ble betydelig redusert.
For analyser av ductal arkitektur er det viktig å bruke inndelinger som vev er intakt og inneholder kanaler der brekkasje poeng, et resultat av feil vev håndtering og snitting er ikke åpenbart. Videre er det viktig å riktig skille mellom ductal grener, en annen parameter som etterforsker kanskje ønsker å måle og vaskulære strukturer som kan lett identifiseres av deres monolayer endotelet og eosinophilic strukturer i det lumen i tillegg til farging med CD31. Mens kanaler ble observert i deler farget for ulike ECM proteiner, myoepithelial markør αSMA og H & E counterstaining, merket som cellulære komponenten av kanaler, opplisting av kanaler og tilknyttede grenene er oppnåelig med H & E farget vev deler alene. For mer detaljerte analyser av ductal morphogenesis eller analyser av tilstedeværelsen av pre neoplastic og/eller neoplastic lesjoner, kan en etterforsker ønske å utnytte AC confocal imaging for å evaluere live ex-vivo vev. I dette tilfellet kan den samme teknikken som hele kjertler er forbrukeravgift brukes med fiksering og vev behandlingstrinn eliminert.
Avgjørende skritt i denne protokollen inkludere bruk av kirurgiske mikro forstørrelsesglass som ikke bare aktivert nøyaktig identifikasjon av #4 abdominal kjertler, men i tillegg tillatt Disseksjon av kjertel fra overliggende dermis og underliggende peritoneum. Utelukkelse av betydelig subkutant vev og muskler redusert liggende under adipose-assosiert innblanding i flekker og histology. I tillegg for å bedre identifisere ECM uttrykk endringer i kjertel, fant vi det nyttig å fjerne 100-200 µm av vev blokken, som bidro til å eliminere gjenværende fettvev. Selv om hele melkekjertlene isolasjon gir informasjon på vev bredt endringer i stromal protein uttrykk og ductal morphogenesis, beskrevet teknikken er begrenset til analyse av føljetong deler fra fast, parafin innebygd vev. Å etablere grad som endringer i ductal forgrening har skjedd, hele mount imaging live, ex-vivo vev ville være nødvendig. Her, kan en etterforsker bruke grobunn-Lox utforme egendefinerte, betinget fluorescerende reporter conjugations å studere kjertel bestemt protein interaksjoner eller bruke en farge for å belyse ductal treet før imaging18. I tillegg ville videre analyse av proteiner interesse for helheten av kjertel nødvendiggjøre bruken av western blot eller massespektrometri eller andre høy gjennomstrømming teknikker som cross-linking immunoprecipitation (CLIP) eller chromatin immunoprecipitation (ChIP). I dette tilfellet ville hele kjertler være dissekert, inndelt i små biter og bearbeidet tilsvarende for de nedstrøms analysene. I tillegg kan en også bruke fluorescerende bildebehandling på vev deler. Denne teknikken ville være ideelt for å analysere flere proteiner og protein uttrykk co lokalisering i samme vev.
I sammendraget beskriver vi en teknikk som gir rask isolering av hele, intakt brystkjertlene og gir ytterligere detaljer om histologiske behandling og ductal analyser. Fremtidige anvendelser av denne teknikken kan undersøke ECM uttrykk og tilhørende endringer i ductal morfologi i svulst-bærende dyr. Videre kan analyser av kollagen orientering og fiber diameter, informasjon som kan være nyttig for å analysere vevs tetthet, også utføres på PSR farget deler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne April Wiles og Dr. Roger Broderson for hjelp med dyr obduksjon og kjertel isolasjon, henholdsvis. Finansiering for dette arbeidet ble støttet av Philadelphia College av osteopatisk medisin Centers for kroniske sykdommer av aldring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Light Microscope | Olympus | BX43 | |
| Microscope Camera | Olympus | DP73 | |
| Image Analysis Software | Olympus | cellSens Entry software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Surgical Micro Loupes | Rose Micro Solutions | Magnification at researcher's preference | |
| Mayo Scissors | Medline | DYND04035 | |
| Staining Rack | Fisher Scientific | 121 | |
| Staining Dish | Fisher Scientific | 112 | |
| Coplin Jars | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-550-15 | Size appropriate for tissue |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxylin | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Donkey Serum | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xylenes, Reagent Grade | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| Ethanol, 200 proof | Sigma-Aldrich | 792780 | suitable for molecular biology |
| Phosphate Buffered Saline, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Sodium Citrate | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Calcium Carbonate | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| Permanent Mounting Medium | Dako | S1964 | |
| Eukitt's Mounting Medium | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Fibronectin antibody | Abcam | AB23750 | |
| Tenascin-C antibody | Abcam | AB108930 | |
| Alpha Smooth Muscle Actin antibody | Abcam | AB124964 | |
| Dako Envision Dual Link System HRP | Dako | K4065 |
References
- Gao-Feng Xiong, R. X. Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression. J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13 (6), 227 (2011).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), 38 (2006).
- Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11 (2008).
- Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer. Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).
- Ioachim, E., et al. Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression. Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).
- Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
- Wang, J. P., Hielscher, A. Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting. J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).
- Qian, N., et al. Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients. Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).
- Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts. J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).
- Witkiewicz, A. K., et al. An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers. Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).
- Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).
- Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).
- Cannata, D., et al. Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation. Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).
- Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands. PLoS One. 12 (2), 0172067 (2017).
- Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation. Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).
- Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), (2013).
